近场扫描光学显微术

近场扫描光学显微术

由于衍射极限，光学显微术的基本原理使得其成像的空间分辨率为所使用光的波长及所使用光学系统的物镜和聚光镜的数值孔径所限制。近场扫描光学显微术（NSOM）——也经常称之为扫描近场显微术（SNOM）是基于这样一种需求而开发的。其成像具有由光学显微术成像中的各种衬度结构，而空间分辨率高于典型的光学衍射极限。

近场扫描光学显微术被归类一个大类的仪器中，这类仪器被称之为扫描探针显微镜（SPMs）。所有的SPMs实质上均根据IBM的研究人员Gerd Binning和Heirich Rohrer于1980年前所发明的扫描遂道显微镜（STM）发展起来的。普通光学成像方法的理论极限（对可见光为200-300纳米）是刺激现代高分辨率扫描探针显微术发展的主要因素，例如STM和原子力显微术（AFM），较早期的透射式电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。这类技术和其后开发的技术使分辨率得以很大的提高，甚至可分辨单个原子。虽然，在近场扫描光学方法发明之前，超高的分辨能力可利用光学显微术中的各种各样的衬度放大装置来实施。对大多数高分辨技术来说，标本的制备方式限制了它在很多场合下的应用，特别是生物学研究中的动态检测及器皿中试样的检测。近场扫描光学显微术综合了AFM技术中极高的地形地貌状分辨率特性，很多类型光学显微术中有效的现行分辨率、偏光特性，光谱特性，灵敏度及灵活性等。

物体与光的作用，例如显微标本，其结果会产生近场和远场两种方式。远场光是透过一个非限制方式的空间进行传播的，作为一种“普通”光在一般的显微术中应用。而近场（趋于零）光则是由一个非传播场构成。这个非传播场存在于标本的表面附近，其距离小于光波的波长。在近场内的光在标本表面几十纳米的范围内携带了更高频率的信息并具有最大的幅度。因为近场光在一个光波长的距离内是安指数衰减的，通常是趋于不易探测。事实上，当光由标本表面传播致到远场区间，高频率空间信息已被过滤掉了，在这种情况下即“衍射光的阿贝极限”产生作用了。在产生衍射前探测利用近场光，NSOM全部利用了远场光学中使用较高空间分辨率中应用到的衬度放大机理。除了无衍射极限、高分辨率的光学

成像之外，通过小于100纳米的分辨率光谱仪分析，近场光学技术可应用于化学和结构的分析。

大多数现代商品化的NSOM仪器，具备普通光学显微术的光探测能力并结合了AFM的扫描力技术。根据特殊研究场合的需要，所有的NSOM设计得十分有效。最为常见的结构是将NSOM附加在倒置式荧光显微镜上。在普通显微镜上借助NSOM，许多显微镜使用者所熟悉的显微成像的类型，均可在近场显微镜的高分辨能力下呈现出来。除了光学信息之外，NSOM可建立类似原子力显微术中标本的地形地貌状图形或力的数据。两个独立的数据系（光学的和地形地貌的）可相互的比较，进行物理和光学衬度之间的校正。NSOM技术最实在的能力在于，它的地形地貌状数据系与之相应的光学数据系在分辨率上远远高于对光调焦的衍射极限。

Figure 1所示的为一台现代的倒置式光学显微镜上加装的NSOM系统。这样的配置使NSOM头，包括探针及探针的定位机构方便地安装在标本载物台的上方，而物镜安装于载物台的下方。图中的配置包括一个提供照明的外置激光器，一个收集光信号的光电倍增管及相应的用来管理标本、探针定位、图像采集的计算机和电子控制装置。

虽然扫描探针显微镜家族的专业化极强，其结构上的变化也很大，但共同的操作特点为都要使用一个与标本之间的间隙非常小的探针。典型SPM的探针尺寸为纳米级，探针与标本之间的间隙可由各种机构控制和和记录。不同型号的SPM由探针的特殊性质及它与标本表面之间隙的性质来表征。

典型的NSOM成像原理参见Figure 2。图中开孔直径小于一个光波长的照明探针置于标本表面的近场范围内。为了实施无衍射极限，标本与探针之间的间隔需小于一个光的波长，所有的SPMs需要一个反馈伺服系统精确地控制标本与探针之间的物理间隔。此外，需要借助一个X-Y-Z方向的扫描器（一般为压电式）来控制探针在标本表面上的移动。在Figure 2 NSOM的示图中，物镜置于远场状态，即常规状态，用来采集图像形成的光学信号。

借助于特殊仪器的设计，X-Y-Z方向的扫描可加载到探针或标本上。如果扫描器加载在标本上，则标本可在固定探针尖端的下方按栅状路径扫描，这样便可生成由标本相关点产生的信号组成的图像。成像面的尺寸仅由扫描器的最大位移量来决定。计算机同时判断出探针的位置、以及从反馈伺服机构获取的数椐，控

制探针尖（或标本）的扫描动用及探针与标本表面之间的间隔。在作栅状路径的扫描过程中，计算机对标本与探针之间的相关信息逐点采集、记录，生成两维的数据系（线性的）。

由NSOM收集到的二维数据系随后被编码，在计算机的监视器上重现三维图像。典型的由扫描探针显微镜测量生成的图像之像素尺寸可从原子级（小于1纳米）到100微米。扫描探针显微镜家族组成形式有磁力、电子力、电化学效应、机械效应、电容、离子传导、霍尔系数，热特性及光学特性（如NSOM）。NSOM 图像为一典型的由标本上方的亚波长尺寸光孔作两维栅状路径扫描，并由远场系统逐点采集的光幅射而生成。

早期开发的高分辨率技术，例如扫描电子显微镜、透射电子显微镜、扫描隧道显微镜及原子力显微镜，均无法获得与光学显微镜类似的有丰富衬度细节的图像，在大多数的情况下只局限于对标本的表面研究。加之现有染色法增衬技术，荧光、偏光、相衬、及微分干涉相衬，光学方法仍据有其固有的光谱特性和现时的分辨能力。电子显微镜高分辨率的获得是受到标本适用性及对标本制备等高要求，高成本限制的，这包括真空兼容性的要求，透射光显微镜术中薄剖面的制备，对非导体标本镀制导电镀层等（STM就有这种要求）。对于生物材料，这类预处理显得更为重要，需要先期对其进行完全的脱水才能进行切片和镀制。虽然原子力显微镜对这类的标本制备无过多的要求，并能在一般的环境条件下获得原子级的分辨率，但该方法不能获得标本光谱特性的信息。AFM还存在另一个局限性，它不能有效的利用荧光显微术中广泛使用的荧光染料的特征。

NSOM技术对纳米技术的研究人员（物理学研究人员、材料科研人员、化学及生物研究人员）特别有用处，他们的科研工作中需要了解各种材料的超高分辨率空间信息。不过还没有近场检测技术开发到可对三维空间系进行成像。NSOM受限于安装在扫描头上的标本探针能探测到的范围。

Figure 3 画出了配置了NSOM的倒置光学显微镜的图示及信息流程。激光激发源用光纤偶合到光探针上作为标本的照明；利用聚焦在探针上的第二激光通

过一个反馈伺服回路对探针的运动进行监视。探针的运动，透射载物台的移动及光学的、地貌状（或其它的力）图像的获得与显示均通过外加的电子控制器和计算机实施。

NSOM的历史

Edward H. Synge 于1928 发布一系列的著作，首次提出了超高分辨率光学显微镜的概念。Synge提出了一种新型的光学显微镜，该显微镜可回避衍射极限，但需要在一个不透明的屏幕上制作一个10纳米的小孔（比一个光的波长小很多）。一个染色的嵌入标本要磨制到光学级平整性，并以与小孔差不多的距离对标本扫描。在这种扫描中，光照明屏幕的一边，透过小孔的光受到小孔尺寸的限制，在光未衍射之前照明标本。保持标本的距离小于小孔的距离，标本成像的分辨率会达10纳米。Synge准确地提出了当时制造近场显微镜的困难。包括如何制造这样小的孔，如何获得足够强的光强度，标本如何定位在纳米级的范围内，标本与小孔如何保持这样小的距离等。这种建议在当时的技术能力条件下是不可接受的。

Synge的建议直到1972年被E. A. Ash和Nicholls在微波波长范围内的电磁谱中得到了证实.(参见Figure 4)。利用波长为3厘米的微波穿过直径为1.5毫米的探针孔，探针扫描整个周期性间隔的金属栅格线，栅格上0.5毫米的线和0.5毫米的间隔均可分辨，证实了亚波长分辨率达光波波长的0.017。

将Synge的概念延伸到波长更短的可见光谱范围内，对现代的制造工艺来说是一个很大的挑战（在小孔的制作及定位上）。1984年IBM公司的Zurich实验室在光学仪器测量的亚衍射级分辨率报告中仍未得到克服。一个在Cornell大学工作的独立小组则报告他们在技术上接近实现可见光光谱内的近场成像，于是两个小组开始了近代NSOM的开发工作。IBM小组采用在石英晶体上镀金属的方法在尖端制作小孔的探针，并命名为扫描近场光学显微术（SNOM）。Cornell小组则采用电子束在硅或金属上制作一个小于50纳米的小孔。IBM小组要求最高的分辨率达25纳米，或488纳米幅射波的1/20，以利用它测量精密金属线光栅之类的标本。虽然在可见光范围内无衍射成像的实现证实了近场光孔扫描技术的可行性，但是在1992年之前该技术仍未作为一种仪器在科学研究上得到广泛应用。一直到剪切力反馈伺服系统开发成功和单模光纤作为NSOM的探针后，才由在AT&T Bell实验室工作的Eric Betzig在近场技术上加以应用。

NSOM装置

在光孔扫描NSOM仪器中，在近场中定量的点扩散函数可由高斯曲线决定，

其1/e强度值与NSOM探针尖端小孔的半径差不多。当照明源的半径小于成像光波长的1/3，光的传播之初是无限小的（平行于标本的表面）。为了实现光学分辨率高于衍射极限（普通光学显微镜的分辨极限），光探针必需保持在近场的区间内。在NSOM中，光探针与标本之间的间隔应保持在几个纳米的距离内。在目标源附近，幅射保持在近场区间内，但时离开标本表经过几个波长的传播距离，幅射将产生明显的衍射，并进入远场状态。

近场与远场光学显微术之间有两个基本上的差异：被照明的标本面积尺寸；幅射源与标本之间的距离。在普通的远场光学显微术中，光源与标本之间的距离远远大于投射到标本上光的波长；然而在NSOM中，必备的条件是，光源与标本之间的距离要小于照明光波长。

X-Y-Z扫描

所有扫描探针显微术的核心均为扫描系统。在设计和性能上的主要要求是达到其扫描的分辨率。扫描器必需具备低的噪声（很小的定位波动）及精确的定位能力（典型值要小于1纳米）。探针定位要求的精度通常需要将整个的仪器放置于一个防振工作台上，或者采用其它的方式悬挂起来，避免整个建筑内的机械振动传递到仪器上。为了实施探针和标本的扫描定位，必需配置大动态范围，低噪声，高电压的放大器来驱动压电执行器。在整个的移动范围内，压电器往往需要0-150V或者-150V-+150V的电压。

在多数使用情况下，NSOM要求探针在被成像的标本上方保持稳定的反馈伺服状态。为了保证探针在很窄的近场状态而不与标本接触，需要对探针进行非常精确的控制。要严格的保持探针与标本之间的间隙，需要有一个实时反馈系统来控制。这种系统还有很多优点。最为重要的是考虑到保护探针或标本不至于损坏，这种情况在标本与探针相碰时极有可能发生。再则，如果控针与标本已经相碰，在扫描时探针上也在可能累积很多标本的碎片。虽然这种情况并不多见，探针在反馈控制状态下也可能出现这种现象，特别是反馈的起始点选择得不正确时。

更为重要的是，利用这种反馈系统来控制探针对标本进行扫描，可以消除由于探针与标本之间的间隔发生变化而引起的光信号的指数性变化。这种由探针与标本之间隔变化而引起的指数性信号变化可使得出的图像上出现与标本实际光学特性不一致的虚假点。为了获得高分辨率的，无人为的虚假点的光学成像，近场技术的最基本要求是探针与标本表面要保持几纳米的间距。不使用某种反馈伺服机构是不可能实现的。

有几种不同的技术可用来监视探针尖与标本表面的间隙。现将这类技术如下述：

1 采用双光束干涉仪或纤维干涉仪检测探针尖的位置；

2 电子遂道现象（仅限于导电标本）；

3 检测通过探针尖的光发射（可用于透射或反射）和光子遂道现象；

4 衡定力（原子力反馈）为一种最为常见的方法，它以可分为如下两种：

a 被探针尖分离光源的衍射；

b 加在探针尖的机械传感器（例如石英音叉）

5 电容检测

如今，对探针尖进行定位有两种最为常用的方法。一种是光学法，这种方法的基本原理是监视探针尖的振动幅度（通常为干涉测量法），另一种为非光学的方法，即音叉技术。这两种方法均称之为剪切力反馈法。更详细的内容其后介绍。

振荡反馈法

对于反馈信号，为了改善其信噪比，几乎所有的NSOM的针尖均在探针的共振频率下进行振动。应用这种同步检测技术（基于一个中心频率设定在相应的振荡频率上的带通滤波器）可消除由于低频噪声和漂移所带来的定位探测问题。当振动的针尖逼近标本的表面，针尖与标本表面之间的力将会使针尖的振动幅度减小。

机械（或电的）振动子的质量测量是由一个称之为品质因素的参数决定的。这个参数简称为Q。品质因素定义为振动器的谐振频率除以它的带宽。为了获得更大的稳定性和探针的高灵敏的调整性。振动探针的Q值越低则信噪比就越低，这就意味着从反馈机构取得的标本的表面信息的质量越差。本来，字母Q是用来表示电路器件阻力的反作用比率的，此处人为借用作为振荡器的“品质因数”的表示符号。

通常，共振峰值和品质因数均要随探针尖与标本表面之间的逼近而发生变化。探针尖的振动幅度与频率可用几种方法进行监视，这类方法可分为两类。剪切力法利用横向（平行于标本表面）振动时探针尖与标本表面之间产生的剪切力来控制成像标本与探针尖之间的间隔；而导出法则依赖探针尖垂直于标品表面的振动时产的原子力来产生反馈信号。两种振动均有各的优点及缺点。

剪切力反馈

在剪切力伺服反馈法中，探针尖在标本表面附近以机械的共振频率进行振动。为了避免对光学成像的不利影响，针尖的振动幅度一般均很小（小于10纳米）。为了获得最佳的成像，剪切力反馈技术通常限制使用表面平整度不好的标本片；相对于原子力显微术，剪切力显微镜需要较长的扫描时间。剪切力反馈通

常使用直探针，这种探针容易制作，价格也比弯探针低。

在光的通过性能上，直探针也优于弯探针，这是因为它有很小的传播损耗。但是直探针很难在流体标本上应用。这是因为流体的粘性将很明显的降低探针的振动幅度。在应用中，当振动的探针逼近标本的表面时，由于其损耗和存在于探针尖的绝热力，探针的振幅、相位及频率均要发生变化。探针振动是随针尖标本间距的减小，两者之间的相互影响成非线性的上升而减小的。

剪切力的实质是：当要检测的标本目标逼近探针尖时让验振动衰减。有一个科研小组在剪切力反馈法中对金属化探针与标本之间的遂道电子电流进行了测量，评估在探针逼近标本表面最后瞬间探针的振动。测量标本逼近针尖时，针尖与标本刚要接触并开始进行反馈而继续轻微地接触标本那个周期的遂道电子流。测量表明，为了减小标本与探针之间的物理间隙, 最有效的逼近方法是使反馈的设定值尽可能高（例如：原非衰减信号的99.5%）。事实上，反馈设定值的上限取决于反馈信号的信噪比。光学反馈法为早期NSOM中剪切力反馈中最常用的监视探针振动幅度的一种方法，并可在导出法中应用。在这种方法中，无论是直探针或弯探针，一束激光应尽可能的汇聚在NSOM探针的最前端。在使用直探针时，照射在探针上的激光会在分裂式光电二极管上投射一个阴影：在使用弯探针时，激光会被探针的顶部反射到分裂式光电二极管上（类似于AFM技术中的光学反馈技术），当激光反馈的建立，无论是导出法或剪切力法，探针会在振动压电装置的驱动下按已知的频率产生振动（见Figure 7）。分裂式光电二极管收集到激光信号，由于分裂式光电二极管各边收集的激光强度不同，便产生了差异。采用同步锁定放大器来选择选择与压电振动频率相同的信号可获得高信噪比。

在这类反馈机构中主要存在的问题是：用来检测光探针振动频率、相位及幅度的光源（例如激光）可能成为对NSOM信号检测的干扰源。一种解决这个问题使它的影响减小的方法是：使这种探针的探测光的波长与近场光的波长不同，一般情况下，探测光的波长大于近场光的波长。这种方式需要在检测器前加装一个滤光器，选择性的阻断从反馈系统发出的光子。在一般的情况下，这种附加的滤波器应对近场光的阻挡作用应很小，以免降低信号电平。非光学反馈方法就无这种特性，也就是这类方法（例如音叉技术）使用的主要原因。

压电石英音叉最早使用于扫描探针显微术中的近场扫描声学显微镜。其后，由于其低成本和制作简单的特点，被NSOM采用作为一种非光发射和探测的距离控制装置中。石英晶体具备在压力下产生电场或在电场中产生尺寸改变的特性。这种特性称之为压电性。由于它在价格上相对低廉，因此被广泛的应用来作为精密振荡器（数字时钟）及高选择性的波过滤器上。当石英音叉在反馈回路中作为调整器件时，由于它非常高的机械品质因数Q（大约10000）以及相当高的增益，提供了在一个非常小的作用力（大约需一个微微牛顿）下的高灵敏度系统。

音叉使用在剪切力探针反馈法中的基本结构是：一个单模光纤安装在石英晶体音叉的一个臂上，并按音叉的共振频率振动。音叉的等效电路是一个并联了密封电容的串联式RLC谐振器。最常用的音叉共振频率是32768赫兹（Hz），但本装置使用的共振范围从10kHz到几十个MHz。NSOM头上嵌入的单模光纤与晶体音叉物理偶合，该音叉可由内部的（电气的）或外部刚性固定在音叉上的压电器驱动。音叉的振荡依靠激发，如果音叉是由电气（直接）驱动，则音叉的双臂成相反方向的振动；如果是由外部驱动，则音叉的双臂振动方向是相同的。

Figure 5所示为一石英音叉上附有用于剪切力探测光纤的图形。压电电势是由音叉上的电极提供，然后由一个增益大约为100的放大器放大产生几十微伏的信号。此信号送同步放大器并与振动音叉的驱动信号进行对比。同步放大器输出（幅度、相位或者幅度与相位的复合信号，例如X、Y的信号）与控制回路中使用者规定的参考信号进行对比，保持标本上面的探针进入反馈。

Figure 6所示为一个其上附有NSOM光纤的32.7KHz音叉产生的同步曲线示例。音叉的测量频率是从31KHz到33KHz，同时测量了信号的幅度和相位。在加载了光纤时同步频率产生漂移，同步的品质因数Q从20000到小于1000。Q定义为：

fr/Δf

此处f（r）是最大幅度时的频率，Δf为同步峰的宽度，该宽度由幅度峰值幅度除2 的平方根的点来决定，即大约为峰值幅度70.7%。

音叉法具备很多优点，使它在探针调整上的应用比光学法更为广泛。因为它不是采用光学的方式，所以不可能产生杂散光干扰NSOM的信号。此外音叉光法不需要烦琐的对外部激光器进行调试和对光学元器件进行调焦的程序。因为它的紧凑及相对容易使用的特点，使音叉方法常常应用在需要进行监视操作的场合，例如真空系统，环境控制箱内。

导出法反馈

导出法反馈是另一种常用于探针与标本距离的控制方法在好几种不同的探针上应用。一种有效的设计是由一个改进的ASM悬臂和透明的探针组成，此探针通常用硅的氮化物制成，其探针尖的下部镀制了金属。导出法中常用的探针是在靠近其尖部的光孔折弯了大约90度的普通光纤探针。应用于NSOM有代表性的弯光学探针见Figure 7。

导出法近场扫描显微术的图像分辨率不仅由探针尖的半径决定，而且与探针在标本表面垂直方向的振动幅度有关。这是由于光学信号敏锐的灵敏度与探针与标本之间的间距有关。为了保持高的近场分辨率，要求保持振动幅度比探针孔径尺寸小，或者对较大的振动幅度进行补偿。用来改善分辨率的机构使采集到的光信号与探针的振动周期同步。对偶合到探针尖的光信号进行调制，把相位调整到与探针最靠近标本时被照亮时的一点相同。这样便可在较大的振幅情况下保持高的分辨率。

弯的光学探针存在的一些缺点，均为本身的弯曲而引起的。最大的问题是增加了制作的难度，特别是制作针尖的金属镀层。其次是折弯了的探针增加了光学

信号的损失。这个损失对输出的影响是明显的。某些公布的测量指明，这种损失相对于普通的直探险针至少大于一个数量级。在一定的NSOM操作方法中，光的损失并不需要严格的规定，这是因为可增加进入光纤的光强进行补偿，使之获得预定的激光强度。光学损失，例如产生在弯曲处而不是在探针光孔处的发热是现存的一个主要问题，增加进入光探针的偶合量就是一种有效的选择。使用弯探针的另一个潜在的缺陷是，由于探针的弯曲使其特性发生了改变，例如采用偏振光测量时就增加了耗损率。在远场测量中使用弯探针的损失率约为70：1，与直探针比可大于100：1。

在弯探针伺服反馈法中，探针类似于AFM导出法一样在垂直于标本表面的方向振动。振动的幅度可用类似石英音叉压电装置之类的机械方法或用悬臂探针表面反射的激光检测之类的光学法来监视。探针按其固有的方式进行振动，探针与标本之间的距离则记录下来作为动态伺服反馈的信号。为了避免由于振动使探针与标本发生粘连，需要提供短的接触时间及反向驱动力。这种反馈伺服的成功率取决于由探针振动共振放大而带来的探针标本间距控制灵敏度的提高。探针的敏锐和灵敏度取决于悬臂的Q值（与剪切力振荡中的Q值相同）。此Q值随探针周围的液体的粘度增加而下降，通常伴随着很大的共振频率漂移。

导出法相对剪力法的优点是：相对容易获得纳米级的地貌图像，甚至当标本和探针浸在水或其它的流体介质中。有多个科研小组采用导出法，在生物系统的研究中，与其它的应用方式一道，在水中对单一的分子进行了探测。当振动的探针逼进标本的表面，音叉或光学反馈伺服信号均为发生衰减。这种衰减至今未完全了解其原因，但是已提出了好几种机理，包括表面张力、Van der Waals 力、和存在于探针尖与标本间的接触力等。

在探针尖部的衰减力可想象为标本的表面复盖了一层薄的水份（实际上，当标本置于环境条件下就是如此）。当标本往下进给时进入这一表层水中时，就象探针进入水中的情况一样，探针尖就会受到粘力的作用。随着粘力的增加，探针尖的振幅将会降低，并使针尖的共振频率发生漂移。这两种变化降低了音叉上的输出信号（非光学方法）。当这个衰减的信号低于参考信号的阈值时，反馈伺服系统将调整探针尖在标本上方的高度（按照使用者规定的参考信号）。

近场扫描光学显微术正在继续发展，尤其是对需要获得最高可能分辨能力光

学分辨率的显微工作者。但是NSOM不只是作为一种成像的显微仪器，它可用于微米组级标本的操作，制作和处理。NSOM超出成像目的的发展包括：精密的激光制作、纳米级的光学制版和封闭器件的局部释放。

近场扫描光学显微镜的有限性表现为：

1 实际上的零工作距离和极小的视场深度；

2 对大的标本面积和高分辨率需要长的扫描时间；

3 光孔小于所使用光波长，透过率极低；

4 标本的表面的研究只能在今后才能实现；

5 由于材料的弹性，光纤探针对软材料还存在一些问题，特别是剪切力法。

NSOM目前正处于它的发展初期，还需要更多的进行研究，发展改善探针的制作技术及更高灵敏度的反馈伺服机构。更进一步的发展可能要依靠无光孔近场方法（包括干涉压力），有的研究已达到1纳米的分辨率。但是对大多数的NSOM来说，它的典型分辨率为50纳米，这也比扫描共焦显微镜高出5或者6倍了。适度的增加分辨率需要花费时间对仪器进行调整及更复杂的操着。NSOM 的最大优点在于它可以提供高空间分辨率的稳定的光学和光谱数椐，及同步的地形地貌信息。原子力测量和近场扫描光学显微术在特定的研究场合有力的证明了，它们所获得的新的有关各种标本类型的信息，远场显微术是无法获得的。