果蝇总RNA和总蛋白的提取及分析
果蝇总RNA和总蛋白的提取及分析
摘要：本次实验主要分为两大部分。第一部分是以果蝇成体为材料，通过Trizol试剂直接从果蝇细胞或组织中提取总RNA，然后进行反转录制备cDNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳来测定总RNA和cDNA的纯度，进而来进行分析。第二部分仍以果蝇成体为材料（有的小组是果蝇幼体），提取果蝇总蛋白，通过SDS-PAGE检测果蝇总蛋白表达，最后对果蝇的蛋白含量进行了分析。
关键字：RT-PCR；cDNA；琼脂糖凝胶电泳；SDS-PAGE
1 材料及仪器
1.1 实验材料
黑腹果蝇成虫2-3d龄，约6只，雌雄均等。
果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂
O，琼 Trizol裂解液（50mg/ml），氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNase free H
2
O，10×PCR Buffer （含Mg2+），dNTP 脂糖，TAE电泳缓冲液，DNA marker，dd H
2
（10 mM each），引物：rp49F、rp49R；CG8189F、CG8189R， Taq DNA polymerase （2U/μl），TBS缓冲液（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl, pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液
1.2.2 器材
1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，200μl及1ml微量移液器及吸头，天平，量筒，锥形瓶，微波炉，制胶板，电泳槽，电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪，水平摇床等。
2 实验方法及步骤
2.1 果蝇总RNA的提取、反转录过程及RT-PCR
2.1.1 果蝇总RNA的提取
取果蝇成体于1.5ml离心管中，加1ml Trizol（50mg/ml）裂解液后，用匀浆棒匀浆，室温放置5min，使其充分裂解，之后，在4℃条件下12000g离心5min。转移上清至一新离心管中，加入氯仿（200μl氯仿/ml Trizol），振荡混匀，室温放置2min。在4℃条件下，12000g离心15min。取出离心管，小心转移上层水相至新离心管中。加入异丙醇（0.5ml异丙醇/ml Trizol），充分缓慢混匀，室温放置5min。在4℃条件下12000g，离心10min。取出离心管，弃上清，加入1ml 75%乙醇，悬起管底沉淀，继续在4℃条件下，7500g离心5min。取出离心管，弃上清，室温干燥RNA沉淀。加入50μl RNase free H2O溶解，备用。
2.1.2反转录过程
以RNA为模板，利用Promega公司提供反转录试剂盒合成了第一链cDNA；
（1）取一只DEPC处理过的小EP离心管，向其中加入以下混合液，其体系如下：
Total RNA 1 μl
O 4 μl
RNase-free H
2
Oligo-anchor R 1 μl
（2）将混合液充分混匀并瞬时离心，置于70 ?C孵育10 min后，立马在冰上冷却2 min，再次瞬时离心使得混合液集于管底；
（3）冰上继续向管中加入 :
5×Reaction Buffer 5μl
Ribonuclease inhibitor（20 U/μL） 1.25 μl
dNTP Mix（10mM） 1.25 μl
M-MLV Reverse Transcriptase 1μl
RNase-free H
O 10.5μl
2
（4）将总反应液轻轻混匀瞬时离心，42 ?C孵育 60 min;
O水稀释适当倍数后作为PCR模板使用。
（5）最终转录产物用ddH
2
2.1.3 RT-PCR
在PCR管中加入如下反应体系：
dd H
O 19.5μl
2
10×PCR Buffer（含Mg2+） 2.5μl
dNTP（10 mM each）0.5μl
DNA template（cDNA，1：10） 1.0μl
Taq DNA polymerase（2U/μl）0.5μl
上下游引物各0.5μl
PCR程序设定为：94℃ 2 min
变性94℃ 15 s
退火55℃ 15 s
延伸72℃ 30 s
72℃ 5 min
进行30个循环
通过10%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA浓度。
2.2 果蝇成虫总蛋白的提取与SDS-PAGE检测
取果蝇成虫约5只，加入200μl TBS缓冲液在匀浆器中匀浆，将匀浆液于4摄氏度条件下1000rpm离心十分钟，取出离心管，吸取上清液16μl，加入4μl 蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟。通过SDS-PAGE法检测提取的总蛋白。（1）
3 实验结果
3.1 果蝇总RNA检测
1 2 3 4 5 6 7
如上图所示，第2条带是我们组的提取出来的总RNA含量，其中第一条带是
Marker。从条带的亮度可以看出我们组提取的rRNA5s不是很明显，而28s较亮一些但是不清晰，28s和18s没有完全分开。
3.2 cDNA RT-PCR结果检测
本实验室只有一组同学得到比较清晰明亮的条带。
3.3 果蝇成虫总蛋白SDS-PAGE检测
1 2 3 4 5 6 7
第一条泳道是marker，其中第4条和第7条泳道提取的是果蝇幼虫的蛋白质。我们组是第6条泳道。从条带中可以明显的看出果蝇果蝇成虫和幼虫的蛋白质存在这明显的差别：第4和第7泳道的上方存在着其他泳道都没有的条带。
4 实验结果分析与讨论
4.1 对果蝇总RNA检测的分析
相对比课件上的电泳图谱发现，果蝇总RNA应该有三条明亮的条带（如右图所示），因为真核生物中含有5S、5.8S、18S、28S沉降系数的RNA。我们组所做的实验中只能看到两条条带。5s带几乎没
有。造成的原因可能是果蝇总RNA含量提
取不足。在提取果蝇总RNA的过程中，将
果蝇成体放入离心管中时，如遇本组组员
的疏忽大意到只有成体果蝇飞出，最终造
成果蝇总RNA含量提取不足。28s和18s
条带不能完全分清楚，可能是因为RNA被
降解的缘故，也有可能是DNA的污染的原
因。在实验室提取的总RNA在空气中暴露的时间太久导致部分RNA被降解。因为RNA酶很稳定，广泛存在于人的皮肤上、唾液中，所以要求在提取RNA时必须带手套，最好戴口罩，穿实验服。
4.2 对cDNA RT-PCR结果检测的分析
在实验前，由其他小组的做的实验所得到的结果来看发现，没有得到预期的条带，所以我们组推测可能是与Taq酶的活性有关。Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。多数酶在高温时即变性失活，然而Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用。但是Taq酶的保真度不高，因为这种酶的DNA聚合作用依赖于3'-5’校正。所以可能是有些其他原因造成了Taq酶的活性降低，而使PCR失败。为了验证我们的猜测，我们实验室让两个小组使用一种新酶进行实验，其他小组仍然使用Taq酶进行实验。最后得出的实验结果来看，只有使用新酶的两个小组得到了PCR产物，其他小组没有。所以推测是正确的，由于Taq酶的活性降低导致了实验的失败。
4.3 对果蝇总蛋白SDS-PAGE检测
从蛋白质的SDS-PAGE图谱可以看出，果蝇蛋白都有表达。但是条带的深浅不同，
是因为不同蛋白质在果蝇体内的表达导致的。基本上每组都做出了蛋白质的条带，中最需要分析的应该是果蝇的成体和幼体蛋白质的差异。从图谱中可以明显看出来，第4条和第7条带和其它几组的条带不一样，这两条带的上方有表达的蛋白质，其它带没有。所以成体与幼体的蛋白表达是有较为显著的差异的，有些蛋白质仅在成体中表达，有些蛋白则随着个体成熟逐渐不表达，推测原因可能是果蝇在生长发育过程中为了行使特定的功能，适应成体和幼体不同的生活环境，来使体内的某些基因在特定时期表达蛋白质。
5 体会
经过此次实验，加深了对果蝇总RNA和总蛋白质的提取方法，以及他们检测方法等知识的印象，为以后在实验室工作学习储备了经验，同时加强了与组员间的沟通和交流，是自己有所提高。本次实验也发现了诸多的错误和问题，希望在以后的实验室工作和学习中能够避免和借鉴，进一步的提升自己的科研能力。