Southern印迹杂交
Southern印迹杂交
实验原理
核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如AP T、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
实验方法
本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、待测核酸样品的制备
（一）制备待测DNA
基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
（二）DNA限制酶消化
基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。
消化DNA后，加入E DTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品
（一）基本原理
Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。
在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。
琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛作用。在相应的电泳缓冲液中，DNA在电场的作用下由负极向正极泳动，分子越大，泳动速度越慢；反之，分子小则泳动速度快，而大小相同的分子则泳动速度相同。因此在恒定的电场下，经过一段时间电泳后，DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。在制备凝胶和电泳过程中需要注意的几个问题是：第一、尽可能在使用之前配制新鲜凝胶；第二、如果使用的胶比较薄，铺胶后1h内使用；第三、胶中不要含有E B，否则会引起非特异性背景；第四、电泳结束后用1μg/ml的E B染色，然后用水脱色（如果胶里含的是RNA，则使用无RNA酶的水），以保证核酸的完整性。
（二）基本步骤
1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。
DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见下表：
表4－1 不同条件下上样本的使用指针比较表
一般而言，对地戈辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5μg人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA 更复杂（如植物DNA）则上样量可达10μg；每道上质粒DNA<1ng。
2. 分子质量标志物（DIG标记）上样。
3. 电泳，使DNA条带很好的分离。
4. 评价靶DNA的质量。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlE B染色15-30min，紫外灯下观察凝胶。
三、电泳凝胶预处理
（一）原理
DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性P H的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
（二）基本步骤
1. 如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理。
(1) 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
2. 如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
(1) 把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
(3) 把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，P h7.5，1.5mol/L NaCl），室温2×15分钟。
(4) 在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。
四、转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。
用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见下表：
表4－2 各种尼龙膜性能及使用情况比较表
常用的Southern转膜方法有以下几种：
（一）细管虹吸印迹法
此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：
容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：
1．20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2．凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3．照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5．尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
7．以下方法把DNA固定在膜上：
（1）紫外交联：
1）把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上
2）把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟。
3）在无菌双蒸水中浸润膜。
4）空气中凉干膜。
（2）干燥：
1）在2×SCC中短暂洗膜。
2）120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。
（二）电转移法
此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。但应用这种方法需注意：不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物；应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高；转移缓冲液不能用高盐缓冲液，以免产生强电流破坏DNA。
具体步骤如下：
1. 将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
2. 准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE 中。
3. 依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中，各层之间不能有气泡滞留。
4. 将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
5. 尼龙膜一侧置正极，凝胶一侧置负极，300～600mA恒流，4～8h，循环水冷却或置冷室中。
6. 电转移完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，用干燥滤纸吸干，80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。（三）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的因相支持物上——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需30～60分钟。但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表
五、探针标记
用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。以下为P romega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：
（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二）在另一个0.5ml离心管中加入：
Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μl
dNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μl
BSA(小牛血清蛋白) 2μl
[α-32ρ] dATP3μl
Klenow酶5U
（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。室温或37℃1h.
（四）加50μl终止缓冲液终止反应
标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比
活性最好大于1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）
将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
具体步骤如下：
（一）配制预杂交液
6XSSC
5XDenhardt’s试剂
0.5%SDS
50%(v/v)甲酰胺
ddH2O
100 ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入
注：1. 每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2. 预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3. 当使用32P标记的Cdna 作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4. 按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC 含量为40%，则Thyb为42℃。）
（二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。
（三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10m l2×SSC浸湿滤膜。
（四）将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
（五）从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。
（六）加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。
（七）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.
七、S outhern杂交
（一）原理
转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DAN分子），
即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
（二）步骤
1. 将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
2. 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。
3. 尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。
5. 置42℃水浴温育过夜（至少18h）。
八、洗膜
取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min
1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min
0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min
0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min
0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min
采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC 中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
九、放射性自显影检测
（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。
（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。
（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。
（注：注意同位素的安全使用）
实验结果及注意事项
在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题：转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性
若用到有毒物质，必需注意环保及安全
蛋白免疫印迹杂交技术手册
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。 本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制
WB概述:检测原理 Western Blot过程示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 孵育1小时或过夜 孵育一抗 孵育1小时或过夜 孵育酶标二抗 1小时 洗膜 3×5min/1×10min 孵育底物（如为显色法，则直接孵育至显色即可） 1min 胶片曝光显影 1-30min
A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 细胞裂解操作方法： 1. 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）； 2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask）； 3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中； 4. 4℃摇动30 min； 5. 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）； 6. 弃沉淀，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本； A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解； 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；
Southern&northern&western杂交原理
Southern杂交 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 Western杂交 原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤
原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
southern
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量
实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定 的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针 在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后， 经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来 印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方 法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化 学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中 某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性 片断长度多态性分析（RFLP）等。
northern印迹杂交
northern印迹杂交 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern 印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。 <1>试剂： 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。 5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 <2>步骤： [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 [2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。 [3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 [4]55℃加热15min，冰浴冷却。 [5]加2ml5×载样缓冲液。 [6]上样、同时加RNA标记物。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放
射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位
Northern杂交技术
Northern blot技术 经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳 这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体： 6mol/L乙二醛 5.4μl DMSO 16.0μl 0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl RNA（多达10μl） 5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－2 0℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RN A进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。 2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。 3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的R NA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经D EPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。 4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2 366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。 乙二醛－DMSO凝胶加样缓冲液 50％甘油
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告 姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生 实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤 【实验目的】 学习核酸杂交的基本过程和操作 【实验原理】 将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】 1、基因组DNA的限制性内切酶酶切 取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。总体积20μL。37℃保温1.5小时。 2、1％琼脂糖电泳 先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。 ①基因组DNA10 20μl （自己的） ②基因组DNA10 μg（老师的） ③酶切样品 ④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl) ⑤酶切样品 ⑥基因组DNA10 μg （老师的） ⑦基因组DNA10 20μl （自己的） 插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。 3、变性 切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺） ①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。 ②ddH2O洗2次。 ③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。 4、转移 ①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。 ②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。 ③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。 ④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的 滤纸，赶走气泡。 ⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。 ⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。
四种分子杂交的原理及方法
Southern杂交 基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern 印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 下面以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 步骤：一、待测核酸样品的制备 （一）制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 （二）DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA 后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
Southern杂交实验
Southern 杂交实验 Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 一、溶液配制 (1)20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠 NaCl 175.32g 柠檬酸钠88.26g NaOH调PH值到7.0，高温高压灭 (2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (4)检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
原位杂交的方法
原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。
地高辛标记探针的Southern 杂交
地高辛标记探针的Southern杂交 1.探针标记(20μL体系)： 1)将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4μl至变性DNA管，混匀并离 心； 4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）； 5)停止反应，加2μL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用 将于-20o C冰箱保存。 2.探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记 产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释 表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA1h20h 10ng45ng600ng 30ng130ng1050ng 100ng270ng1500ng 300ng450ng2000ng 1000ng850ng2300ng 3000ng1350ng2650ng
表2探针DNA及Control DNA系列表 Tube DNA(μl)From Tube#DNA dilution buffer(μl) Dilution Final concentration 1Diluted orginal 1ng/μl 2211981:10010pg/μl 3152351:3.33pg/μl 452451:101pg/μl 553451:100.3pg/μl 654451:100.1pg/μl 755451:100.03pg/μl 856451:100.01pg/μl 90-50-0 1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜； 2)120o C固定30min或紫外交链3-5min； 3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min； 4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min； 5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min； 6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min； 7)在10mL Detection buffer平衡2-5min； 8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到 5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡! 9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析 1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、 小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。 (1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大 (2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作 (3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。 2、核酸质量对southern杂交实验的影响 答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。 上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。根据 不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。基因组越大，上样 量越多。例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。回收会有损失，最多能 损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的 基因组DNA。（以上上样量均为一个泳道） DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0， OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。同时，需要对 DNA 样品进行琼 脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。（如图所示）
3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？ 答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标 记物太少，会导致发光信号减弱。 (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组 序列的同源片段低于30%。 (3)、ATGC含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。
southern blot 杂交
Sourthern 杂交 （1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h以上；d）65℃水浴10 min终止反应。 （2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。 （3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA固定交联到尼龙膜上。 （4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6×SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，
southern杂交实验方法和步骤
southern杂交实验方法和步骤 一、主要仪器： 离心机 恒温水浴锅 Orbital shaker恒温摇床 Poner PAC300核酸电泳仪 VersaDoc凝胶成像系统 水平摇床 HL-2000Hybrilinker分子杂交仪 烘箱 二、主要材料 whatman3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板 三、主要试剂 RNase A 真菌基因组提取试剂盒 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DNA Maker NaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸 四、试剂准备 变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl； Southern blot中和液：0.5mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5mol/L NaCl； 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0； 2×SSC：取100mL20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L； 2×SSC+0.01%SDS：取100mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L； 0.5×SSC0.01%SDS：取25mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L； 洗涤缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH7.5，0.3%（v/v）Tween20； 马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5； 检测缓冲液：0.1Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5；