梅里埃快速病原体检测项目解决方案

梅里埃快速病原体检测解决方案多重呼吸道病原体检测

项目建议书

提供精准快速的病原体结果

流行病数据与现状

呼吸道感染：

呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。呼吸道感染通常由病毒、细菌、非典型病原体等引起，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择对应的治疗方案。呼吸道感染是临床的常见病，其发病具有着明显的季节性：甲型流感在中国北方多出现于每年1-2月，而在中部地区亦可多出现于6-8月，在南方地区则多现于每年的4-6月；而乙型流感则多发于寒冷季节。

中国各个地区流感发病率

表格引自Yu H等“Characterization of Regional Influenza Seasonality Patterns in China and Implications for Vaccination Strategies: Spatio-Temporal Modeling of Surveillance Data”

我国主要的流感病原体是甲型流感H1和H3型以及乙型流感。除了甲型流感和乙型流感之外，其他多种病原体也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、肠病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。急性呼吸道感染的发生同人体免疫力降低有着直接的关系，儿童和老年人都是易感人群。一项针对儿童患者的流行病学研究发现：肠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒是造成儿童急性上呼吸道感染的主要病原体。

引起儿童急性呼吸道感染的致病体

表格引自顾艳红等“儿童急性呼吸道感染夏季和冬季病毒病原学分析”

中国儿童普通感冒规诊治专家共识（2013年）中指出，病毒的病原学地位突出,其中以鼻病毒最常见(30%~ 50%),其次为冠状病毒(10% ~15%)、呼吸道合胞病毒( 5 % ) 、副流感病毒( 5 % ) 、腺病毒( < 5 % ) 和肠道病毒( <5%)等。对于新生儿和低龄儿童，呼吸道合胞病毒具有非常强的传染性和致病性，因此对于呼吸道合胞病毒的爆发和医院感染需要特别的重视；另外由于腺病毒造成的呼吸道感染往往病情较重，所以对于腺病毒感染的快速病原体确认也是十分重要的。

一项2015 年WHO 在12 个国家开展的调查显示，64% 的大众受调查者认为抗菌药物可以用来治疗病毒及病毒感染所导致的流感和普通感冒。常识的缺乏，导致了患者和一些医生，滥用抗菌药物。WHO的统计数据表明，中国真正需要使用抗生素的病人不到20%, 抗生素的不合理使用会引起细菌的耐药性，耐药性往往会导致很多严重感染治疗无效，给患者健康乃至生命造成重大影响. WHO曾发表全球抗菌素耐药性报告称，如果不能迅速采取措施应对这一问题，世界将迈向“后抗生素时代”，呼吁各国加强在抗生素耐药方面的合作。

病原体的明确诊断对于指导有效合理使用抗生素发挥着至关重要的作用, 这是遏制抗生素耐药出现的关键. 抗击抗生素耐药性需要涵盖全方面的临床诊断方案: 微生物鉴定和药敏试验, 感染性疾病筛查和主动监测,疫情管理和监测,细菌以及病毒感染的病原确定和分型. 2016中国儿童流感指南中提出，在流感病人出现症状的48小时之使用奥司他韦（达菲）可以明显提高治疗成功率、缩短病程。非典型病原体，如社区性获得性

肺炎（CAP）中的肺炎支原体（M.pneumonia），需要使用阿奇霉素或者红霉素进行治疗，而不是光谱抗生素。只有快速明确病原体及其药敏结果, 才能够准确的治疗，遏制抗生素耐药性的发生, 从而有效进行抗生素管理，达到精准治疗的目的.

目前呼吸道病原体诊断方法：

目前呼吸道病原体中，细菌通常可以通过传统的培养方法解决，大体上需要24~48小时。非典型病原体，如肺炎支原体，肺炎衣原体等通常采用血清抗体检测，或分子检测。病毒的检测则有所不同，传统的培养，血清学都难以跨越性能和检测种类的限制。2015年儿童流感诊断与治疗专家共识中提出，确认流感病例需要以下1项或1项以上实验室检测阳性者，可以确诊流感：

1，流感病毒核酸检测阳性。

2，流感病毒快速抗原检测阳性，结合流行病学史判断。

3，流感病毒分离培养阳性。

4，恢复期较急性期血清抗流感病毒特异性IgG抗体水平呈4倍或4倍以上升高。

可以看出分子检测（病毒核酸，此处流感病毒为RNA病毒）已经被临床所认可。对于病原体检测来说，传统的培养方法难以解决病毒，结核杆菌的问题。而免疫学检测也存在反应的“窗口期”。PCR检测正好提供了无限的可能。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。并且通过PCR技术可以对病毒进行分型，检出细菌的耐药基因。

最近，多重PCR技术（能在一个样品中检测大量目标）的有效使用带来了全新的检测概念“Syndromic Approach/症候群处置“。这种诊断方式从患者的症状出发，设计

病原物检测的组合，进一步改变了需要一系列单独实验来检测不同病原体的模式，一个样品、一次检测就能对某种感染症状/症候群做出基本的诊断。

多重PCR(multiplex PCR)，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。多重PCR十分适合针对一个样本，同时检测与某种特殊感染性综合症（如脓毒病、脑膜炎/脑炎以及尿道、呼吸道或胃肠道感染）最常相关的一组病原体。

现在的多重PCR大多集中在3~5种靶标的检测，例如流感病毒（分型或不分型）和RSV （呼吸道合胞病毒）的检测目前在FDA就已有数种产品获批。但这些产品检测的病原体数目较少，难以满足临床的要求。随着技术的发展，梅里埃公司的FilmArray产品超过10种靶点的产品获批，能够通过一次检测，基本涵盖呼吸道感染，腹泻，血流感染，脑膜炎等症候群相关的病原体。

多重PCR技术具有以下特点:

?高效性

当临床样本难以获得或样本量有限（例如脑脊液），或当多种不同病原体能导致相同临床表现且临床医师难以判断致病菌时（如呼吸道感染），多重PCR具有更高效率。?灵敏度和准确性

多重PCR能够提高病原体的检出率，并且可以同时检出多重病原体共感染。Matthew 等在2015年Medicine中报道，284名患者中，29.6%的患者存在多种病原体的共感染。

?经济性

多种病原体在同一反应体系中同时检出，将大大的节省时间，简化操作，为临床提供更多更准确的诊断信息。梅里埃公司的FilmArray产品能够在一个小时左右时间提供至多20种靶标的结果。

随着分子技术的不断发展，在呼吸道病原体检测中，PCR尤其是多重PCR将有着广泛的应用前景。

梅里埃FilmArray快速病原体检测解决方案介绍

梅里埃公司和Biofire公司

梅里埃公司创建于1963年，公司依赖自身的科技研究和工业生产资源，始终致力于开发作为医疗和工业用途的体外诊断产品，是体外诊断领域全球排名前十的生产商。集团不断设计、开发、生产和推广应用在临床和工业的系统，同时通过一个又一个成功的并购强大自身。梅里埃的诊断产品主要用于传染病、心血管病、肿瘤病和食品药品微生物四个主要领域的诊断。目前集团共有19个生产基地、17个研究中心以及42个办事处，分布于欧洲、北美洲、亚洲和南美洲。在2014年，梅里埃诊断产品总销售额为16.98亿欧元，公司员工超过9000人。梅里埃公司对中国的卫生事业的发展有着巨大的推动作用作用。2014年主席在访问法国期间，特意莅临梅里埃集团的研发中心，表示了中国对于梅里埃家族对中国卫生事业发展的感。

梅里埃公司于2013年斥资4.5亿美金收购了美国Biofire公司。Biofire公司是世界知名的分子诊断产品供应商，最早进入中国市场的实时荧光定量PCR仪器LightCycler所采用的即是Biofire公司（前身Idaho Technology）的专利技术。Biofire 公司自建立之后，在原有技术上精益求精，不断开发新的技术和产品，在2012年推出

了具有划时代意义的多重病原体快速诊断系统FilmArray以及呼吸道感染检测试剂盒，并获得了FDA的认证。随后相继推出了胃肠道感染检测、血流感染检测、埃博拉检测以及脑膜炎/脑炎检测试剂盒，用于快速准确鉴定病毒、细菌和寄生虫等病原体。同时仍在研发新的仪器和产品，以更好的满足市场的需求。目前FilmArray系统在世界围已经取得了成功，截止到2015年上半年，全球装机量超过1900台。

FilmArray 2.0已于2016年9月成功获得中国食品药品监督总局（CFDA）注册证。

FilmArray产品及原理介绍

FilmArray系统是基于多重巢式PCR技术的快速病原体分子诊断产品，可以在1小时完成超过20种病原体的快速检测。一套完整的FilmArray检测系统由仪器、配套试剂和软件组成。

FilmArray仪器：FilmArray仪器体积小巧，虽然只有普通PCR仪器一般的大小（25.4 x 39.3 x 16.5cm），但是却能够完成更多的实验功能：从标本直接进行核酸提取、纯化、巢式PCR以及高分辨率熔解曲线结果判读。可以说，FilmArray一台仪器完成了过去划分成三个区域的标准分子生物学实验室的所有工作，而且整个过程都是自动化完成，真正实现了“标本进、结果出”的检测模式。最值得称道的是，所有的实验步骤在仪器只需要65分钟时间就可以完成；同传统的核酸提取加上PCR、实时定量PCR、杂交或其他方法相比，大大提高了实验效率，从繁杂的实验中解放了实验室的工作人员。与此同时，这套全封闭的FilmArray仪器，对于工作人员的操作安全提供了最大程度的保证。最新版本的FilmArray2.0系统可以通过一台电脑同时连接8台仪器，在减少单个标本检测时间的同时提高检测通量。

FilmArray试剂：FilmArray系统独特设计的另一个体现就是采用了微流控技术高度集

成化的测试条。如图中所示，FilmArray使用的测试条不同于市面上其他产品，是一种

整合了磁珠, 反应试剂以及反应腔的一体化产品；也正是由于这些看上去不那么简单的

设计，才能够保证待测标本的核酸提取、纯化、扩增、检测依次精确完成。整体反应在

密封的环境中, 保证了实验的生物安全性, 并大大降低了结果污染的可能性；同时干粉

状态的试剂可以在室温下长期保存，无须特殊储存条件。

A

B

A图全新测试条展示；B图不同反应区域展示。新的测试条是没有图中所表示的这些颜色，这些标识的颜色用来说明测试条之中不同的反应区域及其功能。

FilmArray测试条是由塑料薄膜包被的不同反应区域构成的，每个反应区域配合测试条自带的试剂，依次完成核酸提取、纯化、扩增、检测等工作；同时凭借着巧妙地设计，可以保证反应液体在不同区域之间流动以完成整个实验。

1）临床标本的上样：将测试条放入样品加载平台。来自病人的临床标本（呼吸道感染检测为鼻咽拭子标本）经过简单的洗脱之后，从样本端口被注射入测试条。

同时从测试条另一端的缓冲液端口加入溶解缓冲液以溶解测试条干粉状态的反应试剂。随后将测试条放入仪器进行测试。整个测试条准备过程十分简单，只需要２分钟的时间。

2）核酸提取：注入测试条的标本，同核酸提取区的瓷珠混合，在仪器过不断地搅动以破碎细胞，释放核酸（DNA+RNA）。

3）核酸纯化：上一步中破碎后的样本进入核酸纯化区域，同可以结合核酸的磁珠结合，经过洗脱、溶解之后完成核酸纯化过程。

4）反转录及第一阶段PCR：经过纯化的DNA和RNA进入到第一阶段PCR反应区域。首先经过一个快速的反转录过程, 将RNA转变成为cDNA，之后开始进行第一阶段的多重PCR反应。第一阶段PCR反应涉及到了超过50种引物,

扩增较长的DNA片段。

5）第二阶段PCR及熔解曲线检测，第二阶段PCR反应发生在蜂巢形状的阵列中（共102孔）。而这种测试条的设计也正是FilmArray系统命名的来源，Film （塑料薄膜）+Array （检测阵列）=FilmArray!

第一阶段PCR的产物在经过稀释后，做为第二阶段PCR的模板进入阵列。每

个阵列孔之中已经预埋了一对引物，用于特异性检测每个待测靶标。每个PCR 体系的体积只有1微升，所以可以保证很高效的完成温度变化过程，以保证实验的快速。第二阶段PCR体系中除了带有PCR反应必须的引物、模板、dNTP 和聚合酶等，还带有可以结合在双链DNA上的荧光染料LCGreen。第二阶段PCR是巢式PCR，即特异性扩增第一阶段扩增得到的待测靶标DNA片段侧的序列。在所有的PCR循环结束之后，通过升温以监测各个体系荧光信号水平的变化，从而判读各PCR产物的熔解温度。

结果的判读：上述获得的熔解温度数据反馈到FilmArray软件中，同数据库中的标准熔解温度进行比对，只有那些出现了熔解峰且熔解温度正确的测试才会被判读为阳性结果。每个靶标的测试都会进行三个重复，体现在检测阵列的不同位置的三个孔中。只有三个重复测试中2个以上的测试结果为阳性，最终结果才会被判读为阳性。高分辨率熔解温度的判读再次提高了结果的特异性。

不同靶标具有不同的熔解温度

每个待测靶标在阵列中的不同位置进行3个重复实验

对照实验：为了能够检测实验结果、保证实验的可靠性，FilmArray系统设计了2个控实验。第一个控参考品是Schizosaccaromycespombe提取的RNA，从反应第一步就同标本一同进入测试条，从头完成了所有的反应过程；如果在最后的检测中成功检测到了其正确的熔解曲线峰，则证明全部实验是可靠的。第二个控品预埋在第二阶段PCR

的阵列中（已知模板和引物），如果最后能够检测到其正确的熔解曲线峰，则证明第二阶段PCR反应是可靠的。

FilmArray软件：FilmArray软件负责控制仪器、分析数据、提供测试报告。最新版本的软件可以同时控制8台FilmArray 2.0版本仪器进行测试。可以通过条形码扫描仪轻松的输入标本信息以及测试条信息，在反应结束之后可以自动打印测试报告。测试报告会列出每个检测项目的判读结果，阴性（Not detected）或阳性（Detected），从而给出测试的准确诊断。软件系统可以存储至多8000条测试信息，同时可以存档、导入、导出历史测试报告，进行方便的数据库管理和数据溯源。

以呼吸道感染测试为例展示FilmArray测试报告。每个待测靶标的检测信息都会被列在报告中并标明检测结果。

此外相比其他目前在用方法，FilmArray系统能够为您提供以下技术和使用优势：

1）使用便捷：只需要2分钟手工操作，无需单独的核酸提取，无需配置复杂的PCR反应体系。同时为实验室节省空间，无需搭建分区的分子生物学实验室。

2）快速报告：测试条在仪器的测试时间不超过65分钟，也就是可以在一小时左右报告检测结果，同现有其他方法相比大大提高了实验效率。并且可以实现7天24小时的病原学报告，真正满足临床急诊及重症监护（ICU）对于快速病原学结果的需求。

3）避免污染：试剂和仪器都是封闭系统，无需外接水源和试剂，避免了传统PCR实验室在核酸提取、扩增过程中可能带来的操作污染，避免了不必要的医疗风险。同时也大大提高了实验室生物安全性。

4）使用灵活：同一台电脑可以连接1-8台FilmArray仪器。可以满足不同通量需求。

5）体积小巧：FilmArray系统便携性强，易于组装、拆卸。对于现有实验室空间有限的情况，可以灵活进行安排。无需大功率的电源配置，简单的UPS设置就可以满足检测的续航需求。

6）测试广泛：呼吸道病原体测试条涵盖广泛，可以同时检测包括17种病毒和3种非典型病原体/细菌在的20种病原体。可以快速对甲流进行分型（H1，H1-2009，H3）。此外已经获得针对呼吸道感染、胃肠道感染、脑膜炎/脑炎多种测试的FDA 和CE认证, 后续应用前景广泛。

7）试剂储存方便：由于所有的反应试剂都是以干粉形式保存在测试条中，所以测试条可以常温保存。十分方便储存，无需占据低温储存空间。

8）单靶标成本低：目前使用的分子检测方法，单靶标的核酸提取和扩增的总成本不低于100元（其他方法，如胶体金，虽然成本较低但是灵敏度、特异性却差很多），对于20种左右的病原体检测成本不少于2000元，且操作复杂，耗时长。且能够满足更多病原体检测需求。

FDA临床数据：

呼吸道感染测试的FDA临床数据：

病原体的实验对照方法为一组/两组PCR及双向测序或者直接荧光抗体检测方法（DFA）

临床应用

提高病原体检出率：

FilmArray呼吸道感染测试条包含了17种病毒靶点和3种非典型病原体/细菌靶点。相对于传统的金标快检，直接免疫荧光（DFA）等检测方法，可以检出更多的病原体种类。并且，灵敏的多重巢式PCR(nmPCR)技术，能够进一步提高病原体的检出率，不会有抗体检测的『窗口期』问题。

Hammond 等. - 2012 - Respiratory virus detection in immunocompromised Patients

快速的周转时间：

对于急诊和危重症患者来说，快速的检测结果意味着精准的治疗。在2013年西雅图儿童医院的一项研究中，使用FilmArray后，呼吸道病原体的平均报告时间从7小时显著降低到了1.6小时。这使得大约45%的流感症状患者患者(44名)在急诊室的过程中

就得到了检测结果。大约81% (79/96)的流感阳性患者接受了达菲治疗（达菲需要在48小时使用效果最佳）。可以看出快速的病原学结果能够帮助急诊科医生对患者进行快速的分流和处置。

Xu 等. - 2013 - Implementation of filmarray respiratory viral pane

促进抗生素管理：

传统的经验性诊疗，难以满足现有精准医疗的需求。尤其是现在抗生素耐药以及多重耐药菌的问题日益严重，使得依赖抗生素的治疗更加受到不断挑战。快速的病原体诊断，尤其是病毒和非典型病原体检测方法的不断进步，使得抗生素管理得到了支撑。Rogers 等发现，在抗生素处方率没有改变的同时，使用FilmArray后抗生素使用的天数下降(缩短0.4天（3.2 -> 2.8天）; P < .003).

Angela R. Branche等，进行了FilmArray和PCT的联合研究，在151名干涉组患者中，部分PCT< 0.25 μg/mL 和病毒阳性的患者，抗生素使用时长和用量明显降低；和历史数据对比(from 2008–2011), 在非干涉组抗生素使用时长少2天(6.0 vs 4.0 days; P < .001), 体现出了研究的效果. 由此我们可以看出快速精准的病原学检测结果可以更好的满足临床现在对于抗生素管理的需求。

完善的售后服务体系