悬浮细胞培养技术讲义

细胞培养技术相关知识简介

一.培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期

1.1 潜伏期(latent phase)

细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。

1.2 指数增生期(logarithmic growth phase)

这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。

1.3 停滞期(Stagnate phase)

细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡。

为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

二.细胞传代方法

根据细胞生长特点，传代方法有3种

2.1悬浮生长细胞传代

多采用离心法传代。1000转/分,20-30秒后去上清。沉淀细胞加新培养液后再混匀传代。

亦有直接传代法，即悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。本实验采用此法。

2.2半悬浮生长细胞传代

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁上脱落下来，进行传代。直接吹打对此类细胞有损伤，亦可采用酶消化法传代。

2.3贴壁生长细胞传代

必须采用酶消化法。常用的消化液有0.05%~0.25%的胰蛋白酶液，0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA（1:2~1:4）的混合消化液，等等

三.培养细胞常规检查

细胞接种或传代后，要定时对细胞做常规检查，如观察培养液pH（颜色变化）、清亮度（是否污染）和细胞生长状态等，随时掌握细胞动态变化，发现异常情况及时对症处理。

1.营养液pH值：新鲜的RPMI-1640培养液呈橙红色（pH7.2左右），适合多数细胞生长。细胞生长旺盛、代谢产生酸性物质积累增多，营养液酸化变黄，pH值下降；若培养瓶瓶塞刷洗不洁，残留碱性物质，致营养液pH值升高，颜色变紫红色。两种变化均对细胞生长不利。采用5%CO2与95%空气混合气体，37℃条件培养细胞，可使培养液pH值在一定时间内保持在pH7.2左右。更换营养液的时间可依靠营养物消耗而定，一般情况下，每周换液两次，每次换半量或1/3量。

2.微生物污染及排除

污染包括微生物污染、细菌污染、霉菌污染、支原体污染、病毒污染（参阅有关参考书）其排除，良好的无菌操作技术是控制污染的基础。污染时首先找出污染原因。针对不同原因有相应的处理方法（在此不详述）。但目前任何处理的方法均对细胞有损伤，所以还应着重污染的预防。

3.细胞交叉污染及排除

由于在细胞培养操作过程中，多种细胞培养同时进行时，器材和培养用液混杂易导致细胞交叉污染。这种污染是细胞形态和生物学特性发生变化，某些变化不易察觉。导致细胞不纯。

防止交叉污染的措施主要有：器材做好专门标记，培养液公用时，吸管使用分开！

4.化学物质污染及排除

主要为残存洗涤剂、细胞残余、解体的微生物等。鼓细胞实验所用全部实验器材都要严格清洗。

5.健康细胞与衰老细胞

光镜下生长状态良好的细胞均质、明亮、透明度大、折光性强，相差显微镜下可以看清细胞的形态结构，细胞质中有粗大的线粒体颗粒和核。在细胞衰老，机能不良时，细胞质中常出现黑色颗粒、空泡或脂滴，细胞间空隙加大，细胞形态变得不规则或失去原有特性。

四.培养细胞的生物学检查和鉴定

一旦培养的细胞生长成为形态上单一的细胞群和细胞系（株）后，无论是使用它进行研究工作，还是做建系（株）工作，都需要全面了解这些细胞的生物学特性。检查项目一般有以下内容：

4.1细胞形态描述

用相差显微镜观察活细胞并摄影，主要观察细胞形态、大小、核浆比例、染色质和核仁大小及多少等。采用盖玻片条培养计数和Giemsa染色法，能简便快速地获得细胞光镜图像特征与电技术结合，可获得细胞亚显微结构图像

4.2细胞定性

用于培养细胞的免疫标志的定性方法有两种：

（1）免疫组化法（2）透射电镜法

4.3 细胞生长曲线

对数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。一般接种7~8组，每组三瓶（亦可用孔板）。每天检查一组，每瓶计数4次，取平均值，再累计三瓶均值，连续计数7~10天。最后用坐标纸汇出逐日细胞数，即得细胞生长曲线。细胞数量增加一倍的时间即细胞倍增时间。

4.4细胞分裂指数MI

细胞分裂指数是指1000个细胞中细胞分裂相的数目。用以表示细胞增殖的旺盛程度。具体操作请参阅有关资料

还有细胞标记指数、细胞DNA定量、细胞周期等

五.相关的实验技术：

5.1 细胞计数：

（1）计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

（2）操作步骤：每小组一块计数板，及盖玻片

①将计数板及盖玻片用酒精棉球擦拭干净，并将盖片盖在计数板，放在镜下观察。

②制备细胞悬液：将细胞从培养板孔或培养瓶中转移到离心管，离心1000转4-5分钟，弃去上清，加入PBS至一定体积（1ML）。

③将细胞悬液吸出少许（10ul）（可将需计数之细胞悬液先吸取0.5ml左右放在 1.5mlEp 管中，再拿离超净台计数），滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

④计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

⑤公式计算：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104

说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而 1ml=1000mm3

⑥注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新稀释制备细胞悬液

5.2台盼兰染色操作步骤：

①制备细胞悬液，放入EP管中。

3分钟。

②以1：1的体积比例在上EP管中加入0.4%台盼兰染液，染色2

~

③吸取少许（一滴即可）悬液涂于载玻片上，加上盖片。

④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。

根据实验需要请参阅相关方法

悬浮细胞传代及细胞计数

一、细胞传代

（一）实验用品：

1．仪器

净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、

倒置相差显微镜、培养箱；

2．器皿

培养板（6孔，96孔）、培养瓶、玻璃长吸管（弯头、直头）、载玻片、

枪头tip、移液管、长滴管胶塞、15ml离心管、离心管架、废液缸、

3．其他物品

微量加样器、细胞计数板、盖玻片、记号笔、

4．试剂

1640培养液、PBS等

（二）实验目的：

掌握细胞计数及悬浮细胞传代技术。

（三）实验原理：见前述

（四）本实验操作步骤：

1.准备：所有实验操作均在无菌环境下进行，需提前30分钟消毒环境

每小组8-9人用一操作台。备96孔板一块，15ml离心管数支，小平皿1块，1.5ml Ep 管一盒，长玻璃滴管，加样器及tip等

打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖（管盖倒放于台上）。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入1.5mlEp管（放于塑料试管架上）备用。

2.从培养箱内取出培养之K562细胞，每组一瓶。放在显微镜下观察其生长状态、密度。

生长状态检测：台盼蓝法

取一滴滴于载玻片上，用台盼蓝染色（见方法），盖上盖玻片，镜下观察

3.观察培养瓶孔中培养液量。用吸管分别吸出瓶中的细胞连同培养液，转入15ml塑料离心管中。再用另一支吸管吸取PBS量约2ml，加入培养瓶中，轻轻吹打瓶壁，吸出转入离心管中，大约总量为10ml左右。

4.离心，设置离心机1000转/分，1-2分钟，沉淀即可。

5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮后转至小平皿中待分装，注意不要污染！

6.吸取0.5―1ML细胞悬液转入EP管中，备计数用（10ul加计数板）。

7.细胞生长曲线观察及细胞冻存

①细胞生长曲线观察

96孔板一块，细胞悬液分别放入96孔板孔中，每孔200ul。

本实验观察四天。见96孔板的一侧标记1,2,3,（代表第二、三、四天），按顺序每排加6孔（即一天有6孔），加三排。（注意未加悬液的空白孔要保证未污染，留作复苏细胞培养用）（具体观察方法见后）

②细胞冻存

剩余细胞转入冻存管中，每组一管，具体方法见冻存操作。

8.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定

（一）实验目的：

1.能独立的进行细胞培养技术操作，绘制生长曲线，了解细胞生长的发育特性。

2.学习在科研中如何应用生长曲线

（二）实验原理：

生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。为精确起见，一般每次计数三平行样品（孔或瓶）细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数对培养时间做图，即生长曲线。

生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数期的1/3-1/2处加药。细胞技术的时间和次数依实验目的而定。

另外，测定生长曲线的常用方法还有MTT法。

（三）实验操作

细胞生长曲线绘制

①每一小组（8-9人） 1 块 96孔板

②细胞悬液分孔前细胞计数数据，为第一天细胞数数据

③传代操作中已做。

96孔板一块，细胞悬液分别放入96孔板孔中，每孔200ul。

本实验观察四天。见96孔板的一侧标记1,2,3, ,（代表第二、三、四天），按顺序每排加6孔（即一天有6孔），加三排。（注意未加悬液的空白孔要保证未污染，留作复苏细胞培养用）

④第二天分别吸取培养板中第一排中 4孔分别计数，再将4孔细胞数平均。

记录下数值，即为第二天细胞生长情况。

⑤第三天重复昨天工作

⑥第四天同④

⑦绘图，了解细胞生长情况，估计细胞倍增时间

。三、哺乳动物细胞冻存与复苏

（一）实验目的：

（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。

（2）减少细胞被微生物污染的危险性。

（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。

（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。

（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。

（二）实验用品：

1.仪器

净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2.器皿

吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸；

吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）

3.其他物品

微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪。

4.试剂

培养液、DMSO（分析纯）

K562细胞，慢性粒细胞白血病细胞系中的一种。

（三）实验原理：

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减

少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

（四）操作步骤：所有操作均为无菌环境中，操作台需提前三十分钟常规消毒

1.哺乳动物细胞冻存

1.1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

1.2.配制冻存液：吸取9 ML培养液放入离心管，用移液枪吸取1ML DMSO溶液，逐滴缓慢加入离心管中。最好把离心管插在冰中。

1.3.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

1.4.观察培养瓶孔中培养液量。用吸管分别吸出瓶中的细胞连同培养液，转入15ml塑料离心管中。再用另一支吸管吸取PBS量约2ml，加入培养瓶中，轻轻吹打瓶壁，吸出转入离心管中，大约总量为10ml左右。

1.5.离心，设置离心机1000转/分，1-2分钟，沉淀即可。

1.6.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

1.7.吸取0.5-1ML细胞悬液转入EP管中，备计数用（10ul加计数板）。

1.8.吸取1ML配制好的冻存液加入离心管，与细胞混匀后，转入冻存管（每小组做1管）。

1.9.标注：标明细胞种类、冻存日期，冻存人。

1.10在4℃冰箱中放置 30 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用冻存盒。

1.11注意事项：

（1）冻存过程需缓慢

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，

可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

（5）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

2.哺乳动物细胞复苏

2.1.准备工作

① 37℃水浴（保温杯类物品）

②准备一个内装5-10 ml 细胞完全培养液15ml离心管

③六孔板一块（四小组可共用）

2.2.细胞复苏操作

①带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持冻存管不断摇动。观察完全解冻后移入超净台。冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

②打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀。

③1000rpm离心数分钟，弃去上清液。

④沉淀中加入适当培养基，放入六孔板中37℃常规培养。

⑤第二天观察生长情况。

2.3.注意事项：

①解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。

②解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，切不可直接用手，以免冻伤。