质谱讲义(AB)

质谱(MS) mass spectrometry

质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，并按质荷比（m/z）分离的分析技术;质谱仪是实现上述分离分析技术,从而测定物质的质量与含量及其结构的仪器。质谱分析法是一种快速,有效的分析方法,利用质谱仪可进行同位素分析,化合物分析,气体成分分析以及金属和非金属固体样品的超纯痕量分析。在有机混合物的分析研究中证明了质谱分析法比化学分析法和光学分析法具有更加卓越的优越性，其中有机化合物质谱分析在质谱学中占最大的比重,全世界几乎有3/4仪器从事有机分析, 现在的有机质谱法，不仅可以进行小分子的分析，而且可以直接分析糖，核酸，蛋白质等生物大分子，在生物化学和生物医学上的研究成为当前的热点，生物质谱学的时代已经到来，当代研究有机化合物已经离不开质谱仪。

一.仪器概述

1.基本结构

质谱仪由以下几部分组成

供电系统

┏━━━━━┳━━━━━━╋━━━━━━━┳━━━━━━┓

进样系统离子源质量分析器检测接收器数据系统

┗━━━━━┻━━┳━━━┻━━━━━━━┛

真空系统

(1)进样系统:把分析样品导入离子源的装置,包括:直接进样,GC,LC及接口,加热进样,参考物进样等。

(2)离子源:使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,有机常用的有如下几种,其中EI,FAB最常用。

EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离——最经典常规的方式,其他均属软电离，EI使用面广，峰重现性好，碎片离子多。缺点：不适合极性大、热不稳定性化合物，且可测定分子量有限，一般≤1,000。

CI(Chemical Ionization):化学电离——核心是质子转移，与EI相比，在EI法中不易产生分子离子的化合物，在CI 中易形成较高丰度的[M+H]+或[M-H]+等‘准’分子离子。得到碎片少，谱图简单，但结构信息少一些。与EI法同样，样品需要汽化，对难挥发性的化合物不太适合。

原理R + e-→R+·+ 2e-（电子电离）反应气为含H的

R为反应气体分子R+·+ R →RH+ + (R-H)·分子,例如异丁

M为样品分子RH+ + M →R + (M+H)+ (质子转移）烷,甲烷,氨气,

R浓度＞＞M浓度R+·+ M →R + M+·（电荷交换）甲醇气等

R+·+ M →(R+M)+·（加合离子）

FD(Field Desorption):场解吸——大部分只有一根峰, 适用于难挥发极性化合物，例如糖,应用较困难，目前基本被FAB取代。

FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击——利用氩,氙,80年代初发明,或者铯离子枪(LSIMS,液体二次离子质谱)，高速中性原子或离子对溶解在基质中的样品溶液进行轰击，在产生“爆发性”汽化的同时，发生离子-分子反应，从而引发质子转移，最终实现样品离子化。适用于热不稳定以及极性化合物等。FAB法的关键之一是，选择适当的（基质）底物，从而可以进行从较低极性到高极性的范围较广的有机化合物测定，是目前应用比较广的电离技术。不但得到分子量还能提供大量碎片信息。产生的谱介于EI与ESI之间,接近硬电离技术。生成的准分子离子，一般常见[M+H]+和[M+底物] +。另外：还有根据底物脱氢以及分解反应产生的[M-H]_

容易提供电子的芳烃化合物产生M+?

甾类化合物、氨基霉素等还产生[M+NH4]+

糖甙、聚醚等一般可（产生）观察到[M+Na]+

由底物与粒子轰击（碰撞）诱导发生还原反应来产生[M+nH]+ (n>1),二量体（双分子）[M+H+M]+及

[M+H+B]+等。

因此，进行谱图解析时，要考虑底物和化合物的性质，盐类的混入等进行综合判断。

ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离——与LC,毛细管电泳联用最好，亦可直接进样,属最软的电离方式，混合物直接进样可得到各组分的分子量。

APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离——同上，更适宜做小分子。

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸基质辅助激光解吸电离——是一种用于大分子离子化方法，利用对使用的激光波长范围具有吸收并能提供质子的基质（一般常用小分子液体或结晶化合物），将样品与

其混合溶解并形成混合体，在真空下用激光照射该混合体，基体吸收激光能量，并传递给样品，从而使样品解吸电离。MALDI的特点是准分子离子峰很强。通常将MALDI用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合分析蛋白质和DNA 等大分子。

(3)质量分析器:是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

(4)检测接收器:接收离子束流的装置,有:二次电子倍增器

光电倍增管

微通道板

(5)数据系统:将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果。包括外围部分.例如终端显示器,打印机等。现代计算机接口,还可反过来控制质谱仪各部分工作。

(6)真空系统:由机械真空泵(前极低真空泵),扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组,抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下,离子才能从离子源到达接收器,真空度不够则灵敏度低。

(7)供电系统:包括整个仪器各部分的电器控制部件，从几伏低压到几千伏高压。

2.分类:

常见下列几种:

双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector)

四极质谱仪(Q)

离子阱质谱仪（TRAP）

飞行时间质谱仪(TOF)

付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS)

┏混合型如四极+TOF,磁式+TRAP等

串列式多级质谱仪(MS/MS) ━┫三重四极

┗TOF+TOF

3.分析原理:

磁质谱基本公式：M/Z=H2R2/2V

M:质量Z:电荷V:加速电压R:磁场半径H:磁场强度

磁质谱经典,可高分辨,质量范围相对宽;缺点是体积大,造价高,现在越来越少。

四极分析器quadrupole是一种被广泛使用的质谱仪分析器。由两组对称的电极组成。电极上加有直流电压和射频电压（±(U+Vcosωt)）。相对的两个电极电压相同，相邻的两个电极上电压大小相等，极性相反。带电粒子射入高频电场中，在场半径限定的空间内振荡。在一定的电压和频率下，只有一种质荷比的离子可以通过四极杆达到检测器，其余离子则因振幅不断增大，撞在电极上而被“过滤”掉，因此四极分析器又叫四极滤质器。利用电压或频率扫描，可以检测不同质荷比的离子。优点是扫描速度快,比磁式质谱价格便宜,体积小,常作为台式进入常规实验室,缺点是质量范围及分辨率有限。

飞行时间质谱仪:利用相同能量的带电粒子,由于质量的差异而具有不同速度的原理,不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离到达接收器。

公式M/Z=2E/v2v=d/t 代入M/Z=Kt2

E:离子动能v:离子速度d:飞行距离t:飞行时间K:常数=2E/d2

优点:扫描速度快,灵敏度高,不受质量范围限制以及结构简单,造价低廉等.

FT-MS:在射频电场和正交横磁场作用下,离子作螺旋回转运动,回旋半径越转越大,当离子回旋运动的频率与补电场射频频率相等时,产生回旋共振现象,测量产生回旋共振的离子流强度,经付立叶变换计算,最后得到质谱图。是较新的技术,对于高质量数,高分辨率及多重离子分析,很有前途,但使用超导磁铁需要液氦，不能接GC，动态范围稍窄，目前还不太作为常规仪器使用。

离子阱Ion trap 通常由一个双曲面截面的环形电极和上下一对双曲面端电极构成。从离子源产生的离子进入离子阱内后，在一定的电压和频率下，所有离子均被阱集。改变射频电压，可使感兴趣的离子处于不稳定状态，运动幅度增大而被抛出阱外被接收、检测。用离子阱作为质量分析器，不但可以分析离子源产生的的离子，而且可以把离子阱当成碰撞室，使阱内的离子碰撞活化解离，分析其碎片离子，得到子离子谱。离子阱不但体积很小，而且具有多级质谱的功能，即做到MS n，但动态范围窄,低质量区1/3缺失,不太适合混合物定量.

多级质谱联用仪

现在，几乎所有的商品质谱仪上均配有GC-MS，但对难挥发、强极性和大分子量混合物，GC-MS无能为力，为

了弥补GC-MS的不足，经过20多年的探索，通过开发上述几种软电离技术，特别是ESI和APCI等，解决了LC 与离子源接口问题（1987年完成），从而实现了LC-MS联用，是分析化学的一次重大进展，而串联质谱仪更具有许多优点。

串联质谱仪（MS/MS或Tamdem）:

离子源—→第一分析器—→碰撞室—→第二分析室—→接收器

MS1 MS2

进行MS/MS的仪器从原理上可分为两类。第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。即前面列出的串列式多级质谱仪。第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。这类仪器通过喷射出其它离子而对特定的离子进行选择。在一个选择时间段这些被选择的离子被激活，发生裂解，从而在质谱图中观测到碎片离子。这一个过程可以反复观测几代碎片的碎片。时间型质谱便于进行多级子离子实验，但另一方面不能进行母离子扫描或中性丢失。

一般采用ESI、CI或FAB等软离子化方法,以利于多产生分子离子,通过MS1的离子源使样品离子化后，混和离子通过第一分析器,可选择一定质量的离子作为母体离子,进入碰撞室,室内充有靶子反应气体(碰撞气体：He、Ar、Xe、CH4等)对所选离子进行碰撞，发生离子—分子碰撞反应，从而产生‘子离子’，再经MS2的分析器及接受器得到子离子（扫描）质谱（product ion spectrun）。一般称做MS/MS-CID谱，或者简称为CID(collision-induced dissociation) 谱,碰撞诱导裂解谱，及MS/MS谱。另外，也有母找子离子的MS/MS谱，（MS/MS spreursor ion spectrum）研究MS/MS 谱（一般指子离子质谱，与在源内裂解产生的正常碎片质谱类似，但有区别，现不能检索），可以了解到被分析样品的混合物性质和成分，对一些混合物（目前，多用最软电离的ESI或APCI的MS/MS。不必进行色谱分离可直接分析，与色谱法相比，有很快的响应速度，省时省样品省费用，具有高灵敏度和高效率的优点。另外一个特点是通过子→母及母→子MS/MS谱可以掌握一定的结构信息,做为目前有力的结构解析手段。因此，现在利用串联质谱仪进行药物研究越来越得到重视，特别是在药物代谢以及混合物的微量成分分析和结构测定等方面正在起到越来越重要的作用。比较常用的三级四极型MS/MS，联用LC-MS/MS使用方便，操作简单，适合于定量等常规，大型的MS/MS 更适合结构解析。

4.仪器性能指标

(1)质量范围:表明一台仪器所允许测量的质荷比,从最小到最大值的变化范围.一般最小为2,实际10以下已经无用.最大可达数万,利用多电荷离子,实际能达上百万。

(2)分辨率(R):是判断质谱仪的一个重要指标,低分辨仪器一般只能测出整数分子量.高分辨率仪器可测出分子量小数点后第四位,因此可算出分子式,不需要进行元素分析, 更精确。

R=M/ΔM M为相邻两峰之一的质量数.ΔM为差.例如:500与501两个峰刚好分开.则R=500/1=500.若R=50000 则可区别开500与500.01。对于四极杆仪器,通常做到单位分辨,高低质量区R数值不同.

(3)灵敏度:有多种定义方法,粗略地说是表示所能检查出的最小量,一般可达到10-9-10-12克甚至更低,实际还应看信噪比。

二.质谱的表示法及解析

谱图法：横坐标代表质量数,纵坐标代表峰强度,是该质量离子的多寡的表示.常用,直观,但不太细致.还分为连续谱和棒状图两种，一般EI棒图多,ESI连续谱多。

列表法:质量数,相对丰度......

高分辨表示法:列表元素组成

实测质量理论质量 C H O N···误差(PPM) 相对丰度(%)

322.1094 322.1079 19 16 4 1 -4.6 100

322.1106 22 14 1 2 3.7

309.1358 309.1365 19 19 3 1 2.2 80

···

1.几个术语:

质荷比M/Z:一般Z为1,故M/Z也就认为是离子的质量数,蛋白质等易带多电荷,Z>1。在质谱中不能用平均分子量计算离子的化学组成,例如:不能用氯的平均分子量35.5,而用35和37。同理,溴也是如此,79和81,无80。在质谱图中,根本不会出现35.5的峰。一氯苯的分子峰应是112和114而不是113。

相对丰度:以质谱中最强峰为100%(称基峰),其他碎片峰与之相比的百分数。

总离子流(TIC):即一次扫描得到的所有离子强度之和,若某一质谱图总离子流很低,说明电离不充分,不能做为一张标准质谱图。

动态范围:即最强峰与最弱峰高之比.早期仪器窄,现代计算机接收宽。若太窄,会造成有多个强峰出头,都成为基峰,

而该要的(常为分子峰)却记录不出来。这样的图也是不标准的,检索、解析起来都很困难。

本底:未进样时,扫描得到的质谱图,空气成分,仪器泵油,FAB 底物，ESI 缓冲液，色谱联用柱流失及吸附在离子源中其他样品。

因有以上三点,故要控制进样量及放大器放大倍数,还要扣除本底,以得到一张标准的质谱图。

质量色谱图/Mass chromatogram 和 质量色谱法/Mass chromatography (MC) 又叫提取离子色谱图/ extract ion chromatography ：是质谱法处理数据的一种方式。在GC/MS 或LC/MS 中，选定一定的质量扫描范围，按一定的时间间隔测定质谱数据并将其保存在计算机中。然后可以用各种办法调出质谱数据。如果要观察特定质量与时间的关系，可以指定这个质量，计算机将以指定离子的强度为纵坐标，以时间作为横坐标，表示质量与时间的关系。这种方法叫做质量色谱法。得到的图叫做质量色谱图或提取离子色谱图。

2.离子的种类

(1)分子离子M +·，也有用M +.的。中性分子丢失一个电子时,就显示一个正电荷,故用M +·

。

在EI 中,继续生成碎片离子,在CI,FD,FAB 等电离方法中,往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+15,M+43,M+23,M+39,M+92......称准分子离子,解析中准分子离子与分子离子有同样重要的作用。

(2)碎片离子:电离后,有过剩内能的分子离子,会以多种方式裂解,生成碎片离子,其本身还会进一步裂解生成质量更小的碎片离子,此外,还会生成重排离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。如果将质谱中的主要碎片识别出来,则能帮助判断该分子的结构。 (3)多电荷离子

指带有2个或更多电荷的离子,有机小分子质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.对于蛋白质等生物大分子,采用电喷雾的离子化技术,可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。 (4)同位素离子

各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便,在前面M/Z 提到过,如氯35和37,后面还要讲,还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等。 (6)负离子

通常碱性化合物适合正离子,酸性化合物适合负离子,某些化合物负离子谱灵敏度很高,可提供很有用的信息。 3.由质谱推断化合物结构

质谱是一种语言,但需要翻译.与其他类型谱图比较,学习如何由质谱图识别一个简单分子要容易得多。质谱图直接给出分子及其碎片的质量,因此化学家不需要学习任何新的知识。与解数学难题相似,例如水的质谱图,一看便知。但

并不是随意拼凑质量数,是有规律可循的。

如何看质谱图 同位素峰C 13

下面四张质谱图分别为EI,CI,FAB,ESI 源得到

的结果,可看出差异很大.

18

M /Z M /Z

50

10050

100

(1)确定分子离子,即确定分子量

氮规则:含偶数个氮原子的奇电子离子,其质量数是偶数,含奇数个氮原子的奇电子离子,其质量数是奇数。 与高质量碎片离子有合理的质量差,凡质量差在3～14和21,25之间均不可能,则说明是碎片或杂质。 (2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式

低分辨,利用元素的同位素丰度,元素按同位素丰度可分三大类:A;A+1;A+2;A+2元素是容易识别的,参见元素的同位素丰度表。计算时注意:

a.用最高质量数,如果太弱则用强的不受其他峰干扰的碎片峰。

b.元素原子个数多于1的,由同位素丰度计算出各种元素的原子数,例如(图)

二Cl

一Cl

一Br

二Br

c.若同时含A+1和A+2元素,则A+2元素的A-1峰会对A+1元素峰有贡献,应扣除。

d.一定质量范围内,元素组成是有限的,不是任意组合的。例如CH 之比,最高C n H 2n+2最低通常1/2n,除甲酸CH 2O 2草酸C 2H 2O 4极个别小分子,O 一般与C 数相等,N 规则:M 若奇数,必含N 且含奇数个N,M 若偶数,不含N 或含偶数个N,18不可能是CH 6。

如果有了高分辨数据,更方便,但也会有误差,通常允许误差在10ppm,故前边的规则也是有用的。

The Language of M S

?R equirem ents for Translation

?B asic V ocabulary of m ass spectrom etry

?N um bers, Intensities, C om positions ?B asic R ule B ook for gram m ar and punctuation

?C hem istry

?P eriodic T able of E lem ents

?C om pound S tructures -valence rules

m /z

365

376

386

378

100

7550

25

% Intensity

→C 21H 23N O 2FC l →

(3)峰强度与

结构的关系 丰度大反映离子结构稳定,在元素周期表中自上而下,自右至左,杂原子外层未成键电子越易被电离,容纳正电荷能力越强,S>N>O,n>π>σ,含支链的地方易断,这同有机化学基本一致,总是在分子最薄弱的地方断裂。 (5)各类有机物的裂解方式

(略)

不同类型有机物有不同的裂解方式,相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异,需要经验记忆,很有用。这里的裂解规律，均是EI 谱经验总结，质谱解析的一般步骤，也由EI 谱归纳而来，并非绝对。

4.质谱解析的一般步骤(适于低分辨小分子谱图,若已经高分辨得到元素组成更好)

(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当,是哪种离子化法的谱图，是否有基质的峰存在，有否二聚体峰等。样品编号避免1,2,3等过于简单,最好用英文字母和阿拉伯数字组合,以防混淆出错。

(2)综合样品其他知识,例如熔点,沸点,溶解性等理化性质,样品来源,光谱,波谱数据等。多数情况下可给出明确的指导方向。所以送样时要将已知数据写清。 (3) 尽可能判断出分子离子。

(4) 假设和排列可能的结构归属:

高质量离子所显示的,在裂解中失去的中性碎片,如M-1,M-15,M-18,M-20,M-31......,意味着失H,CH3,H2O,HF,OCH3......

(5)假设一个分子结构,与已知参考谱图对照,或取类似的化合物,并作出它的质谱进行对比。目前计算机自动检索还不完善,尤其是ESI 等谱图,因操作条件很难完全一致,不是绝对准确,还要看是否符合生源等其他特征，而且许多天然产物，合成的新化合物谱库中没有。 三.有机质谱的特点与应用 1.优点:

(1)定分子量准确,其它技术无法比。

(2)灵敏度高,常规10-7—10-8g,单离子检测可达10-12g 。 (3)快速,几分甚至几秒。

(4)便于混合物分析,GC/MS,LC/MS,MS/MS 对于难分离的混合物特别有效,如药物代谢产物,中草药中微量有效成分的鉴定等,其它技术无法胜任。

(5)多功能,广泛适用于各类化合物。X-RA Y 要求好的结晶,NMR 要溶。 2.局限性:

(1)异构体,立体化学方面区分能力差。

(2)重复性稍差,要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR,IR 等自己动手,须专人操作 (3)有离子源产生的记忆效应,污染等问题。

E xam p les o f M asses

H aloperidol :C 21H 23N O 2FC l

N om inal M ass:375

A verage M ass:375.8737E xact M ass:

375.1401M onoisotopic m ass

375.1401

m /z

365

376

386

378

100

7550

25

% Intensity

→C 21H 23N O 2FC l →

(4)价格昂贵,操作复杂。

所以与其他分析方法配合,能发挥更大作用,可以先做一下质谱,提供指导信息,如结构类型,纯度等。

3.应用

(1)有机化工

a.合成中原料及产品杂质分析——LC/MS

b.中间步骤监测

c.反应机理的研究

(2)石油

(3)环保样品还需进行前处理，并非全都能直接进入质谱

a.农药残毒检测

b.大气污染

c.水分析

d.特定成分定量测定,单离子和多离子检测,灵敏度可达10-12g,借助于内标或标定曲线,可定量,在痕量分析中非常有用。

(4)食品、香料

a.酒：判断真酒假酒,有无害,GC/MS是唯一客观准确的。

b.化妆品中除基料外,香料起关键性作用,通过MS,找出天然产物中有效成分后合成。

(5)生化、医药

a.蛋白质,多肽研究,前沿生命科学,FAB,ESI等,可测几十万分子量的生物大分子，定氨基酸序列,十几个肽,比氨基酸分析仪快且准。

b.天然产物,这也是最重要的内容之一,例如生物合成研究室拿到一个样品,据NMR推出的结构与MS图不符,元素分析也对不上号,从MS上看到有S元素,而元素分析未做S,故不对,NMR因其他干扰,所以H数也不对,碳谱少一个C，后来根据MS，重新换了NMR溶剂，才使C数吻合，用计算机检索标准MS谱库,得到正确的结构式。还有一个例子，植物化学研究室提取出一新化合物，质谱上有很强的72峰，表示含有氮甲基，而从核磁上看不到，只根据NMR 定出了错误的结构，后来因为质谱显示出的无法否定的证据，将此化合物重新进行碱化处理，再做NMR，才与质谱吻合，定出了正确的结构。

(6)法医、毒化

体液,代谢物等,兴奋剂检测,质谱图是必要的证据之一。

液相色谱／质谱联用技术李立军

色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的 FID（GC）和UV（LC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息等优势，已被公认为高级的通用型检测器，把它与各种分离手段联用，将定性、定量结果有机地结合在一起，一直是人们所研究的目标。

GC／MS在我国已有 20多年的应用历史，随着台式小型仪器迅速增长，在色谱研究中已经成为重要的手段，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发化合物的分析任务，迫切需要用液相色谱／质谱联用解决实际间题。与气相色谱相比，液相色谱的分离能力有着不可比拟的优势，液相色谱／质谱联用技术为人们认识和改造自然提供了强有力的工具。HPLC可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC／MS联机曾长期为分析界所期待，由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式 MS鉴定，或制成衍生物用 GC／MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为 LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型 LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要的作用。一．液相色谱／质谱联用适用范围

液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。

图1 液相色谱／质谱联用的基本流程

首先看看气相色谱／质谱联用的特点：

·要求样品气化后进入质谱仪

·用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比

·用毛细管色谱柱分离化合物，分高效率高

·操作条件稳定、使用方法成熟

·适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物

液相色谱／质谱联用主要可解决如下几方面的问题：

①不挥发性化合物分析测定；

②极性化合物的分析测定；

③热不稳定化合物的分析测定；

④大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）的分析测定；

附图清楚地表明了各种接口技术的适用范围。

二．液相色谱／质谱接口的发展

起步于70年代，先后研究出27种接口

1．传送带（MB）LC／MS接口方式

七十年代末采用传送带方式与MS传统的EI，CI离子源相联。灵敏度差，不能用反相柱，待测样品必须汽化后再电离。中国至少买了8台，现已淘汰。

2．热喷雾（TS）

产生于八十年代中期，不仅是LC／MS接口，也是软电离方式，热喷雾时LC流出液经过高温加热而超高速喷雾，产生的离子进入MS，中性分子由真空泵抽走。TS只能获得与分子量有关的信息。在热喷射过程中会使热不稳定化合物分解，在一定程度上被API取代。

3．粒子束（ PB）

利用溶剂与被分析物的动量差分离（与气相色谱／质谱仪上的玻璃喷嘴分离器原理相似），进入质谱后用EI或CI方式电离，优点是能提供传统的EI和CI质谱图。

4．连续流动快原子轰击（CFFAB）

与静态的快原子轰击（FAB）类似。

5．大气压电离（API）（接口与电离相结合）

八十年代后期出现，大气压电离源顾名思义是一种常压电离技术，在大气压下电离，仅把带电离子“吸入”质谱，不能提供经典的质谱图。目前大气压电离特指：电喷雾（ESI），离子喷雾（IS）和大气压化学电离（APCI）。由于它不需要真空、减少了许多设备，方便使用，而且有下面的优点，因而在近年来得到了迅速的发展。

(1). 由于产生多电荷离子（在ESI和IS下），测定分子量可以达到10万道尔顿以上

(2)．灵敏度达fg-pg

(3)．适用于极性和离子型化合物

(4)．进样方式多样灵活

a）直接流动进样

b）与液相色谱联用

c）与毛细管电泳联用

三．接口原理1．电喷雾电离(ESI)

电喷雾电离是一种“软”电离技术，ESI－MS既可分析小分子也可分析大分子。对于分子量在 1000 Dalton（简写为 Da,现法定计量单位写为u）以下的小分子，会产生[M＋H]+或[M-H]-离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检测，就可得到物质的分子量。此外，也可能源内CID生成一些碎片，有利于提供样品分子的结构信息。而分子量高达20，000 u的大分子在 ESI-MS中常常生成一系列多电荷离子，通过数据处理系统能够得到样品的分子量，准确度优于± 0．01 ％。

(1)．电喷雾机理

电喷雾电离是在液滴变成蒸汽产生离子发射的过程中形成的，这种过程也称为“离子蒸发”，如图2所示。溶剂由泵输送从不锈钢毛细管流出，由于它带3—5kV高压，与对应极之间产生的强电场促使溶剂在毛细管出口端发生喷雾，产生带强电荷的液体微粒，所以称为电喷雾。随着液体微粒中溶剂蒸发，离子向表面移动，表面的离子密度越来越大，最终逸出表面，蒸发进入空间。所以离子形成的过程实际上是在大气压下发生的。

(2)．电喷雾离子源(离子喷雾)Includes IonSpray, TurboIonspray, NanoSpray

图3是电喷雾离子源结构的详细示意图。样品溶液经过内径75um、带 3—4 kV高压的不锈钢毛细管进入离子源，毛细管外有一个同轴套管，通入N

2

气作为雾化气抵达探头端口的液滴。由于高压和雾化气的作用，使液滴生成

含样品与溶剂离子的气溶胶。同时，与喷雾针成一角度还通入加热干燥的N

2

气，进一步除去溶剂,并有效防止仪器污染,整个电离和除溶剂过程都是在常压下进行。

High Voltage Sample

Neb ulizer Gas

charged droplets

+

+

+

+–

+

+

–

+

+–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Ion Source

(atmosphere)

IonSpray inlet

Ions

To Q0

(8x10 Torr)

-3 Vacuum Interface

图3 电喷雾离子源示意图

调节锥体电压可使离子源输出的离子数达最佳条件，它通常以[M＋H]+或[M-H]-是否最佳来衡量。但是，增加锥

体电压会加速离子向锥体分离器移动。由于按质谱标准该区域仍处于高压。样品离子仍有可能与气体或蒸汽分子碰撞而生成离子碎片。锥体电压增加越大，离子碎裂也越加剧。这种效应可产生反映样品结构信息的碎片，而且重现性好，还可用碎片离子准确进行物质的定量分析。由此可产生裂片的功能称为源内CID（碰撞诱导分解）。

2·大气压化学电离（Heated Nebulizer或APCI）

图4 APCI电离源示意图

样品溶液经过内径 100 um的熔融石英毛细管抵达加热到设定温度的探头区，石英毛细管的外套管内通入热的

N 2雾化气至毛细管口流出的液体，加热的探头与N

2

雾化气的共同作用使流出液生成气溶胶后蒸发。雾化气管外还有

一根同轴套管通N

2

屏敝气。将蒸发的气溶胶导入 APCI源。大气压化学电离源其余部份与电喷雾源相似，所不同的是帘板前还有一个放电尖端，放电尖端装在一种Peek工程塑料上，其上加3～4．5 kV电压（负离子检测用 2—3．5 kV）。而喷雾毛细管不带电压。它们之间放电的能量使毛细管流出经过离子源的溶剂分子发生电离。生成的离子还与其它溶剂分子碰撞，每次碰憧均消耗能量生成低能气态等离子。样品分子通过等离子区域时，由于质子转移或试剂离子作用而电离。因而整个电离都在常压下由化学溶剂作用而产生，所以称为大气压化学电离。

3．电喷雾与大气压化学电离的比较

电喷雾电离与大气压化学电离在结构上有很多相似之处，但也有不同的地方。掌握它们的差异对正确选择不同电离方式用于不同样品的分子量测定与结构分析具有重要的意义。它们的主要差别是：

·电离机理：电喷雾采用离子蒸发方式使样品分子电离，而APCI电离是放电尖端高压放电促使溶剂和其他反应物电离、碰撞、及电荷转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。

·样品流速：APCI源允许的流量相对较大，可从0．2到2 ml／min，直径4．6 mm的高效液相色谱（HPLC）柱可与APCI接口直接相连；而电喷雾源允许流量相对较小，最大只能为 1．0 ml／min，最低流速可小于 5ul／min，通常与 HPLC的微径柱如2．lmm或毛细管色谱柱相连。

·断裂程度；APCI源的探头处于高温，尽管热能主要用于汽化溶剂与加热N

2

气，对样品影响并不大，但对热不稳定的化合物就足以使其分解，产生碎片，而电喷雾源探头处于常温，所以常生成分子离子峰，不易产生碎片。

·灵敏度：APCI与ESI源都能分析许多样品，而且灵敏度相似，很难说出哪一种更合适。同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。

·多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子。而ESI源特别适合于蛋白质，多肽类的生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。

4． NanoFlow API接口

专门设计的 NanoFlow API接口特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从 5nL／min到luL／min。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。灵敏度可高达fmole。并可直接与微孔HPLC 联用。

5. 液相色谱一质谱各种联用技术的比较

表 LC/MS各种联用技术的比较

6. LC/MS与 LC/UV的比较 (图)

四．LC／MS对LC的要求

1．ESI的最佳流速是1—50 ul／min，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流比＜l／50，目前大多采用 l—2 mm 内径的微柱，并配置 0． 1～ 100 ul／min的微量泵。采用毛细管 LC柱时，柱后必须补充一定的流量。

2．APCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。

3．LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氯乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸胺＜10一5 mmol/l。LC色谱柱生产商提供了大量的文献帮助色谱工作人员选择流动相，但是这些资料并不包括最佳的LC分离。当用API作为接口使LC与MS联用时，磷酸盐缓冲液不适合LC－MS系统。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。

4．总离子流（TIC）可以与UV图相对照，基峰离子流（PBI）有时将更清晰地反映分离状况，特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是 LC／MS测定中最有用的谱图，它既有保留值信息，又具备化合物结构的特征，抗化学干扰性能好，常用于定性定量。因此，为了提高分析效率，常采用＜ 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离）。

5．样品的预处理：

（1）为什么要进行样品的预处理

认为LC／MS／MS不需要样品预处理的理解是片面的

·防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴

·获得最佳的分析结果

从ESI电离的过程分析：

ESI电荷是在液滴的表面

样品与杂质在液滴表面存在竞争

不挥发物防碍带电液滴表面挥发

带电离子进入气相

大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态

大量杂质离子的存在增加电荷中和的可能

（2）样品的预处理常用方法

a）超滤 b）溶剂萃取／去盐 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）净化／去盐

e）色谱分离反相色谱分离亲和技术分离

五．用大气压电离质谱仪得到的分子量信息

分子离子是最有用的特征离子。

1.测定分子量的方式:

·对于极性化合物使用ESI方式

正离子扫描负离子扫描正负离子交替扫描（磁式质谱不适合）

·对于中性或弱极性化合物使用APCI方式

正离子方式常出现如下离子:

-Na 22 Da. higher than M+H

-K 38 Da. higher than M+H

-Li 9 Da. higher than M+H

-NH4 17 Da. higher than M+H

-ACN 40 Da. higher than M+H

2M+H,2M+Na等

负离子方式常出现如下离子:

-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background)

-Acetate 60 Da. higher then M-H

-Formic 46 Da. higher then M-H-

-Cl 36 Da. higher than M-H

2.影响分子量测定的因素

1）PH的影响 2）气流和温度 3）溶剂和缓冲液流量 4）溶剂和缓冲液的类型

5）选择合适的液相色谱类型 6）合适的电压 7）样品结构和性质 8）杂质的影响3．根据多电荷离子计算分子量

有些化合物，如蛋白质类，经常带有多个电荷

·质谱仪分析荷质比（m／z），这些离子以“表观”质量数出现在质谱图上，既得到M

1，M

2

，M

3

…．

·相邻两个质谱峰的电荷数差1，即n

1=n

2

＋1

·设样品的真实分子量为M ·可以列出方程组：

n

1=n

2

＋1 ……………（l）

(M + n

1H)/n

1

= M

1

(2)

(M + n

2H)/n

2

= M

2

， (3)

M为真实分子量 H为质子的质量 n

1，n

2

，为电荷数 M

1

，M

2

为质谱测得的离子的“表观”质量数

解方程组，得到电荷数，进而算出分子量M

n

2=(M

1

-H)/(M

2

-M

1

)，(n

2

取最接近的整数）

M =n

2·（M

2

－H）

实际操作中，由计算机完成。

4．分子量测定中的误判

·溶剂中的杂质

常见m/z 149，m/z 279的峰来自于塑料添加剂

·样品容器不干净

常见表面活性剂的峰

·进样系统污染

·样品在源内碎裂，形成碎片离子

5．分子量测定失败的原因

a）流动相不合适 b）不挥发性盐的影响 c）成分复杂，杂质太多 d) 样品浓度不够

e）pH值不合适 f）样品在源内分解或碎裂

六．LC/HRMS的方法

精确质量扫描

通常用平均质量接近样品质量的PEG或PPG混合物作为内部校准物，以得到LC精确质量。电压扫描校准至少需要2个峰而磁场扫描需4个或更多的基准峰。

由于可能影响分离效果，产生峰扩张，在检测器上产生大的紫外抵消，所以不能加入PEG。需要通过T形管加设一个后柱。经辅助泵提供PEG溶液，可以改变PEG的流速，改变PEG与样品的比率。这意味着校准物和样品的峰高相匹配，得出更精确的结果。

七．LC/MS/MS

API－MS在分子结构分析中的应用除了前面讨论的提高锥体电压、促使分子碎裂从而得到源内 CID结构信息外，采用质谱／质谱即 MS/MS是进行分子结构测定的一种更有效的方法。这是由于当LC分离不好，几个化合物同时流入MS时，混合物的CID谱很难解释。这里主要阐述MS/MS常用的操作及数据采集方式。

1.化合物鉴别

(1)全扫描方式

全扫描数据采集用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。

(2)子离子分析（DAU）。

子离子，用于结构判断和选择母离子作多种反应监测（MRM）。采用这种方式时，选择离子源中产生的感兴趣的母离子通过MS1，在MS1和MS2之间碰撞室中通入气体（常用氩气,甲烷等）。离子由于碰撞电压加速进入池内与气体发生碰撞而发生断裂，MS2记录碰撞产生的全部子离子，通过MSI的离子称为母离子，而在碰撞室内解离而成的离子称为子离子。

子离子谱图与锥体电压断裂谱图可能十分相似，实质上二种过程都包括了碰撞诱导分解（CID），所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，只有在质量相同的两种化合物同时在离子源内电离时，才能出现干扰。而离子源内提高锥体电压的碎裂，则扫描MS1得到的图谱可能包括离子源内同时存在的其他化合物产生的离子。所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。

2．目标化合物分析

（1）选择离子记录（SIR）

SIR用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。及它生成的特征离子，如果用色谱法，则它的色谱保留时间也需已知。

若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子（实际上可用快速程序设定）；或者，若用色谱法当目标化合物从色谱柱流出时（保留值窗口），仪器设定在只采集单个离子。通过锥体电压断裂并用SIR监测一种碎片离子，也可确认一种化合物是否存在。

（2）多反应监测(MRM）

MRM操作方式用于检测已知或目标化合物，既有高灵敏度又有高选择性。用这种方式时，分析物质及它生成的子离子的性质均需知道。MS1设在只让分析物的母离子通过，并让它在碰撞室中断裂。而MS2设在只让一个由该母离子生成的特定子离子通过。

MRM可以看作两个SIR而且MRM在许多方面提供的特殊性比SIR还要好。若样品经过液相色谱柱再进入质谱仪可进一步提高特殊性。因为很少有保留时间完全相同、质量完全相同，以及生成的子离子也完全相同的化合物。 MRM与SIR相似，得不到普通的质谱图，若要观看谱图，只能见到一种质量的峰；与SIR一样，可以用保留窗口监测不同时间下的不同变化，选用MRM代替SIR可以分析那些本底复杂的样品，还可排除可能会产生干扰的化合物。有时在SIR分析中碰到的干扰用MRM则可以过滤掉。

(3)母离子扫描（PAR）

母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。

八．应用