孕激素(DHP)调控鱼类雌性性别分化过程的机制研究

摘要 ............................................................................................................................... I Abstract ........................................................................................................................... III 第1章文献综述 (1)

1 脊椎动物的性别决定与分化机制 (1)

1.1哺乳动物的性别决定与分化机制 (1)

1.2鱼类的性别决定与分化机制 (2)

2 脊椎动物的配子发生过程 (4)

2.1 精子发生过程 (4)

2.2 卵子发生过程 (5)

3 硬骨鱼类配子成熟诱导激素的研究现状 (6)

3.1配子成熟诱导激素与配子成熟 (6)

3.2配子成熟诱导激素与配子发生过程 (6)

4 硬骨鱼类配子成熟激素受体的研究现状 (7)

4.1 膜受体mPRs的研究现状 (7)

4.2 核受体Pgr的研究现状 (8)

5 关键科学问题的提出和研究目的及意义 (9)

第2章尼罗罗非鱼孕激素受体拮抗剂RU486处理及DHP/E2回救实验 (11)

1引言 (11)

2 材料、仪器和方法 (11)

2.1 实验动物 (11)

2.1.1 建立尼罗罗非鱼单性鱼苗体系 (11)

2.1.2 药物处理的方式及剂量 (11)

2.2 实验仪器和试剂 (12)

2.3 实验方法 (12)

3 实验结果 (17)

3.1 RU486持续处理对雌鱼性腺发育的影响 (17)

3.1.1 RU486持续处理对卵巢组织结构的影响 (17)

3.1.2 RU486持续处理对体细胞和生殖细胞相关基因表达的影响 (18)

3.1.3 RU486持续处理对血清中雌激素的影响 (21)

3.1.4 RU486持续处理后性腺的表型统计 (22)

西南大学硕士学位论文

3.2 RU486处理之后，正常饲养对雌鱼性腺发育的影响 (23)

3.3 RU486+DHP/E2回救对雌鱼性腺发育的影响 (25)

3.3.1 RU486+DHP/E2回救对体细胞和生殖细胞相关基因表达的影响 (25)

3.3.2 RU486+DHP/E2回救对血清中雌激素的影响 (26)

4 结果分析与讨论 (27)

第3章尼罗罗非鱼核受体pgr功能的初步研究 (31)

1引言 (31)

2材料、仪器与方法 (31)

2.1 实验动物 (31)

2.2 实验仪器和试剂 (31)

2.3 实验方法 (31)

3 实验结果 (36)

3.1 CRISPR/Cas9成功敲除pgr基因 (36)

3.2 pgr纯合敲除体系的建立 (37)

3.3 pgr纯合突变的表型分析 (37)

4 结果分析与讨论 (38)

结论与展望 (41)

参考文献 (43)

致谢 (49)

在读期间发表论文情况 (51)

在读期间参与科研情况 (53)

摘要

孕激素（DHP）调控鱼类雌性性别分化过程

的机制研究

动物学硕士研究生：罗凤

指导教师：周林燕教授

摘要

鱼类在脊椎动物系统演化过程中起着承前启后的地位。因此，对鱼类性别决定与分化机制的研究，是整个脊椎动物性别决定与分化的重要组成部分。与哺乳动物、鸟类等高等脊椎动物相比，鱼类性别决定与分化机制具有原始性、易变性和多样性。它仍然以遗传基因为性别决定和分化的基础，同时也会受到某些外界环境因素的影响，故鱼类的性别决定与分化过程益显复杂。孕激素（DHP）是包括尼罗罗非鱼在类的大多数硬骨鱼的配子成熟激素，它作为一种主要的性类固醇激素，仅在配子成熟时期的体细胞中合成。主要是促进配子的最终成熟以及排精（卵）过程。通过离体和在体研究，已经证明了DHP信号通路在鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋鲑鱼(Salmon salar)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)等鱼类的精子发生过程中发挥重要作用。但是到目前为止，DHP在硬骨鱼类雌性性别分化过程中的作用还鲜为人知。因此，本实验以尼罗罗非鱼为实验材料，通过CRISPR/Cas9技术敲除核受体pgr基因以及用孕激素受体拮抗剂RU486阻断DHP信号通路等实验，深入研究DHP对雌性性别分化过程的调控机制，最终加深我们对DHP在尼罗罗非鱼甚至硬骨鱼类早期性别分化过程中的作用认识。本论文的主要研究结果如下：

（1）利用鱼类孕激素（DHP）受体的拮抗剂RU486从孵化后5天（days after hatching, dah）开始处理基因型为XX的雌性尼罗罗非鱼，分别在20、40、90、120dah取材检测。与正常的雌雄对照相比，RU486的持续处理不仅阻遏了卵子发生过程，还降低性腺中雌性通路基因的表达和血清中雌激素水平。相反，RU486处理激活了雄性通路基因的表达。这暗示：鱼类孕激素（DHP）直接或间接通过雌激素参与生殖细胞的减数分裂起始以及性别分化过程。

（2）运用RU486从5dah开始处理雌性尼罗罗非鱼，分别到20、40、90dah 停止处理，接着正常饲养到120dah取材检测。令人惊奇的是，此时的性腺发育成具有生理功能的精巢。我们推测性逆转的原因可能是由于体细胞的雄性化以及内源性DHP的恢复所致。