使用imagepro-plus测量荧光强度
使用imagepro-plus测量荧光强度
如今，使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍，荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋白的表达强度，自然而然的，大家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切片的荧光照片来分析其荧光强度，并以此来表示相应蛋白的表达强度。
非常令人沮丧的是，这个想法是很难实现的。这个网页详细说明了理由。
https://www.360docs.net/doc/959083841.html,/answers/showquestion.asp?faq=36&fldAuto=325
里面的结论是：You DON'T! Image Pro Plus can provide Intensity or Density measurements for any image. However, unless the image acquisitions system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world.
IPP的分析结果与实际情况是有很大误差的，这个误差不是IPP的错，而是在制作样品及拍摄照片的过程中引入的。
所以在介绍使用IPP分析荧光照片的方法之前，首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。这可能比IPP 的操作还要重要。
荧光显微镜拍摄的样品，是使用荧光染料染色的，使用荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光片与荧光滤光片。正确选用滤光片能得到足够强的荧光，但一般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光片，更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵，只能求其次，使用波段相近的滤光片，荧光强度稍低一些。
粗略的选择是：
红色荧光染料，使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。
绿色荧光染料，使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。
蓝色荧光染料，使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。
更精细的滤光片选择，可以参照下表：
https://www.360docs.net/doc/959083841.html,/jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls
在拍摄荧光照片时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照片一样，要确保每张照片的拍摄条件完全一致。先拿一张荧光最强的样品观察调整显微镜。确定相机拍摄的曝光时间。荧光照片的曝光要注意的事项有：
1.使荧光最强的部位不能曝光过度。判断标准是照出的照片在最亮处不能变色。比如绿色荧光照片，当曝光过度时，亮处会变成黄色甚至白色，这就是曝光过度了。过度的曝光会导致测量数值变低。当确定了一个曝光时间后，就必须以这个曝光时间拍摄所有的样品，绝不能使用自动曝光。
2.没有样品的空白部位应是纯黑色。这一点不一定能作到。特别是组织切片，由于样品的散射作用，没有荧光的部位也会显示出一点荧光的颜色的。
3.荧光样品是有荧光淬灭效应的，当把样品放到载物台上后，要以最快的速度选择视野立即拍照。时间越长荧光越弱，其衰减速度与时间的指数相关。这就是导致荧光强度分析误差巨大的最主要原因。
4.使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光照片比普通荧光显微镜效果更好，能够更有效地控制所有照片的拍摄条件保持一致。在条件可能时，尽量使用激光共聚焦显微镜来拍摄。
5.在拍摄细胞爬片上的细胞时，将爬片的细胞层向上，放置在载玻片上，然后再盖上一片干净的盖玻片。很多人喜欢把爬片翻过来放在载玻片上，直接在镜下观察，这样并不好。爬片背面沾的培养液不易擦净，导致图象不清晰。
6.许多情况下，在拍摄一张荧光照片后，还需在同一视野下拍摄一张细胞轮廓的普通光照片。由于没有进行正常染色，这不容易照清楚。有个绝招管用：将显微镜的普通光聚光镜往下降得很低，就能照出较清晰的细胞轮廓照片。
7.由于荧光实际上就是单色光，所以最好使用单色冷CCD作为拍摄相机拍摄12位或16位的灰度图片。不过一般的显微镜现在基本都是使用彩色CCD的。在设备可能的条件下，要拍摄12位或16位的图像。比如Olympus的DP70相机就可以拍摄这样的图片，图片文件会大一点，但对荧光照片的分析是大有好处的。
拍摄完图片之后，在分析之前，还需对图片进行一下转换处理。
荧光图片上，表达最强所对应的是图片上的亮处，背景则是黑色的。这与免疫组化图片正好相反。所以要先把荧光图片作一个黑白反相处理。IPP当然是可以作这件事的。其他的图象软件也都能作。如果使用IPP来Invert contrast，一定要记得Invert之后还要apply contrast一下，否则图片实际上是并没有改变的，它只是显示成了反相。反相后的照片另存到另一个子目录中用于测量，原始照片是必须保留的。
这个反相的照片可以是彩色的，也可以是黑白的。最好转换成黑白的。
下面就可以测量荧光强度了。甚至方法还简单一些：在选色时，只需调整背景强度就行了。先测量一下没有荧光部分的灰度，比如测得背景值是240，那就在光密度校正中选择240作为背景，在HSI选色中只需考虑强度而不必考虑色彩，选择H：0-255、S：0-255、I：0-240。
如果阴性样品的荧光非常弱，常常会导致测量错误：图片上大量没有荧光的样品区域未被计入area 之中，导致阴性样品的测量值偏高。此时需手动选择样品区域，然后测量这个区域的IOD与area，这样最后计算出来的mean density将是一个很小的数。
下面作个实例：
这三张照片，左边一张背景偏绿，中间一张曝光适当，右边一张则是曝光过度了。
荧光照片上经常会有一些明亮的杂点，这对于荧光强度的测量具有极大的干扰，它们必须被除掉。除去它们的方法很多。可以自己想办法。这里使用选色的办法。 在选色窗口里要使用black on transparent显示方法，选择上那些亮斑点后就自然给填上黑色了，然后点create preview image 按纽把图片照下来。
转成灰度图片。
还要作个黑白反相Invert contrast 。反相后一定要再点一下apply contrast。
补充：其实那个菜单最下面的invert image就是直接反相图片的。点那个就行了。
先作光密度较正，如果荧光照片的背景纯黑，0-255就行。
然后选择count/size的测量参数：测量IOD与area。
这张照片的细胞照得挺大，可以把area的过滤值选大一点，filter start为500，这样就有效排除掉了哪些小的杂质点。
另外，还要在count/size的option中把fill holes选择给勾上。
对于灰度图片，选色窗口里只有强度一项选择，0-250就行了。当然，这个值要根据自己照片的情况来定，原则应是选择上所有的细胞。
点count进行测量，然后从view statistics 窗口中读取IOD SUM 及area SUM的数据。
mean density =（IOD SUM）/(area sum)
这就是这张照片上细胞的平均荧光强度值。
要保存count/size 及 segmentation两个窗口的setting file。在测量其他照片时，直接调用这两个设定文件而不必再次去调整那些测量参数。