密度梯度制备仪 wen

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度

制

备

仪

迈可诺技术有限公司

密度梯度离心实验中必不可少的设备——密度梯度制备仪

密度梯度分离方法是分离生物小分子常用的方法，广泛用于病毒的分离纯化、亚细胞器、蛋白质、质粒DNA、RNA等的分离，其最显著的特点是获得样品的纯度高。

密度梯度离心实验包括梯度制备、离心分离、样品收集三个主要步骤，其中离心分离部分由超速离心机完成，而梯度制备和样品分离，现阶段仍然处于人工操作的阶段，这两个步骤的共同特点是操作繁琐、耗用时间长、人工操作、重复性差。这是很多实验操作者共同的烦恼，也是超速离心法的一大瓶颈，即梯度线性差、样品收集难。

全自动密度梯度制备和分离系统可以很容易解决这一问题。

Biocomp全自动密度梯度制备仪特点：

1、快速高效，最快1min内完成6个离心管样品的均一线性梯度制备。

2、内置程序，自动设定梯度制备转速、时间、角度，可连接电脑实现上传下载梯度制备程序。

3、手动编程，根据实验条件编辑各种梯度制备程序，可储存备用。

4、记忆功能，自动记忆最近使用的10种梯度程序，直接进入，避免参数的重复设置。

5、适用广泛，可用于各类溶液的梯度制备，包括SOUCROSE、GLYCEROL、OPTIPREP、NYCODENZ、FICOLL、PERCOLL、METRIZAMIDE、RENOGRAFIN、NaCl、CsCl、KCl等梯度介质。

全自动密度梯度分离全流程：

Biocomp自动密度梯度分离器

传统手工分离和新时代分离方法对照表：

离心技术

离心技术离心技术是根据颗粒在匀迷圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。 1．用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。 2．用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。一、基本原理 1．离心力Centrifugal force (F) F=mω2r ω：旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm) m：颗粒质量 2．相对离心力Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力／F重力 = mω2r/mg= ω2r/g g为重力加速度(980．70g/sec2) 同为转于旋转一周等于2π弧度，因此转子的角速度以每分钟旋转的次数(每分钟转数n 或r/min)表示：一般情况下，低速离心时常以r／min来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。用“X g”表示每分钟转速可以真实反映颗粒在离心管不同位置的离心力。Dole&Cotzias 制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图(图2—15)。 3．沉降系数Sedimentation coefficient (S) 当转子内样品绕着旋转轴离心时，样品沉降率是由样品颗粒的大小、形状、密度和溶剂的粘度、密度以及离心加速度决定的，在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示： S：是指单位离心场中粒子移动的速度。 S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。 S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒，1S二1×10-13秒。对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S 也常保持不变。文献中常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。二、离心设备离心技术所使用的设备是由离心转子、离心管及附件等组成。 (一)离心机 1. 低速离心机一般最高转速在6000r/min以下。实验室中常用于分离制备。 2．高速离心机带有能够冷却的离心腔制冷设备，这类离心机的速度控制比上述的低速离心机来得准确，工作时的实际速度和温度可通过仪表显示；配有一定类型及规格的转子，可根据需要选用。此类离心机的最高转速在25000r／min以下，常用于生物大分子的分离制备。

混凝土及砂浆试模校验方法

混凝土及砂浆试模校验方法本方法适用于新购和使用中的各种混凝土、砂浆试模的校验 2.21.1 技术要求 2.21.1.1组成模腔的各平面应刨光，其不平度应不大于0.05mm。 2.21.1.2 承压面与相邻面的不垂直度不应超过± 度。 2.21.1.3 模型的内部尺寸试模尺寸（mm） 100 边 100 X 100 X 100 0.2mm 150 x 150 X 150 150 0.2mm 200 X 200 X 200 200 0.4mm 100 X 100 X 300 100 0.2mm 0.5

100 X 100 X 400 100 ±0.2mm 150 X 150 X 300 150 ± 0.2mm 300 ±0.4mm 150 X 150 X 550 150 ± 0.2mm 550 ±0.4mm 100 X 100 X 515 100 ± 0.2mm 515 ± 0.4mm ① 175 X 185 X 150 175 ±0.2mm 185 ±0.2mm 150 ±0.2mm 70.7 X 70.7 X 70.7 70.7 ±

0.2mm 70.7 X 70.7 X 230 70.7 ±0.2mm 230 ± 0.4mm ①70 X 100 X 61 （水泥胶砂流动度试模）70 ±0.2mm 100 ±0.2mm ±0.2mm 61 ①36 X 60 X 60 （水泥净浆流动度试模）36 ±0.2mm 60 ±0.2mm ±0.2mm 60 ①152X 170 （承载比试筒）152 ±0.3mm 170 ± 0.3mm ①100X 180 （无侧限试模） ±0.2mm 100 180 ± 0.3mm ①50 X 130 （无侧限试模）50 ±0.1mm 130 ±

密度离心法(精)

密度离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点： ① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。等密度离心法 1．原理等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr／dt 为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。2．注意点： ①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头 ③粒子密度相近或相等时不宜用 ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 ⑤不能用刹车四、梯度溶液的制备 (一)梯度材料的选择原则： 1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH 变化较小。 3．不会对离心设备发生腐蚀作用。 4．容易纯化，价格便宜或容易回收。 5．浓度便于测定，如具有折光率。 6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。 (二)梯度材料的应用范围下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

密度梯度离心法分离PBMC操作流程

密度梯度离心法分离PBMC 1.在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。 2.取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。 3. 水平离心400g×30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。） 4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。血浆和PBS 单个核细胞淋巴细胞分离液红细胞和粒细胞 5.去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。 6.末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。 7. 加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

8. 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95％以上。注意： 1.所有操作都应在无菌条件下进行。 2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。 3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。

核酸提取经验整理

一、核酸核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。二、核酸的分类和功能核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。四、细胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

(CsCl 密度梯度离心法)

中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床 350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期） 2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。） 3.室温离心5,000rpm，5min。弃上清，控干。 4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。） 5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久） 6.加7mL P3。（P2和P3之间反应时间不要超过5min。混匀后可见絮状沉淀。该步若置于冰上，沉淀效果更好。但位于室温的反应以足以达到实验需要。）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。 7.室温（4度更好，但没有必要。）离心，10,000 rpm, 5min。 8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于 4度。若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。（分子克隆p35） 9.室温离心10,000rpm 15min。 10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。 11.3,000 rcf离心3min，弃上清。（可以不要非常完全控干） 12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000 rcf 3min离心，弃去不溶物质。 13.往2mL超速离心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷纸把枪头外壁的EB擦干。（将外壁的EB擦干是为了防止EB残留在离心管的管口。） 14.将DNA移至2mL超速离心管中,并用H2O将体积补至2mL。（此时，溶液的密度为3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。） 15.配平至对称管重量差<0.02g，封口。（该步配平时，可按1ulH O重0.001g来补加H2O进行配平以缩短时间。）在封口 2 后，上下颠倒混匀。 16.打开超速离心机，按Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。（该步为149,000rpm 2h 升速max 降速 6。） 17.按Vacuum 至真空度<400后按 Start。（不等真空度至<400其实也可启动，但这可能将造成离心机反复升降速，故制定此规则。）等升至最大转速后才能离开。（该步为离心机安全操作必须，请务必做到。） 18.2h后，取出转头，离心管。若转头内有液体需将其洗净，擦干。（因为此时泄漏的液体含有EB，因此需要将其洗净，擦干。） 19.先用8号针头在离心管上部插个洞，再用1mL注射器抽出所需的红色DNA条带至1.5mL离心管中。 20.加入1mL水饱和正丁醇，上下颠倒混匀（勿用振荡器）约20下。（或更多，使上部液体尽可能变红。）将 1.5mL管置于离心机中，按Short键 5秒，松手。弃去上层液体。（离心的目的是为了加速液面分层，因此也可省去。） 21.重复20步2-3遍，至下层看不到红色后再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是为了确保EB完全去除。） 22.往溶液中补加等体积的H2O，平均分成若干管，使每管终体积为400ul。往每管中分别加入1mL(2.5 倍体积)无水乙醇，颠倒混匀。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。）23.加1mL预冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去21步中管壁上残留的部分含CsCl的液体。） 24.加400ul H2O或TE溶解。（对于高拷贝质粒，45mL菌液将获得500-1,500ug左右质粒。）

5-3水平灰缝砂浆饱满度检查记录

水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：001 电土施表5—3 注：1、砖砌体、加气混凝土砌块和轻骨料混凝土砌块的砂浆饱满度≥80%，混凝土空心砌块的砂浆饱满度≥90%，每处测3块砖，取其平均值。

2、本表由施工单位填写，监理单位、施工单位各保存一份。水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：002 电土施表5—3 注：1、砖砌体、加气混凝土砌块和轻骨料混凝土砌块的砂浆饱满度≥80%，混凝土空心砌块的砂浆饱满度

≥90%，每处测3块砖，取其平均值。 2、本表由施工单位填写，监理单位、施工单位各保存一份。水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：003 电土施表5—3

注：1、砖砌体、加气混凝土砌块和轻骨料混凝土砌块的砂浆饱满度≥80%，混凝土空心砌块的砂浆饱满度≥90%，每处测3块砖，取其平均值。 2、本表由施工单位填写，监理单位、施工单位各保存一份。水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：004 电土施表5—3

注：1、砖砌体、加气混凝土砌块和轻骨料混凝土砌块的砂浆饱满度≥80%，混凝土空心砌块的砂浆饱满度≥90%，每处测3块砖，取其平均值。 2、本表由施工单位填写，监理单位、施工单位各保存一份。水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：005 电土施表5—3

注：1、砖砌体、加气混凝土砌块和轻骨料混凝土砌块的砂浆饱满度≥80%，混凝土空心砌块的砂浆饱满度≥90%，每处测3块砖，取其平均值。 2、本表由施工单位填写，监理单位、施工单位各保存一份。水平灰缝砂浆饱满度检测记录工程名称：烟气脱硫工程编号：006 电土施表5—3

超离心技术简介

超离心技术简介超速离心机的离心速度为每分钟60000转或更多，离心力约为重力加速度的500000倍。在操作技术上，最常用的是差速离心和密度梯度离心。前者是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。欲分离沉降系数接近的物质，则广泛使用密度梯度离心法。这种方法使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的比重平衡在相应的溶剂密度中形成区带。一、差速离心差速离心是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心速度较低，较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。原理：不同沉降系数的组分在不同的离心速度下沉降的速度不同，以此用来分离亚细胞组份。物体围绕中心轴旋转时会受到离心力的作用，离心力越大，被离心物质沉降得越快。应用：此法多用于分离细胞匀浆中的各种亚细胞组分，用低渗匀

浆、超声破碎或研磨等方法可使细胞质膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组成的混合匀浆，再通过差速离心将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。二、密度梯度离心密度梯度离心使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的比重平衡在相应的溶剂密度中形成区带。常用的密度梯度溶剂是蔗糖或氯化铯（CsCl）溶液。用蔗糖时，先将蔗糖溶液制成密度梯度溶液，再在其顶端加样品。离心后，如欲收集所分离的组分，可在离心管的下端刺一小洞，然后分部收集。如用CsCl这种密度大又扩散迅速的溶剂系统时，可将样品均匀地混合于溶剂中。离心达到平衡后，CsCl溶液形成密度梯度，样品中各组分也在相应密度处形成区带。原理：离心介质以连续密度梯度分布，通过离心、每种物种悬浮到与自己密度相当的介质区。当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。应用：此法常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质,一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用来分离提取核酸、富含AT和富

大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)

大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越 1.预约摇床、超速离心机。 2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。质粒做好转化，并涂板。。、。 17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。 18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。 19.加入等体积TE（一定要加。若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。 20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随上清一起倒掉）。6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。 21.加入450 μl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。 22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH 5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。13,000 rpm 离心10min。 23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。 24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。

lysozyme-EDTA-RNase溶液溶菌酶0.4 g 0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL RNase A (100mg/mL) 120uL H2O 25mL 25％蔗糖: 蔗糖25 g 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml 过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。 0.5 M EDTA（pH 8.0）: EDTA·Na·2H2O 186.1 g NaOH 约20 g 加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。 Triton-lysis: 10% Triton-100 5mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL H2O 100mL 湿热灭菌，常温保存。 PEG8000： PEG8000 150 g 5 M NaCl 150 ml 加纯水定容至500 ml，湿热灭菌，常温保存。 EB（2mg/ml）： EB 20mg 加超纯水10ml，溶解，室温保存。

实验1蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体

蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体一实验目的掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二实验原理概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心

一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 Cl），其密度可达等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（C S 1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。梯度溶液的制备（1）梯度材料的选择原则。作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④容易纯化，价格便宜或容易回收。⑤浓度便于测定，如具有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性

水泥混凝土试模砂浆试模校验规程

水泥混凝土试模、砂浆试模校验规程 1、适用范围本方法适用于水泥混凝土试模、砂浆试模的校准，参照《混凝土试模》（JG237-2008）编制。 2、技术要求 2.1试模的所有外表面应光洁无毛刺无粘砂无伤痕等疵症，试模外表面及紧固件均应涂刷防锈油漆，油漆表面应光滑均匀和色调一致。 2.2试模宜选用不低于HT200的铸铁，亦可选用Q235号钢或采用性能指标不低于Q235号钢的其他牌号钢或采用其他不吸水材料制作，当选用其他不吸水材料时应经过专门试验符合相关标准要求且具有足够的耐久性能方可采用。 2.3试模在组装和成型试件时不得产生变形，试模结构应保证组装侧板能正确定位，整个试模必须连接紧密、紧固可靠，在振动成型时不得松动、不得漏浆，试模结构应便于与振动台固定。固定后应牢固可靠，试模侧板、端板和底板等应具有足够的定位面，拆下的零部件应具有互换性。 2.4试模组装后内部尺寸误差不应超出公称尺寸的±0.2%，且不得超过±1mm。 2.5试模组装后其相邻侧面和各侧面与底板上表面之间的夹角应为直角，直角误差不应大于0.3°. 2.6试模侧板、端板、隔板的内表面和底板上表面的平面度误差为每100mm不应大于0.04mm,定位面的平面度误差不应大于0.06mm。 2.7试模组装后其连接面的缝隙不得大于0.2mm，隔板与侧板的缝隙不得大于0.4mm。 3、校准项目

3.1外观检查。 3.2内部尺寸。 3.3夹角垂直度。 3.4内表面平面度。 3.5组装后缝隙。 4、校准环境及校准器具 4.1校准环境：校准工作应在室内进行，环境温度为（20±5)℃，相对湿度不大于85%，校准现场应洁净，周围无影响校准结果的振动、污染、腐蚀性气体。 4.2校准器具： 4.2.1游标卡尺：量程不小于200mm ,分度值0.02mm。 4.2.2深度尺：量程不小于200mm ,分度值0.02mm。 4.2.3钢直尺：量程不小于600mm ,分度值1mm。 4.2.4 0级刀口直角尺及配套塞规：边长小于60mm。 4.2.5 0级刀口平尺及配套塞规：长度不小于600mm . 5、校验规程 5.1外观检查：按照本方法2.1-2.3条要求进行目测检查。 5.2试模内部尺寸校准：试模两相对侧板内表面的距离用游标卡尺在内侧板上沿对称测量，立方体试模边长在侧板两端分别测量，棱柱体试模长（用钢直尺测量）在两端侧板的两端测量，宽在两边侧板两端、中间分别测量；试模高度用深度尺测量，立方体试模高度在其每个边中部测量，棱柱体试模高度端侧板在中间测量，边侧板在两端和中间取3个点测量。 5.3垂直度校准：垂直度应采用精度为0级刀口直角尺和塞规测量。试模侧板

病毒纯化密度梯度离心法

病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。病毒纯化方法: 1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。 2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。

离心方法的选用

离心方法的选用所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速、高速离心;若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心;超速离心:差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离心和等密度离心。 1、差速离心采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离; 差速离心法：原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。

这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心(2—3次)，才能得到较纯颗粒。常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。 2、密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法; 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油; 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度; 操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带;

可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。 3、等密度离心原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离; 区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。此文章由广州深华生物技术有限公司编辑修改。

混凝土及砂浆试模校验记录

混凝土及砂浆试模校验记录一、技术要求 1、组成模腔的各平面应抛光，其不平度应不大于0.05mm。 2、承压面与相邻面的不垂直不应超过±0.5度。 3、模型的内部尺寸。试模尺寸（mm）边长（mm） 100×100×100 100±0.2 150×150×150 150±0.2 200×200×200 200±0.4 100×100×300 100±0.2 300±0.4 100×100×400 100±0.2 400±0.4 150×150×550 150±0.2 550±0.4 φ150×150 φ150±0.2 150±0.2 70.7×70.7×70.7 70.7±0.2 二、校验项目及条件 1、校验/检验项目（1）不平整度。（2）相邻面不垂直度。

（3）模腔各部尺寸。 2、校验/检验用器具（1）万能角度尺。（2）游标卡尺：量程300mm，分度值0.02mm。（3）塞尺。（4）钢直尺：量程300mm，分度值1mm。三、校验/检验方法 1、新购试模按下述方法进行校验。 (1)用钢直尺和塞尺在各模型的两个垂直的方向上选择两个不同部位测量模型内部表面的不平度，取算术平均值；准确至 0.01mm。 (2)用万能角度尺测量各种模型内部各相邻面的不垂直度。各相邻面选择不同部位测量两点，取算术平均值；准确至 0.1度。（3）用游标卡尺测量各种模型内部的尺寸，在每个方向上选择两个测点，取算术平均值；准确至0.1mm。 2、使用中的试模检验，用肉眼观测试模有无明显变形、锈蚀、组合是否密贴。四、校验结果处理全部校验/检验项目均符合技术要求为合格。

b第二节：细胞组分的分析方法

第二节：细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物（一）差速离心 ?特点： ?介质密度均一； ?速度由低向高，逐级离心(多次离心) ?用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ?沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 ?可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。（二）密度梯度离心： ?用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 ?类型：速度沉降、等密度沉降。（区别看PPT） ?常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 ?分离活细胞的介质要求： ?1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； ?2）PH中性或易调为中性； ?3）浓度大时渗透压不大； ?4）对细胞无毒。二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法属于生化内容，自行补脑三、细胞内特异核酸序列的定位与定性原位杂交技术：利用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。 ?Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA 或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 ?将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。四、放射自显影术 ?用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 ?原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。 ?一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。

Ficoll密度梯度离心

外周皿中提取人淋巴细胞（PBMC）的方珐主要有：Ficoll密度梯度离心珐，percoll分层液珐我主要使用的是Ficoll密度梯度离心珐，给你介绍下 Ficoll密度梯度离心珐：（一）原理：常用来分离人外周皿单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。xī取分层液液面的细胞，就可从外周皿中分离到单个核细胞。（二）方珐： 1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉皿与等量Hank‘s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为皿浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还hán有皿小板。 4. 用máo细皿管擦到云雾层，xī取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛皿清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于皿球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数／1毫升细胞悬液）＝ 4个大方格内细胞总数 —————————— × 104×2（稀释倍数） 4 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞数活细胞百分率＝—————— ×100％

实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体

实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体实验原理2、1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同

沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1、28 kg/cm3和60％。此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。

砂浆试模

砂浆试模试模检验规程砂浆试模是用来制作测试砂浆力学性能及其长期性、耐久性试验用试件的模具。（一）技术要求： 1.1砂浆试模由铸铁或钢制成，内表面应机械加工平整光滑，不应有任何砂眼或缺陷。 1.2试模内表面的不平整度，每100mm不超过0.05mm。 1.3立方体、长方体试模组装后，各相邻面须垂直，棱边长度不超过±1%。（二）检验用标准器具：直角尺，分度0.02mm的游标卡尺。（三）检验方法： 3.1感观检查，要符合技术要求中1.1项指标。 3.2用直角相邻面的垂直度，不平度。 3.3用直尺，游标卡尺测量棱边长度及直径。（四）检验结果评定：必须完全符合技术要求。（五）检验周期：半年。

砂浆试模校验记录送校单位试模品种规格仪器编号校验号项目校验数据结果一、不平整度1. A面(1) mm(2) mm平均mm 2. B面(1) mm(2) mm平均mm 3. C面(1) mm(2) mm平均mm 4. D面(1) mm(2) mm平均mm 5. E面(1) mm(2) mm平均mm 6. 二、相邻面不垂直度1. AB面(1) 度(2) 度平均度 2. AD面(1) 度(2) 度平均度 3. CD面(1) 度(2) 度平均度 4. CB面(1) 度(2) 度平均度 5. AE面(1) 度(2) 度平均度 6. BE面(1) 度(2) 度平均度 7. CE面(1) 度(2) 度平均度 8. DE面(1) 度(2) 度平均度 9. 三、模腔各部尺寸长（mm）宽（mm）高（mm）（1）（2）平均（1）（2）平均（1）（2）平均校验结论：依据TGX001~060-2001《工程试验专用仪器校验检验方法》（铁路内部标准）检定，该试模。校验员核验员校验日期年月日