液质联用原理及应用

液相色谱—质谱联用的原理及应用

简介

1977年，LC/MS开始投放市场

1978年，LC/MS首次用于生物样品分析

1989年，LC/MS/MS取得成功

1991年，API LC/MS用于药物开发

1997年，LC/MS/MS用于药物动力学高通量筛选

2002年美国质谱协会统计的药物色谱分析各种不同方法所占的比例。1990年，HPLC高达85%，而2000年下降到15%，相反，LC/MS所占的份额从3%提高到大约80%。我们国家目前在这方面可能相当于美国1990年的水平。为此我们还有很长的一段路要走色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。

色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。

液质联用与气质联用的区别:

气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

现代有机和生物质谱进展

在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。

随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。

目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。

质谱原理简介：

质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强

度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。．

常见术语:

质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的

比值,写作m/Z.

峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.

离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.

基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.

总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子总离子流图:

在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC 图.

质量色谱图

指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.

利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。

指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+ 或[M-H]- .

在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等碎片离子：

准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子.

碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。Ephedrine, MW = 165

多电荷离子：

指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才

会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采用电喷雾的离子化技术, 可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。

同位素离子

由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.

各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化

合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等

如何看质谱图：

(1)确定分子离子,即确定分子量

氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。

(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式

高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式

低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:

(3)峰强度与结构的关系

丰度大反映离子结构稳定

在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。

不同类型有机物有不同的裂解方式

相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异需要经验记忆。

质谱解析的一般步骤

(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好)

(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当

(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.

(3) 尽可能判断出分子离子。

(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......

(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。

有机质谱的特点

优点:

(1)定分子量准确，其它技术无法比。

(2)灵敏度高，常规10-7—10-8g,单离子检测可达10-12g。

(3)快速，几分甚至几秒。

(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。

(5)多功能，广泛适用于各类化合物。

局限性:

(1)异构体，立体化学方面区分能力差。

(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。

(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。

质谱仪器：

质谱仪由以下几部分组成

数据及供电系统

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进样系统离子源质量分析器检测接收器

┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系统

真空系统

质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。

利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。．

由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。

只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。进样系统

把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样等。

离子源

使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的有如下几种，其中EI，ESI最常用。

EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。

CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。

FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。

FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱) 。

ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)

APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离—同上，更适宜做弱极性小分子。

APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离—同上，更适宜做非极性分子。

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子．其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)

实验室现有的离子源:

ESI电喷雾电离源

APCI大气压化学电离源

电喷雾（ESI）的特点

通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。

电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。

大气压化学电离（APCI）特点

大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da 的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。

电喷雾与大气压化学电离的比较

电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。

样品流速：APCI源可从到2 ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为ml min. ／

断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.

灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。

多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子

NanoSpray 离子源

专门设计的NanoSpray 离子源特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从5nL／min到luL／min。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。灵敏度可高达fmole。并可直接与微孔HPLC联用。

正负离子模式:

一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行质量分析器: 是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

质量分析器的分类：

双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).

四极质谱仪(Q).

飞行时间质谱仪(TOF).

离子阱质谱仪（TRAP）

付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).

┏四极+TOF（Q-TOF）

串列式多级质谱仪┫三重四极（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF

进行MS/MS的仪器从原理上可分为两类

第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。即前面列出的串列式多级质谱仪。

第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。但不能进行母离子扫描或中性丢失。

实验室现有的质量分析器类型：

串联四极质谱仪(MS/MS) ：

三重四极（QqQ）

离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1 MS2

Q1 q2 Q3

QqQ仪器可以方便的改变离子的动能，因此扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定，只能做到单位质量分辨。（通过高分辨能得到化合物的分子式）

在液质联机中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式输送给分子离子，这个能量足以使得处在能量亚稳态分子中的某些化学键断裂并使一些特定的分子发生结构重排。

碰撞诱导解离CID质谱：

选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞，

发生离子—分子碰撞反应，从而产生‘子) 等CH4、Xe 、Ar、He、N2 气体：

离子'，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID

(collision-induced dissociation)谱

影响CID质谱的因素：

较大影响的因素有：所用碰撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的配置以及离子电荷状态

由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。

大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规

则一般可适用于CID质谱的解释。

检测接收器：

接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板

数据及供电系统

将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。

从几伏低压到几千伏高压。

LC-MS分析条件的选择和优化

1.接口的选择：

ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中

能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）

APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极

性的小分子的分析。

2.正、负离子模式的选择：

选择的一般原则为：

正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。

负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。

3.流动相的选择

常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。

LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5 mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。

4.流量和色谱柱的选择

不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用l—mm内径的微柱，TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／min

，常规的直径柱最合适。min／lml的最佳流速～APCI．

为了提高分析效率，常采用＜100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分

离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。

5.辅助气体流量和温度的选择

雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。

操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显着的分解。

选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。

样品的预处理：

为什么要进行样品的预处理：

从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。要求获得最佳的分析结果，从ESI电离

的过程分析：ESI电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥

发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。

样品的预处理常用方法

a）超滤

b）溶剂萃取／去盐

c）固相萃取

d）灌注（Perfusion）净化／去盐

e）色谱分离

反相色谱分离

亲和技术分离

f）甲醇或乙腈沉淀蛋白

g）酸水解，酶解

h）衍生化

化合物鉴别

全扫描方式（Q1扫描）

全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。

子离子分析（MS/MS ）

子离子，用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。

子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。

用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息

正离子方式常出现如下离子:

-Na 22 Da. higher than M+H

-K 38 Da. higher than M+H

-Li 6 Da. higher than M+H