GST标签蛋白纯化原理

在实验中有过被高等教育的教授骂过：别人让你吃屎，你就去吃屎么？或者稍微高级点的问候声：你有脑子么？

请稍微忽视当事人的失落、自尊心碎一地的感受，苦难不是一种财富，对苦难的反思才是一种财富。在实验时，或许着急按照步骤一步一步的做下来，而没有肯定的问自己：为什么要这样做？为什么要加这样的试剂？所以忽视了一些看似无关紧要的细节，坏结果便发生了。

回归原理部分，回归解决若干个为什么的问题，让我们的实验更加规范化。所以在接下来若干个专题阐述GST标签蛋白纯化的实验时，生物日记实验室部落首先搞清楚GST蛋白纯化的原理。

——当别人问为什么时，你知道为什么么

Just why? why? why?

GST标签蛋白纯化原理

重组标签蛋白纯化利用谷胱甘肽的结构能够和GST（谷胱甘肽S-转移酶）的结合位点互补，谷胱甘肽通过SH基团与琼脂糖介质上

的环氧乙烷基团通过环氧激活特异性偶联在琼脂糖介质上，带有GST的标签蛋白与琼脂糖介质上交联的谷胱甘肽配体互补性结合，这种可逆性的结合在温和、非变性的条件下通过加入还原型谷胱甘肽洗脱下来，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除，从而分离目的蛋白。如果需要将GST标签从目的蛋白上除去，则可将蛋白酶结合到柱子上，在标签蛋白与谷胱甘肽结合时使用蛋白酶位点特异性切割，也可在洗脱之后再酶切。另外，蛋白质的性质、载体的选择、宿主菌、表达和纯化的条件不同都能使最终标签蛋白的产量有很大的差别。

目的基因的表达在选择合适的表达载体时，应该注意载体的克隆位点、蛋白酶切位点、标签的位置、编码框等多种因素。

载体的选择

pGEX载体可用于构建可诱导、高水平表达目的基因片段，带有GST标签蛋白通过特定的目的基因或者基因片段插入到pGEX的多克隆位点，在pGEX载体上带有laclp基因，该基因表达产物作为抑制剂结合在tac启动子的操纵子区，而在乳糖类似物IPTG的诱导下，目的基因能够在tac启动子的调控下表达目的蛋白。

宿主菌的选择

在选择宿主菌时，大部分大肠杆菌都能够克隆和表达pGEX载体，如果要获得全长的标签蛋白，一些特殊的工程菌即蛋白酶Lon、OmpT等缺失的菌种能够保护目的蛋白不被宿主菌降解，获得全长的标签蛋白，并且产量也可能更高。

大肠杆菌BL21是获得GST标签蛋白比较合适的宿主菌种，该

菌种缺失Lon、OmpT两种蛋白酶，能够较高水平表达蛋白。将目的基因DNA片段的编码区插入到载体上，插入的DNA片段的编码区不能超过2 Kb，插入的末端序列和载体上的末端序列互补结合，目的基因片段在宿主细胞内表达，从多个克隆的宿主菌中筛选出最佳蛋白表达水平及相应生长条件，进行规模化培养。在筛选最佳宿主菌时，应考虑细菌克隆、细菌培养（培养基、含氧量、生长温度、密度、诱导条件等）等因素。

后记：

每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，我们是北京义翘神州生物，有专业的蛋白表达纯化团队，若有需要请联系我（xiaoli_li@https://www.360docs.net/doc/9414163197.html,）。