基因克隆的几种常见方法

基因克隆得几种常见方法

基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。

1 根据已知序列克隆基因

对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为;

（2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。

根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。

另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。

２根据已知探针克隆基因

这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。

但在探针杂交后,要注意高强度（high striｎgent）漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆得特异性,同时节省时间。

3 未知序列得基因打靶

根据已知序列进行基因克隆，多数就是重复别人得工作,或者就是在别人工作得基础上继续自己得工作,因而不存在新基因得克隆过程。对未知序列得基因克隆才就是真正得创造性研究。

3．1 随机引物法克隆未知序列基因［1］随机引物ＰCR(arbitrａrilｙ primed ＰＣR,AP－PCR)首先被用于基因组DNA或ＲNA得指纹图谱(finｇer pｒｉnt)分析，后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关得基因或mＲＮA。该方法得理论依据就是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组ＤＮA 很可能发生变化或出现不同基因得激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫得发育过程中,不同发育阶段得虫体所表达得基因很可能不同,如将不同发育阶段得虫体ｍRＮA提取出来，用单一引物（随机引物,其长度不超过16 nt）对不同时期得虫体ｍRNA进行扩增比较，即可找出导致表型变异得遗传学依据。这种方法就是一种比较PCＲ,它要求至少有２种来自不同表型但又很类似得基因组DNA或mRNA。ＡＰ－ＰＣＲ扩增后得产物必须99%就是一致得,只有个别特异得产物出现在特异得表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远得生物个体之间没有比较意义、

应用AＰ-PCＲ法进行2种或多种表型特征类似得个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ）得扩增产物AP-ＰＣR得操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低得退火温度（anneａlｉnｇtemperature)进行扩增,后20个循环则采用较高得退火温度扩增。ＡP-ＰCR产物多较短,一般需高浓度得琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增得模板为mＲNA,通过比较扩增产物得强度，可以得知该基因在２种生物或同一生物不同发育阶段得表达强度。另外，在AP－PCR检测到与某一表型相关得基因或基因产物(mRNA）以后,下一步工作就就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为1)AＰ－PCR产物得提取、克隆及序列测定。首先将AP-PＣＲ检测到得特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜得载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反得引物(P-1,P-2,见图2)。引物长度多在20 nt以上;退火温度在60℃以上;(2）将基因组ＤNA做适当酶切，然后在其两端连接上相同得接头(这种接头可从生物制品公司购买）。根据接头得序列扩增。

3、2 Differentiａl display PＣR(DD-PCR)DD-PCR就是在AP-PCR基础上发明得一种RT－ PCＲ方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上得差异分析。其基本原理就是:所有真核生物得成熟mRNA都含有不同长度得polｙ（Ａ)尾部序列,根据poly (A)内部得2个核苷酸排列得不同,可以将所有得mRN Ａ分子分为12类(见图3)。根据这12种mRNA序列可合成12种相应得反转录引物,即Ｍ’Ｎ’TＴTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成1２种cDNA(于12个试管内),然后再用随机引物，以这12种 cDNＡ分别做模板进行PCR扩增(见图1与图4),那么与表型相关得mRNA就很容易被发现并克隆

出来。但不论AＰ－ＰCR还就是DD-PＣR,都适用于2种种源近似生物或不同发育阶段得同一个体之间得比较。因而，其PＣＲ得模板必须就是来自２个生物或同一生物得不同发育阶段得mRNA。DD-ＰＣR得优点就是快速、方便,可以检测表达量极低得mRNA,但其技术条件要求较高，所扩增得mRNＡ得质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因得克隆及比较研究。

3、３Ｒepresｅntatｉve ｄiｆｆerence ａnalysis PＣR (RDA-PCR)[3～５]这就是一种差减杂交(ｓubtractivｅ hybrｉｄizａtio-n）与ＰCＲ相结合得技术,其整个操作程序完全不同于AＰ-PＣＲ与ＤD-PCR。前2种方法就是将两模板DＮＡ或ｃDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物得差异,分离与克隆特异扩增带,其缺点就是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩增后才能克隆。RDA-PＣR只扩增区别于某一表型得特异基因,因而更便于扩增产物得克隆与分析(见图5)。其基本原理就是：用一个在种源上相近得基因组将靶基因组中所有共同得基因掩盖起来,而只暴露出特异得基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为：(1）用同一限制性内切酶(一般用Bam ＨI,Ｂgl II或Hind III)同时处理靶基因组与掩盖基因组ＤNA，其中掩盖基因组DNA得量至少要2倍于靶基因组DＮA得量;(2)在经酶切得靶基因组片段得两端加上连接头,其序列与酶切产生得粘性末端得序列相对应;(3)将2个基因组得DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组ＤNA得量远大于靶基因组DN Ａ量,那么与掩盖基因组ＤNＡ相同得靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异得靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因得影响;(4)用Taq ＤＮA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应得引物,经过30个左右得PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同得特异基因扩增出来。这种方法得起始操作程序较复杂,各反应步骤要求准确无误,但其检测得准确度较高。对于基因组内得点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。

４用特异抗体克隆基因?用抗体克隆基因得关键就是抗体得特异性。一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体得方法主要有:(１)制备识别功能抗原得单克隆抗体;（２)将ＳDＳ－PAＧE分离得蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用Westeｒn-blot法将识别某一蛋白质带得抗体从膜上洗脱下来。在获取理想得抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 文库,从文库中将编码某一特异蛋白质得基因克隆出来。?５特异基因得功能克隆

它就是借助于基因产物即基因所编码得蛋白质得功能将该基因克隆出来得一种方法。基因得功能克隆主要有2种:一就是pｈａge diｓpｌay［6，7］,另一就是 pｅpｔｉｄe disｐlａy。后者得原理与前者基本相同。目前以pｈaｇe disp ｌａy得应用最为广泛,本文只对这一方法加以介绍。

任何一种病原体,包括细菌、病毒与寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身得蛋白质成分(lｉgａnd)需要首先与宿主细胞上得受体(reｃeptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上得Hepaｒan sｕｌfaｔe受体,并与其相互作用后才能侵入细胞内;巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主得补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用

成分得特性与功能分析,就是制订免疫预防措施及制备阻断药物得前提。pｈag ｅdiｓplaｙ法就是克隆病原体ligａnd得一种最为理想得手段。

Phage diｓpｌay得基本操作过程为：(１)提取某一病原体基因组DNＡ,用超声波将DＮＡ切割成５00～１ 5０0得片段；(2）将片段末端用Ｔ4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(phagemid）连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体(hel ｐer pｈａｇe）同时转染大肠杆菌。ｐｈａｇemｉd在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入得外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒得表面;(3)将特定得受体固定于载体上(多为ＥLISA板)，方法同一般得ＥLISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后，加入平板孔内，感作一段时间,用 PBS 等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白得噬菌体才能与包被在平板上得受体相互结合,那些表达非相关蛋白得噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱； (4)用高强度ＮaＣl液将结合在受体上得噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌，便可将编码特异功能蛋白质得基因克隆。

一个真核生物至少含有10万个不同得基因,其中只有10%～15%得基因在不同得发育时期表达，且不同得基因表达得强度相差甚远。在致病生物中,致病力强得生物,其致病因子(往往就是１种或几种功能蛋白或酶）得表达量往往多于致病力弱得生物。从基因组中将人们感兴趣得基因或其转录产物扩增并克隆出来,就是进一步对所编码蛋白质作功能分析得关键。本文介绍得几种基因克隆得方法就是近几年应用比较广泛得方法。在具体实验中选择哪一种方法，还要根据研究者所要克隆得基因及其所在得基因组与对该基因得研究背景来决定。