青蒿素的研究进展

青蒿素研究进展

摘要青蒿素是目前治疗疟疾的特效药。本文对自青蒿素发现以来的最新研究进展进行了比较详尽的综述。内容包括：青蒿素的发现及历史，青蒿素的来源，青蒿素的全合成，青蒿素的生物合成，青蒿素衍生物以及植物组织培养生产青蒿素。

关键词青蒿素青蒿素衍生物合成

Abstract The recent research advances in artemisinin, the most effective weapons againstmalarial parasites have been reviewed. An overview is given on artemisinin research from the following aspects：the history of artemisinin development, sources of artemisinin, total synthesisof artemisinin, biosynthesis of artemisinin, analogs of artemisinin and artemisinin production from plant tissue cultures.

Key words artemisinin; artemisinin derivatives; synthesis

青蒿素(Artemisinin)是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热的抗疟特效药,尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速

效和低毒的特点,已成为世界卫生组织推荐的药品［1］。青蒿素的抗疟机理与其它抗疟药不同,它的主要作用是通过干扰疟原虫的表膜-线粒体功能［2，3］,而非干扰叶酸代谢,从而导致虫体结构全部瓦解。目前药用青蒿素是从中药青蒿即菊科植物黄花蒿的叶和花蕾（Artemisia annua L.）中分离获得的。由于青蒿的采购、收获,直至工厂加工提取,环节较多,费时费力,且不同采集地和不同采集期青蒿品质有很大的差别,同时,大量采集自然资源,必然会破坏环境和生态平衡,导致资源枯竭。因此,为增加青蒿素的资源,世界各国都在加紧开展青蒿素及其衍生物的开发研究,长期稳定地和大量地供应青蒿素成为各国科学家面临的严峻考验。

由于青蒿素是抗恶性疟疾的特效药,目前的售价为225美元/g。近年的统计资料表明世界每年有近300万人死于疟疾,尤其是非洲的发病率极高,对青蒿素的需求量较大,世界

每年的需求量为150吨,而产量仅有15吨左右,形成明显的供不应求局面,我国在“九五”期间开展青蒿素的开发研究将具有可观的经济效益和社会效益。本文将对目前国际上青蒿素研究的现状从以下几个方面进行论述。

1.青蒿素的发现及历史

青蒿入药,最早见之于马王堆三号汉墓出土（公元前168年左右）的帛书《五十二病方》,其后在《神农本草经》,《大观本草》及《本草纲目》等均有收录。从历代本草及方书医

籍的记载,青蒿入药治疗疟疾是经过长期的临床实践经验所肯定的。1971年以来,中医研究院青蒿素研究小组通过整理有关防治疾病的古代文献和民间单验方,结合实践经验,发现中药青蒿乙醚提取的中性部分具有显著的抗疟作用。在此基础上,于1972年从青蒿中分离出活性物质——青蒿素,并于1976年通过化学反应、光谱数据和X射线单晶衍射方法证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内酯,分子式C15H22O5，其分子结构如图1所示［4］,其绝对构型由刘静明等通过旋光色散和氧原子的反常散射测定［5］。

图1 青蒿素结构式

青蒿素发现以来,人们进行了大量的药理学研究,结果表明青蒿素对疟原虫红内期有直接的杀伤作用,而对组织期无效。青蒿素的毒性实验显示其毒性很低,在机体内分布

快,分布广,排泄快。青蒿素对疟原虫的超微结构观察,在给药8h后,滋养体开始出现食物胞膜及线粒体的改变,12—14h发展到限制膜、核膜和内质网的改变,20—24h虫体内自噬

泡增多,增大及至虫体结构全部瓦解。可见,青蒿素主要作于膜系结构,其抗疟机理认为是干扰了疟原虫的表膜-线粒体功能,阻断了以宿主红细胞浆为营养的供给［6］。

在青蒿素药理实验的基础上,人们又进行了大量的药理和临床疗效研究。1973年9月,青蒿素首次用于临床,在海南岛昌江地区对8例外来人口恶性疟疾及间日疟进行临床

观察,特别对间日疟显示了较好的疗效。1975年在海南岛南岛农场及湖北武汉等地对青蒿素、青蒿素复方、青蒿素简易制剂等进行临床观察,肯定了其抗疟疗效。1976、1977

年在湖北、河南、海南岛对油剂注射剂等4种青蒿素制剂重点观察降低近期复发率的效果,但没有获得满意的结果。几年来的临床观察肯定了青蒿素治疗恶性疟疾、间日疟具有高效、低毒的特点,并对治疗抗氯喹株有特效,不少地方将青蒿素作为抢救凶险型疟疾病人的首选药物。但在使用中存在的主要问题是近期复发率高,为解决此问题,从合理用药、改变剂型、复方配伍和结构改造等方面进行了探索［7］。到目前为止,已有十几种衍生物的抗疟效果比青蒿素活性高出多倍。自我国开展有关青蒿素的研究后,世界各国相继开展此方面的重复性研究,获得的结果显示了抗疟的特效性。

2.青蒿素的来源

青蒿素在抗疟中日益显示其重要性,寻找其新的来源显得非常重要。目前,商用的青蒿素主要来自植物提取物。从青

蒿中提取的青蒿素已成为世界卫生组织推荐的抗疟药

物。在天然植物中青蒿素的含量受地理环境、采集时期、采集部位、气温和施肥等因素的影响。青蒿广泛分布在中国的各省市,不同产地青蒿素含量差异显著,最高可达干重

的1%—2%。为获得最大的青蒿素产量,钟风林等［8］对不同生长期的青蒿素含量变化进行考察,认为青蒿的采集期在生长盛期至花蕾期之前,此时的青蒿素含量最高,营养体重

量大,而且采集的时间以晴天中午12时及下午16时为宜,一天中在这期间采收青蒿素含量最高,这与光强有利于青蒿素的产生和大量积累理论相一致。在青蒿植株和枝条上的叶

片中,青蒿素含量均呈下部、中部、上部依次递增的规律。因此,青蒿植物的上部和枝条上部的叶片应首选入药,其次为中部,最后才是下部。不同的干燥方法对青蒿素的产量也

有一定的影响,比较晒干、阴干和60℃烘干三种方法,以自然晒干的效果最好,比阴干的样品含量高23.76%。在人工栽培中稍加肥料,青蒿植株高大,青蒿素的含量较野生的略高,

且嫩叶比老叶的含量高。陈福泰［9］在人工控制的环境中栽培青蒿,在青蒿生长的基本条件得到满足的情况下,生长环境中的营养物质的含量与生长基质对青蒿素含量没有影响,而高温和短距离光照可促使青蒿素含量成倍增加。Elhag 等［10］筛选高产的青蒿植株时,发现青蒿的含量高的植株具有长的节间,茁壮的茎杆,伸展开的枝条和茂密的叶。Liersch

等［11］对筛选的青蒿品种811喷洒植物激素chlormequat,结果植株的青蒿素含量比对照高30%。虽然青蒿素主要来自于天然采集的野生植株和人工栽培青蒿,但天然野生青蒿受地理环境和季节的限制以及资源的日益匮乏,难以获得持续的发展。人工栽培占地大,耗时耗力,且植株易变异,也使得产量难以保证,因而开发新的青蒿素来源途径具有重要的实际意义。

3.青蒿素的化学合成

化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。中国科学院上海有机所对青蒿素及其一类物的结构和合成进行了大量的工作［12－18］。1986年, Xu等［19］报道了青蒿素的全合成途径,其合成以R(+)-香草醛为原料,经十几步合成青蒿素,合成途径如图2所示。国外也以不同原料为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究［20－23］。1994年,Zhou和Xu［24］综述了国内外青蒿素全合成的研究进展。青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展,但到目前尚未显示出商业的可行性。

图2 青蒿素化学合成途径

4.青蒿素的生物合成

了解青蒿中青蒿素的生物合成途径与该药的生产密切相关。包括：(1)通过添加生物合成的前体来增加青蒿素的含量；(2)通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控,或者

对关键酶控制的基因进行激活来大幅度增加青蒿素的含量；

(3)利用基因工程手段来改变关键基因以增强它们所控制酶的效率。

由于萜类化合物的生物合成途径非常复杂,因而对于青蒿素这一类低含量的复杂分子的生物合成研究就更具复杂性。对于倍半萜内酯的合成,其限速步骤一是环化和折叠

成倍半萜母核的过程,另一个限速步骤为形成含过氧桥的倍半萜内酯过程。Akhila等［25］通过放射性元素示踪法对青蒿素的生物合成途径进行了研究,认为青蒿素的生物合成途径如图3所示,从法尼基焦磷酸出发,经牦牛儿间架、双氢木香交酯、杜松烯内酯和青蒿素,最终合成青蒿素。国内也进行青蒿素生物合成的研究,探索了由［2-14C］-MVA为前体生物合成青蒿酸［26］,以及由青蒿酸为前体生物合成青蒿素及青蒿素B的过程［27］。

图3 青蒿素生物合成途径

5.青蒿素衍生物合成

青蒿素由于存在近期复燃性高,在油中和水中的溶解度低,难以制成合适的剂型等不足,对其结构进行改造,寻找合适的青蒿素衍生物工作成为当今研究的热点。目前,已发

现不少抗疟活性更高的衍生物,这些化合物主要是对青蒿素的12位碳原子进行修饰。梁洁等［28］将青蒿素还原为二氢青蒿素,对二氢青蒿素的第12位碳原子进行修饰,合成了青

蒿素芳香醚衍生物, 这些化合物除具有高效的抗疟活性外,

还具有抗病毒和抗肿瘤的活性。李英等［29］首先将青蒿素（I）催化氢化形成二氢青蒿素（II）,以此为中间体,在酸

和碱的催化下与各种醇、羧酸酐和氯甲酸酯反应,合成其醚类（III）、羧酸酯（IV）和碳酸酯类（V）等衍生物47个,如图4所示。经筛选,以SD90作为标准,获得超过青蒿素效

率10倍的化合物12个。经过几年的研究,目前国内已进行了青蒿素衍生物工业化生产。昆明制药厂与中国科学院上海药物研究所合作研制成功青蒿甲醚系列产品,并制成注射

液、复方片剂和胶囊,其中青蒿甲醚注射液成为我国第一个在国际上获得注册的新产品,产品已远销缅甸、泰国、加蓬、多哥、南非和加纳等27个国家,出口创汇突破500万美元［30］。

图4 青蒿素衍生物

6.植物组织培养合成青蒿素

利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的

另一热点,可能成为大规模生产青蒿素的重要手段。自80年代

以来,植物组织培养生产青蒿素的研究工作已进行不少,

已经在青蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行了青蒿素合成的探索。

贺锡纯等［31］对青蒿的愈伤组织、带芽的愈伤组织和由愈伤组织分化产生的小植株中青蒿素的合成进行分析,认为青蒿愈伤组织中不含青蒿素,在愈伤组织伴随芽分化形

成时,检测到青蒿素的含量约为干重的0.008%,而在分化苗长成的植株中,青蒿素的含量达到干重的0.92%,高于野生植株。Nair等［32］在进行青蒿愈伤组织悬浮培养时,在愈伤组织中未检测到青蒿素的存在,但在悬浮培养液中检测到微量的青蒿素（8μg/mL）。同样在Brown［33］的研究中也证实了青蒿的愈伤组织中不含萜类,但在分化的芽中检测到和

亲本相似的萜类合成物。Tawfit等［34］在研究青蒿悬浮细胞培养时,在培养物中没有检测到青蒿素的合成,但在培养液的正己烷提取物中检测到抗疟的活性。Paniego等［35］在新诱导的青蒿愈伤组织中检测到青蒿素的含量约为干重的0.1%—0.08%,此培养物经三次继代培养后,愈伤组织内青蒿素的含量几乎难以检测到。由此可见,在未分化的青蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素,而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。Woerdenbag等［36］在诱导的青蒿芽培养物检测到青蒿素的存在,并对营养物和激素对青蒿芽生长和青蒿素的影响进行研究,发现赤霉素和水解酪蛋白等对

芽中青蒿素的合成具有强的刺激作用。Ferreira等［37］在青蒿芽的培养过程中,同样检测到青蒿素的存在,并在诱导生根的青蒿芽中获得了高含量的青蒿素,约为干重的0.287%。Paniego等［38］建立了转基因的青蒿芽培养物,其青蒿素含量稳定,约为干重的0.02%,改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显,但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3—4倍。1994年,秦明波等［39］用发根农杆菌1601成功转化青蒿幼茎获得毛状

根培养物,提供了以发根农杆菌作为基因载体进行青蒿的遗传改造的可行性。与此同时,Weathers等［40］利用发根农杆菌15834感染青蒿的芽尖和叶片,获得青蒿毛状根培养物,并且检测到青蒿素的含量约为干重的0.43%,其含量远高于其它青蒿组织培养物中青蒿素的含量。蔡国秦等［41］利用发根农杆菌1601感染青蒿叶片建立了毛状根培养系,并在培养物中检测到青蒿素,在添加赤霉素的条件下青蒿素的含量约为干重的0.2%。Vergauwe等［42］利用根癌农杆菌感染青蒿叶片,获得转基因植株中青蒿素含量约为干重的0.17 %, 青蒿素合成前体青蒿素B的含量约为0.22%,为通过转基因植物进行青蒿素大量生产奠定基础。

目前,青蒿组织培养的研究工作主要集中在利用生物技术的手段来进行组织培养物的改进和高青蒿素含量培养系的筛选和建立,对于利用生物反应器培养青蒿组织来生产

青蒿素的研究工作尚处于起步阶段。Fulzele等［43］利用1L 生物反应器进行青蒿芽的悬浮培养,经过30天的分批培养可获得再生的植株,生物量提高了4—5倍。Park等［44］利用2L的长方形气提式生物反应器培养青蒿芽,经过4周的培养,

培养物增殖8倍,获得的青蒿芽可长出不定根。我们目前与中国科学院植物所合作,在国家“九五”科技重点攻关项目的资助下,对青蒿毛状根生长和青蒿素合成的调控进行了研究［45］,并利用合适的小型生物反应器进行了毛状根的大量培养［46］,获得了满意的结果,为进一步利用生物反应器进行青蒿组织大规模培养生产青蒿素的研究工作奠定基础。

青蒿植物组织培养生产青蒿素的一系列研究表明,在未分化的青蒿组织培养物（愈伤组织和悬浮细胞）中,青蒿素的含量极低,且青蒿素合成不稳定；而在分化的器官（芽、毛状根和再生幼苗）中,青蒿素的含量明显提高,并且具有较稳定的合成能力,尤其是转基因青蒿毛状根培养物为青蒿素的大规模生产提供了潜在的应用前景。

综上所述,在今后的几年里,青蒿素的研究应在以下几个方向进行深入研究：(1)野生青蒿资源的勘察,高产系的筛选；

(2)具有高效抗疟活性的青蒿素衍生物开发；(3)青

蒿素生物合成途径及关键酶的深入了解的基础上进行青蒿

素合成的代谢调控；(4)青蒿素合成关键酶基因的克隆,以及在合适的青蒿组织培养体系和微生物中高效表达；(5)开

发合适的青蒿组织培养生物反应器系统,进行过程的优化控制和放大,实现青蒿素大规模商业化生产。

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