细胞分离常用方法
细胞分离常用方法
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的TD4A低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。
二、实体组织材料的细胞分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
(一)机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。
(二)消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
1、酶消化分离法
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：
(1)胰蛋白酶分散技术
胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。
②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH 和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。
该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。
③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。
⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。
⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。
分离方法如下：
①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：
热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。
冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。
先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。
(2)胶原酶(Collagenase)消化法
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。
鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性(见表4-1)和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异(见表4-2)，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
项目胰蛋白酶胶原酶
消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织
用量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL(200u/mL)
消化时间 0.5～2小时(小块) 1～12小时
pH 8～9 6.5～7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清、钙、镁离子有影响无影响
表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5～1cm3)
酶种类较硬组织软组织
4℃室温 37℃ 4℃室温 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1
胶原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
两者联合(对冲) 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2
除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分离法的操作步骤：
(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。
(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。
(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。
(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。
(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
实验室常用器材使用方法及注意事项
实验室常用器材使用方法及注意事项
实验室常见仪器使用方法及注意事项 一、常见的仪器 （一）初中化学实验常见仪器 反应容器可直接受热的：试管、蒸发皿、燃烧匙、坩埚等能间接受热的：烧杯、烧瓶、锥形瓶（加热时，需加石棉网） 常存放药品的仪器：广口瓶（固体）、细口瓶（液体）、滴瓶 （少量液体）、集气瓶（气体） 用加热仪器：酒精灯 计量仪器：托盘天平（称固体质量）、量筒（量液体体积） 仪分离仪器：漏斗 取用仪器：药匙（粉末或小晶粒状）、镊子（块状或较大颗粒）、胶头滴管（少量液体） 器夹持仪器：试管夹、铁架台（带铁夹、铁圈）、坩埚钳其它仪器：长颈漏斗、石棉网、玻璃棒、试管刷、水槽 不能加热：量筒、集气瓶、漏斗、温度计、滴瓶、表面皿、广口瓶、细口瓶等 1、试管 （1）、用途： a、在常温或加热时，用作少量试剂的反应容器。 b、溶解少量固体。 c、收集少量气体的容器 d、用于装置成小型气体的发生
器。 （2）、注意事项： a、加热时外壁必须干燥，不能骤热骤冷，一般要先均匀受热，然后才能集中受热， 防止试管受热不均而破裂。 b、加热时，试管要先用铁夹夹持固定在铁架台上（短时间加热也可用试管夹夹持）。 试管夹应夹在的中上部（或铁夹应夹在离试管口的1/3处）。c、加热固体时，试管口要略向下倾斜，且未冷前试管不能直立，避免管口冷凝水倒流 使试管炸裂。 d、加热液体时，盛液量一般不超过试管容积的1/3（防止液体受热溢出），使试管与桌面 约成45°的角度（增大受热面积，防止暴沸），管口不能对着自己或别人（防止液体喷出伤人）。反应时试管内的液体不超过试管容积的1/2。 2、烧杯用途：①溶解固体物质、配制溶液，以及溶液的稀释、浓缩 ②也可用做较大量的物质间的反应 注意事项：受热时外壁要干燥，并放在石棉网上使其受热均匀（防止受热不均使烧杯炸裂）， 加液量一般不超过容积的1/3（防止加热沸腾使液体外溢）。
实验一 植物细胞的质壁分离及死活鉴定
实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。
乳鼠心肌细胞原代培养综述
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
分子生物学实验室常用仪器及使用方法
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
Primary human/mouse lung fibroblast isolation 人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法 参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente) Materials: 材料： 1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution, 2.5mg/ml (HBSS); b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS) 消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml） b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml） 2. Nylon filters 40/70 μm 3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B) 4. Knife (disposable) 5. Syringe 6. PBS Digestion solution: Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13) 步骤： 1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl = 1:4:5, 100ul/10g weight; 称重小鼠后麻醉 2. Inject and wait 10min till the mouse sleep 腹腔注射后等待10分钟
成年大鼠心肌细胞分离方法
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的
细胞的质壁分离
观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。
心肌细胞分离方法
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离 其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内 残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙 台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入 新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。 另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
实验室常用蒸发浓缩方法
实验室常用蒸发浓缩方法 氮吹仪 原理：将氮气快速、连续、可控地吹向加热样品的表面，使待处理样品中的水分迅速蒸发、分离，实现样品无氧浓缩。 应用：农残分析，药物筛选，液相、气相、质谱分析前处理。 优点： 干燥速度快 缺点： 样品温度高 样品处理量少 存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱中操作 需要消耗氮气，增加额外成本 可燃溶剂存在爆炸危险 整个过程需要监控 旋转蒸发仪 原理：基本原理即是减压蒸馏，可降低液体的沸点，那些在常压蒸馏时未达到沸点就会受热分解、氧化或聚合的物质就可以在分解之前蒸馏出来，“旋转”可以使溶剂形成薄膜，增大蒸发面积。另外，在高效冷却器（一般是冷凝管）作用下，可将热蒸汽迅速液化，加快蒸发速率。 应用：萃取液的浓缩，有机物提取，色谱分离接收液的蒸馏。 优点： 蒸发速度相对较快 样品量大 控制水浴温度可控制热量输入 真空度可控制 整个过程可见，好控制 缺点： 只能处理单一样品 需要清洗玻璃装置 密封件寿命有限，需要定期更换 样品会泄露到空气中，造成污染
离心浓缩仪 原理：负压降低溶剂沸点，冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行，离心力可保证样品沉积在管底，不会产品气泡和交叉污染。 应用：DNA/RNA的浓缩，药物代谢物的浓缩，液相色谱的前后处理，免疫球蛋白的浓缩等。 优点： 安全 样品处理量大 多种离心管可选择 样品沉积在离心管底部，好回收 最大程度减少发泡与交叉污染 可通过红外方式提高加热效率 精确控制真空度 蒸发温度低 可通过编程实现多组分分离 缺点： 速度较慢 蒸发过程可见程度有限 冷冻干燥机 原理：预冻样品中的水分，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行。 应用：菌种、疫苗、蛋白、核酸、药物等对温度和氧敏感性生物样品的干燥，冻干后的样品易于保存和运输。 优点： 安全 水分去除率非常高
肺成纤维细胞分离
【摘要】目的：建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法。方法：采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophage,AM）, 并进行原代培养。用波形蛋白(Vimentin)、CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果：所得细胞产量大、纯度高。细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性；AM细胞则相反。扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛，细胞间连接成网状，蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达。结论：该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）的发病机制及治疗方法的体外研究。 【关键词】大鼠; 肺成纤维细胞; 巨噬细胞; 原代细胞培养 ［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划项目（03KJD320076）;镇江市社会发展科技计划项目（SH2004043） Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats Y AN Yu-lan, LIU Yang, BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian, ZHENG Jin-xu (Department of Respiratory Medicine, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medicine，Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China) ［Abstract］Objective: To develope a reliable method for isolation, purification and primary culture of lung fibroblast(LF) and pulmonary alveolar macrophage(AM) from rat for studies on pathogenesis and treatment of interstitial lung disease in vitro. Methods：The lung tissue of 2 days old immature rats was digested with trypsin.LFs and AMs were isolated and purified, then cultured. The nature of the cultures was identified by CD14 staining, vimentin staining, electron micrography and Western blot. Results：Excellent yields of highly purified, culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively. The expression of CD14 in AMs was positive and that of vimentin negative by immunofluorescence chemistry. Those, however, in LFs were just opposite. Ramified stracture between purified LFs were observed by ultrastructural examination under electron micrography.Vimentin in purified LFs was revealed by Western blot. Conclusion：This technique might be a reliable method for isolation and purification and primary culture of pulmonary alveolar macrophages and lung fibroblasts from rat lung and could be used for the study of interstitial lung disease ［Key words］lung fibroblasts; immature rat; pulmonary alveolar macrophage; primary cell culture 原代培养又称初代培养, 是自供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞来源于刚刚离体的组织和细胞, 其生物学特性未发生很大变化, 仍具有二倍体遗传特征, 最接近和反映体内生长特性, 对研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化的机制具
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的
观察植物细胞的质壁分离和复原
实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页
二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法 原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基 二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。 方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于 0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。 评述： 1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切 纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。 2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制 PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA 扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。 因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 3、清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑150ul-200ul 二步法精斑100ul 毛根10ul 烟头30-50ul 4、对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一 段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH
原代细胞培养之--细胞分离技术
原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术