Protein-protein interaction 蛋白间的相互作用

Protein-Protein Interactions

Protein Structure

?The fundamental unit of

protein structure is a

domain.

?This region of a polypeptide

chain folds into a distinct

structure and mediates the

protein’s biological

functionality.

Abstract View of Protein

Structure

?Proteins are represented

as shaded areas and the

domains as geometrical

figures.

?We assume that protein

domain (or domain

combination) interactions

are responsible for

protein interactions.

Gen ome: 30.000 genes

Transcript ome: 40-100.000 mRNAs

Prot eome:

100-400.000 proteins >1.000.000 interactions

Dimensions of Information

Complexity

Genomics vs. Post-Genomics

Human Genome Human Proteome Transcripts

Protein Interaction

105

106

A proteomics circuit showing the

interaction of RNA splicing proteins

Source: Campbell/Heyer. Discovering genomics, proteomics, and bioinformatics

Terminology

Protein Complexes are groups of proteins that interact with each other at the same time and place, forming a single multi-molecular machine.

E.g., anaphase-promoting complex, RNA-splicing and

protein export and transport complexes, etc. Functional modules consist of proteins that participate in a particular cellular process while binding each other at a different time and place (different conditions or phases of the cell cycle, in different cellular compartments, etc).

E.g., yeast pheromone response pathway, MAP

signaling cascades, etc.

How can we identify Protein-Protein Interactions ?

1. In vitro interactions.

2. In vivo interactions.

3. How does this fit together?

Identification of Protein-Protein

Interactions by

Co-Immunoprecipitation

Co-Immunoprecipitation - Principle

A variation of

Co-Immunoprecipitation:

Reverse Co-Immunopreciptiation combined with cross-linking Spatial organisation of P-P-interactions

Cross-linkers

e.g. bifunctional sulfhydril-reactive crosslinkers:

e.g. Maleimide-ester

Homobifunctional

Periodate

cleavable!

Identification of Protein-Protein Interactions by Pull-Down methods

prepare protein

蛋白质质谱鉴定

广州辉骏生物科技有限公司蛋白质质谱鉴定一、技术概述质谱是将待测物质变为气态离子并将离子按质荷比（m/z）进行分离，检测各种离子谱峰的强度而实现分析的一种方法。蛋白质定性通常采用质谱分析结合数据库检索的方法，所分析的样本可以是蛋白质溶液、蛋白质胶条或胶点。简单蛋白样本，例如双向电泳斑点或纯化蛋白，通常采用MALDI-TOF/TOF质谱（MS/MS）进行分析。混合蛋白样本，例如蛋白溶液，或SDS-PAGE条带，通常采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行分析。应用领域有：亚细胞组分的全谱分析，IP、co-IP、Pull-down后的互作蛋白鉴定，或其他中等复杂蛋白样本的鉴定。二、技术原理串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是：蛋白先经胰酶消化成肽段，肽段在质谱仪中离子化后，会带上一定量的电荷，通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。为获得肽段的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行破碎，再次分析，获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，同时以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。 LC-MS/MS方法是将蛋白酶切消化为肽段混合物，之后这些肽段先经高效液相色谱分离形成简单的组分，再进行串联质谱（MS/MS）分析；因此适合于混合蛋白样本的鉴定。三、技术优势 1. 采用高效液相色谱和质谱联用的分析方法，可以一次性鉴定成百上千种蛋白质。 2. 鉴定准确性和灵敏度高。四、技术流程蛋白样本制备——蛋白酶解——串联质谱分析（或LC-MS/MS分析）——数据库检索——蛋白质鉴定结果

蛋白质结构分析原理及工具-文献综述

蛋白质结构分析原理及工具（南京农业大学生命科学学院生命基地111班）摘要：本文主要从相似性检测、一级结构、二级结构、三维结构、跨膜域等方面从原理到方法再到工具，系统地介绍了蛋白质结构分析的常用方法。文章侧重于工具的列举，并没有对原理和方法做详细的介绍。文章还列举了蛋白质分析中常用的数据库。关键词：蛋白质；结构预测；跨膜域；保守结构域 1 蛋白质相似性检测蛋白质数据库。由一个物种分化而来的不同序列倾向于有相似的结构和功能。物种分化后形成的同源序列称直系同源，它们通常具有相似的功能；由基因复制而来的序列称为旁系同源，它们通常有不同的功能[1]。因此，推测全新蛋白质功能的第一步是将它的序列与进化上相关的已知结构和功能的蛋白质序列比较。表一列出了常用的蛋白质序列数据库和它们的特点。表一常用蛋白质数据库网址可能有更新氨基酸替代模型。进化过程中，一种氨基酸残基会有向另一种氨基酸残基变化的倾向。氨基酸替代模型可用来估计氨基酸替换的速率。目前常用的替代模型有Point Accepted Mutation (PAM)矩阵、BLOck SUbstitution Matrix (BLOSUM)矩阵[2]、JTT模型[3]。序列相似性搜索工具。序列相似性搜索又分为成对序列相似性搜索和多序列相似性搜索。成对序列相似性搜索通过搜索序列数据库从而找到与查询序列相似的序列。分为局部联配和全局联配。常用的局部联配工具有BLAST和SSEARCH，它们使用了Smith-Waterman 算法。全局联配工具有FASTA和GGSEARCH，基于Needleman-Wunsch算法。多序列相似性搜索常用于构建系统发育树，这里不阐述。表二列举了常用的成对序列相似性比对搜索工具

蛋白互作几种方法比较

蛋白互作几种方法比较 IP与CO-IP的关系： IP就是用抗体把你要的蛋白免疫沉淀下来，然后去检测它。例如蛋白A在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这是可以用A蛋白的抗体+prorein A beads来IP，从细胞中把A拉下,再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）来检测A的变化。 co-ip的原理和IP是一样的，但是它检测的是和A相互作用的蛋白，也就是说用A的抗体把A拉下来后，用和A相互作用蛋白B的抗体去检测，来证明A和B之间的相互作用。就是说只要用A的抗体把B拉下来就能证明A和B之间有相互作用。这种关系只能说是存在相互作用，但这种相互作用并不能确定是直接的还是间接的，也就是所也许是A与c作用，而B也和C作用，这样，用A的抗体可以把C拉下来，但同时C 又把B也拉下来了。要确定A和B之间直接的相互作用，你可以做体外的GST PULL DOWN 实验。 GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。（GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)） GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法。简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的。 Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的。两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系。

蛋白互作

蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法： 1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。 “假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。 “假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。体内互作的研究 1、荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。由于只有在蛋白之间的距离达到10nm一下才会发生FRET，而10nm要小于蛋白互作要求的距离，所以FRET是衡量体内互作的强有力的证据。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

核酸-蛋白质互作

核酸－蛋白质互作的生物化学研究方法张金璧, 潘增祥, 林飞, 马雪山, 刘红林南京农业大学动物科技学院, 南京210095 摘要:研究核酸－蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础, 文章简要综述了用于研究核酸－蛋白质互作的各种生物化学方法。从体内、体外两个研究角度, 针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平, 概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern杂交等经典分析方法的原理、发展和运用。还着重介绍了最近在表观遗传学领域中广泛运用的nChIP、xChIP等基本染色质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍生出的ChIP-on-chip等方法。关键词: 核酸; 蛋白质; 互作; 足迹; 染色质免疫沉淀 Biochemical methods for the analysis of DNA-protein interactions ZHANG Jin-Bi, PAN Zeng-Xiang, LIN Fei, MA Xue-Shan, LIU Hong-Lin College of animal science and technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China Abstract: Investigation of DNA-protein interactions is fundamental to understand the mechanism underlying a variety of life processes. In this article, various types of biochemical methods in DNA-protein interaction study in vivo and in vitro at the level of DNA, protein, and the complex, respectively were briefly reviewed. Traditional assays including Nitrocellulose filter-binding assay, Footprinting, EMSA, and Southwestern blotting were summarized. In addition, chromatin immunoprecipitation techniques including nChIP, xChIP, and ChIP-on-chip, which were widely used in epigenetics, were particularly introduced. Keywords: nucleic acid; protein; interaction; footprinting; chromatin immunoprecipitation (ChIP) 核酸－蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用, 二者的协作是各种

蛋白质组学复习资料

蛋白质组学复习资料一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略：第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简

蛋白质组学生物信息学分析介绍

生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)

聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)

蛋白质组学及其主要技术

蛋白质组学及其主要技术朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复

阿尔兹海默症发病相关蛋白互作网络构建与通路分析

Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2018, 8(2), 16-26 Published Online April 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/9f3555197.html,/journal/hjbm https://https://www.360docs.net/doc/9f3555197.html,/10.12677/hjbm.2018.82003 Protein-Protein-Interaction Network and Pathway Analysis Related to Alzheimer’s Disease Yuchen Xu1, Lin Wei2, Honglei Li3 1Department of Neurology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha Hunan 2Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha Hunan 3Department of Otorhinolaryngology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha Hunan Received: Mar. 21st, 2018; accepted: Apr. 2nd, 2018; published: Apr. 9th, 2018 Abstract Alzheimer’s disease (AD) is one of the most common neurodegenerative disease, and its pathoge-nesis is not fully understood. This article derives transcriptome data of patients with AD from the Gene Expression database GEO (Gene Expression Omnibus), through which we obtain the AD-related risk gene set. Based on AD risk gene set, we construct a protein-protein-interaction network of AD. At the same time we used functional enrichment analysis and path analysis to ex-plore the biological processes and signal pathway involved in AD. Our work helps to elucidate the pathogenic mechanism of AD and provide guidance to the future prevention and treatment of AD. Keywords Alzheimer’s Disease, Protein-Protein-Interaction Network, Functional Enrichment Analysis 阿尔兹海默症发病相关蛋白互作网络构建与通路分析徐煜宸1，魏琳2，李泓磊3 1中南大学湘雅医院神经内科，湖南长沙 2中南大学湘雅医学院，湖南长沙 3中南大学湘雅三医院耳鼻喉科，湖南长沙收稿日期：2018年3月21日；录用日期：2018年4月2日；发布日期：2018年4月9日

基于MS或MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析(一)

基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析（一）上几期文章中，小编给大家介绍了基于MS强度或计数的数据依赖法，本期开始，小编给大家介绍的是基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析。在基于肽的非标记定量蛋白质组实验中，提高分析的精确性已经成为一种趋势，诸如“检测限”和“定量限”等术语现在已被广泛使用。MS/MS定量方法（如选择性反应监测（SRM）提供的数据比直接的母体离子测量具有更高的特异性和选择性。此外，用于药物分析的数据处理技术使得基于质谱的定量领域具有更高的严谨性。 SRM是最常用的基于MS/MS的定量方法，（图例），该方法通常用于制药行业中对多种化合物（包括肽）的分析和研究。如图所示，SRM一般在三重四极杆仪器中进行，其中母体分子的分离和片段化、碎片离子的分离在最后的四级体中进行，与基于MS1的方法相比，该技术具有更高的选择性。分析仪能够以每秒1000次的顺序重复这些测量过程，从而可以分析大量的跃迁（图例）。图例. SRM测量示意图。目标母体离子在第一个四极体中分离，质量分辨率一般是0.5-0.7amu。离子被传送到碰撞池，在那里它们经历碰撞诱导分离，碎片离子被传送到第三个四极体，这也是在质量选择模式下以0.5-0.7amu的分辨率进行的。这使得特定片段离子得以传输，作为单离子强度测量的检测。严格意义上讲，我们通常并不认为SRM法是数据非依赖性的，而通常称之为“目

标”法，因为在实验开始时必须预先定义目标化合物的列表。定向SRM分析需要测出肽片段的信息，最好还得有LC保留时间。样品中化合物碎片的信息用于定义方法，这需要一定程度的迭代来生成最高质量的定量数据。无论在什么情况下，SRM都从背景噪声或真实信号中获取数据，无论是否检测到母体离子，也不管是否导出信号。与基于DDA的检测方法（检测是半随机的）相比，SRM能够在检测下限对化合物进行无偏测量（因为它对肽/蛋白质进行的是恒定测量），从而确保消除任何随机效应。这使得SRM测量能够达到所接受的精度水平，并可用于生物分析实验室对生物分子进行分析。文献参考：Stephen Tate. et al, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions, Journal of Proteomics, 2013. 本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务，结合亲和纯化与Label-free、SILAC或SWATH定量技术，百泰派克生物科技开发了一系列蛋白质组研究策略，其灵敏度高、重复性好，非常适合蛋白质相互作用的研究。

蛋白质组学复习重点

蛋白质组学复习重点 1.名词解释(掌握名词的中英文) 1、蛋白质组（proteome)是指一个基因组、一种细胞或组织表达的所有蛋白质。 2、蛋白质组学 Proteomic 蛋白质组学是通过大规模研究蛋白的表达水平变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究，是生命科学研究的热点领域之一。 3、电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）电喷雾离子化是在质谱系统离子源毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。 4、噬菌体展示技术 (phage display technology) 一种将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。 5、双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）指的是按照蛋白质的两个性质即“等电点”和“分子量”进行二维电泳分离。过程主要是先进行等电聚焦电泳，按照等电点分离，然后再进行SDS-PAGE，按照分子大小分离，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 6、等电点（isoelectric point）在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH 称为该氨基酸或蛋白质的等电点。 7、质谱分析（mass spectrometry，MS） MS是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。 8、生物信息学（bioinformatics）生物信息学是综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义的新兴交叉学科，包含了生物信息的获取、处理、存储、发布、分析和解释等在内的所有方面。 9、酵母双杂交（Yeast two hybrid）酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。10、肽指纹图谱（Peptide mass fingerprinting）理论上每个蛋白消化后有不同的肽段，这些肽段的质量（分子量）就是这个蛋白的肽指纹图谱。用质谱可以检测出其中所有肽段的质量，然后将这些质量与数据库中所有蛋白指纹进行匹配，就可确定一种未知蛋白。 11、表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 2.简答题 1、please describe the principles of some kinds of protein post-translational modification? 蛋白翻译后修饰磷酸化(phosphorylation)：指由蛋白质激酶催化的把ATP 或GTP γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普遍的调节方式。糖基化 (glycosylation)：指在酶的控制下，蛋白质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。甲基化(methylation)：一般都是指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。典型的甲基化发生在染色质组蛋白上。乙酰化(acetylation)：指在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达，蛋白质活性或生理过程的一种机制。泛素化(ubiquitination)：泛素（一类低分子量的蛋白质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰（主要是降解）的过程。 2、Please describe the concept of ITRAQ. Isobaric tag for relative and absolute quantitation.相对和绝对定量的同位素标记是定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量。 3、双向电泳基本流程蛋白质样品的制备：来源于固体组织或培养的细胞，进行细胞裂解及蛋白质变性。第一向：蛋白质样品上样，进行等电聚焦分离，第二向：制备凝胶；垂直板SDS-PAGE电泳考马斯蓝染色或者银染染色、扫描、挖点 4、液相芯片系统与ELISA方法相比较的优点? 灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒。通量大，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析；在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测操作简便，耗时短，成本低 5、噬菌体展示实验的设计流程将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。肽库与固相上的靶蛋白分子一起孵育，洗去未结合的游离噬菌体洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。 6、酵母双杂交的基本原理及应用? 原理：利用杂交基因激活报道基因的表达，从而探测蛋白-蛋白的相互作用；应用：用于发现新的蛋白质和蛋白质新功能在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 7、简述蛋白质组学的基本概念及其研究内容? 蛋白质组是指一个基因组、一种细胞或组织表达的所有蛋白质，而蛋白质组学是通过大规模研究蛋白的表达水平变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究，是生命科学研究的热点领域之一。 8、简述蛋白质组信息学的主要研究内容? 蛋白质序列与结构信息学：利用蛋白质组信息学数据库，将获得的蛋白序列通过序列比对，可以获得相应的结构信息，进而推测其功能或者鉴定其是否为蛋白质家族的新成员。蛋白质相互作用信息学：蛋白质相互作用网络的研究、蛋白质相互作用方法学的研究、蛋白质相互作用模拟的研究等。

STITCH 4.0 化合物与蛋白质互作

#软件工具#STITCH 化合物与蛋白质互作 STITCH数据库是一个用于检索已知的以及被预测的化合物和蛋白质之间互作关系的平台。化合物与蛋白质之间的互作关系通过实验验证，数据库，以及文献中的研究被证实。STITCH数据库中包含超过30,000的小分子化合物以及来自1133个物种的260万个蛋白质之间的互作关系。STITCH数据库从分布在文献和多种生物学途径、药物靶点关系和结合亲和力的数据库整合了小分子和蛋白质的相互作用。相互关系合并自BindingDB, PharmGKB 和the Comparative Toxicogenomics数据库。结果网络可以交互式检索或用于大规模分析的基础。今天我们就利用STITCH分析蛋白质互作关系，简要介绍工具的使用方法。首先下图是STITCH数据库的主界面。图中提供了多种检索模式，包括提供化合物或蛋白名，结构信息，蛋白序列，以及多个蛋白或化合物同时检索。同时下面organism提供了上千种物种可以选择，这里我们选择人类homo sapiens,点击GO

如图，input gene被逐个进行注释，可以观察每个基因对应的基因名，这里其实也间接起到了ID转化的作用，可以很方便的获得input gene对应的蛋白名。接下来我们点击continue 如图即为我们获得的基因之间的互作关系，不同的互作类型用不同颜色的边进行标注。这些互作类型我们可以灵活的进行选择，只需在想要的互作关系后面点勾就可以了。

上图中红色方框中为input gene的功能描述，可以非常详细的查看每一个基因的生物学作用。下面紫色方框为通过底层数据记录的互作关系，预测出的最显著的互作基因。后面对应的score为综合互作关系（网络邻居，基因融合，实验