菌株筛选方法
第二章餐厨垃圾堆肥产酶菌株筛选
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验材料
1）筛选材料：HM菌剂（河南恒隆态生物工程股份有限公司）；EM菌剂（江西天意集团）；金宝贝菌剂（北京华夏康源科技有限公司）；群林发酵剂（广西北海群林生物工程有限公司）。
2）发酵材料：餐厨垃圾（购自贵州大学南校区学生食堂）；稻草（购自铜仁市，晒干后粉碎至5mm左右）。
2.1.2 主要药品及试剂
2.1.3 实验仪器
电子分析天平（EL-2005）西特传感技术有限公司
高速台式离心机（TGL-161）Thermo公司
冷冻离心机（2-16k）德国eppendorf公司
标准型净化工作台上海锦星科学仪器有限公司
低温冰箱〔BCD-108E）风华电器厂
超低温冰箱(Forma-6C ULT) Thermo公司
调温调湿箱（WS/08-01）重庆试验设备厂
干燥箱（101-2）上海实验仪器总厂
自动三重水蒸馏器（SZ-97）上海亚荣生化仪器厂
高压灭菌锅（GMSX-280）英国阿斯太欧（Astell）公司
循环水浴锅（RET7）Thermo公司
电热恒温培养箱（DH3600) 天津泰斯特仪器有限公司
恒温摇床（SKY-2102C) 上海苏坤实业有限公司
高速组织捣碎机（DS-1) 上海标本模型厂
磁力双向搅拌器（90-1）上海亚荣生化仪器厂
pH计
ACS交直流两用电子计价秤昆明金瑞克电子衡器有限公司
双金属温度计（WSS-411）天津市新华热工仪表有限公司
河北铁狮磨浆机械有限公司
秸秆揉丝饲料粉碎多用机
（9R-30)
紫外分光光度计
2.1.6 培养基
1）初筛培养基
（1）细菌培养基（%）：牛肉膏0.3；蛋白胨1.0；氯化钠0.5；琼脂粉2.0；pH7.2 （2）霉菌培养基（%）：磷酸二氢钾0.1；七水硫酸镁0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；琼脂粉2.0；孟加拉红0.03；pH自然；链霉素30μg/m L
（3）乳酸菌培养基（%）：蛋白胨1；牛肉膏1；酵母膏0.5；柠檬酸二铵0.2；葡萄糖2.0；吐温80 0.1；乙酸钠0.5；三水磷酸氢二钾0.2；七水硫酸镁0.058；七水硫酸锰0.025；琼脂粉2.0；pH6.2
（4）放线菌培养基（%）：可溶性淀粉2；氯化钠0.05；硝酸钾0.1；磷酸氢二钾0.05；七水硫酸镁0.05；七水硫酸亚铁0.001；重铬酸钾0.015；琼脂粉2.0；pH7.4；青霉素3μg/ml
2）复筛培养基
（1）产淀粉酶筛选培养基（%）：可溶性淀粉0.2；蛋白胨1.0；酵母膏0.5；磷酸氢二钾0.3；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；琼脂粉2.0；pH7.0
【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】
（2）产脂肪酶筛选培养基（%）：硫酸铵0.1；磷酸氢二钾0.1；氯化钾0.05；七水硫酸镁0.01；橄榄油1.0；聚乙烯醇0.1；琼脂粉2.0；pH8.5
【刘敏,曹志军,焦艳芬,等. UHT 乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究[J]. 内蒙古农业大学学报.2008,29(1):230-233】
（3）产纤维素酶筛选培养基（%）：七水硫酸镁0.01；羧甲基纤维素钠1.5；氯
化钙0.01；磷酸二氢钾0.05；硫酸铵0.2；磷酸氢二钾0.2；pH自然
【刘胜贵,严明,邹娟,等.纤维素降解真菌的筛选及其产酶条件[J]. 中国农学通报,2011,27(7):102-106】
3）产酶发酵液
（1）产淀粉酶发酵液（%）[1]：可溶性淀粉0.5；蛋白胨0.5；酵母膏0.5；氯化钠0.1；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；pH7.0（48h培养）
【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】
（2）产脂肪酶发酵液（%）：蛋白胨2.0；葡萄糖0.58；橄榄油乳化液4；硫酸铵0.1；七水硫酸镁0.05；磷酸氢二钾0.1；pH自然（72h培养）
【胡朝阳,韦晗宁,李春苑,等.产脂肪酶菌株的筛选及酶学特性研究[J]. 广西农业生物科学,2006,25(3):261-268】
（3）产纤维素酶发酵液：A液：葡萄糖0.4g；七水硫酸镁0.25g；CMC-Na 0.5g；水89mL; B液：磷酸氢二钠6.0g；氯化钠0.5g；磷酸二氢钾3.0g；氯化铵1.0g；水100mL; C液：氯化钙0.11g；水100mL
灭菌后10mLB液+1mLC液+89mLA液即为发酵液
【雷正玉,何力,王朝元,等.草鱼体内产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的研究[J]. 微生物学杂志,2007,27(4):54-57】
4）基础培养基（%）：
蛋白胨1.0；酵母膏0.5；氯化钠1.0；琼脂粉2.0；pH7.0
2.1.7 溶液配制
0.5%淀粉溶液配制：
0.5g可溶性淀粉加入10mL水混合成糊状，加入95mL沸水，微沸几分钟。静置、冷却，取上清即得。
0.1mol/L H2SO4溶液配制：
取10.9mL浓硫酸定容至100mL，即为1mol/LH2SO4溶液。取10mL，1mol/LH2SO4溶液定容至100mL，即为0.1mol/L的H2SO4溶液。
碘液的配制：
称取2.0g碘化钾溶于10mL蒸馏水中，加入1.0g碘，迅速搅拌使其溶解后加水定容至300mL。即0.1mol/L的卢卡氏碘液；取0.4mL 0.1mol/L碘液定容至100mL即得0.4mmol/L碘液。
4%聚乙烯醇溶液配制：
称取40g聚乙烯醇(PV A）加蒸馏水约800mL，在沸水浴中不断搅拌使其完全溶解，冷却后定溶至1000mL，再经纱布过滤后备用。
橄榄油乳化液的配制：
取4%聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄榄油，高速组织搅动机搅动6min(分2次搅动，每次3min，中间休息5min中)，即制成乳白色的橄榄油乳化液。
磷酸盐缓冲液配制：
0.025mol/L，pH值7.5。甲液：称取17.01gKH2PO4，加水定容至500mL；乙液：称取44.77gNa2HPO4·12H2O，加水定容至500mL；吸取13mL甲液与100mL 乙液混匀即成0.25mol/L磷酸缓冲液，使用时用水稀释10倍，即成0.025mol/L 磷酸盐缓冲液。
0.05mol/L Na OH溶液配制：
取4.58g固体Na OH溶于1L水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时稀释10倍。
酚酞溶液配制：
取1g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中即得10g/L的酚酞溶液；取0.5g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中即得5g/L的酚酞溶液【GB/T 603-2002化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备】
Na2CO3-NaHCO3缓冲液配制：
0.1mol/L，pH10。0.1mol/LNa2CO3溶液：称取28.62g Na2CO3·10H2O溶解、定容至1L，即为0.1mol/LNa2CO3溶液；0.1mol/LNaHCO3溶液：称取8.40gNaHCO3溶解、定容至1L，即为0.1mol/LNaHCO3溶液。使用时将Na2CO3溶液与NaHCO3溶液1:1混合即得0.1mol/L，pH10的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
1%CMC-Na溶液配制：
称取1gCMC-Na溶解定容至100mL即得。
DNS试剂配制：
称取酒石酸钾钠182.0 g，于500 mL 蒸馏水中，加热搅拌，依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g，Na OH 21.0 g，苯酚5.0 g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL，棕色瓶中室温暗处放置一周后使用。【张龙翔,张庭芳,李
令媛. 生化实验方法和技术[M]. 北京:人民教育出版社,1982:9-11】
2.2 方法
2.2.1 样品组成菌株的分离纯化
1. 各称取商品菌剂（HM菌剂、金宝贝菌剂、群林菌剂、EM菌剂）10g（或10mL）置于盛有90mL无菌生理盐水，含玻璃珠的三角瓶中，37℃，180r/min震荡60min，将菌剂打碎。取上清作为10-1，依次稀释至10-2,10-3,10-4,10-5。
2. 吸取100μL稀释好的菌液涂布初筛培养基平板，三组平行实验。
3. 将涂布好的平板及其平行组分别置于28℃，45℃，55℃的恒温培养箱中培养（细菌、乳酸菌培养2d；霉菌培养3-5d；放线菌培养7d）。
4. 用接种环挑取分离出的单菌落在相应的分离培养基平板上划线纯化，并置于分离温度下培养至长出单菌落。
5. 挑取4.中的单菌落在相应的分离培养基斜面上划线，分离温度下培养，4℃保存。
2.2.2 产淀粉酶菌株的筛选
2.2.2.1 初筛水解圈的测定
1. 将保种菌株平板划线活化后，挑取单菌落在产酶筛选培养基平板上点种，分离温度下培养1-2d。
2. 培养结束后在平板上滴加1-2mL 0.1mol/L的碘液，（尽量避免滴加到菌落上）显色后测量菌落直径（d）与水解圈直径（D），并计算D/d的比值以此判断待测菌株对淀粉的分解能力。
3. 选出D/d比值较高的菌株，重新编号。
2.2.2.2 复筛酶活的测定[叶应妩，2006]
【叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M ] 第3 版. 南京市:东南大学出版社, 2006】
1.用牙签挑取初筛菌株保种斜面上的菌落，置于分离培养基液体试管中，180r/min，分离温度下培养活化。
2. 吸取1mL OD620值在0.6左右的菌液，置于含100mL产酶培养液的三角瓶中，180r/min, 50℃震荡培养2d。
3. 培养后的产酶发酵液4℃，7000r/min，离心取上清作为酶液。
4. 取5mL ，0.5%的可溶性淀粉溶液加入到试管中，40℃水浴预热10min 。
5. 加入5ml 酶液，反应5min 后用5mL0.1mol/L H 2SO 4终止反应。
5. 取5mL 反应液与5mL0.4mmol/L I2-KI 溶液显色，620nm 测OD 值。（以0.5ml 水代替0.5mL 反应液为空白，以同批配置的淀粉酶空白发酵液离心上清为对照）。
6. 将OD 620值代入以下公式计算酶活力：
D R R R L U ??-=50m /0
0）酶活力（ R0：对照的碘液光吸收值；D ：酶稀释倍数；R ：反应液的光吸收值（调整D 使00R R
R -在0.2-0.7之间，确定40℃，5min 内水解1mg 淀粉的酶量为一个活力单位）。
7. 依据水解圈比值D/d ，及体外酶活测定值，选出3株酶活较高且稳定性较好的菌株作为后期研究菌株。
2.2.3 产脂肪酶菌株的筛选
2.2.
3.1 初筛水解圈的测定
1. 将保种菌株平板划线活化后，挑取单菌落在产酶筛选培养基平板上点种，分离温度下培养3d 。
2. 培养结束后直接测量菌落直径（d ）与水解圈直径（D ），并计算D/d 的比值，以此判断待测菌株对淀粉的分解能力。
3. 选出D/d 比值较高的菌株，重新编号。
2.2.2.2 复筛酶活的测定[QB/T 180
3.93]
【QB/T 1803.93, 工业酶制剂通用试验方法[S]】
1. 同
2.2.1.2中1。
2. 吸取1mL OD 620值在0.6左右的菌液，置于含100mL 产酶培养液的三角瓶中，180r/min, 50℃震荡培养3d 。
3. 同2.2.1.2中3。
4. 取两个100mL 三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中，各加底物溶液(橄榄油乳化液)4.00mL 和磷酸缓冲液
5.00mL ，A 瓶中加人95%乙醇15.0mL 。
5. 两瓶置于40℃±2℃水浴预热5 min ，后在两瓶中各加待测酶液1.00mL 混匀、计时，在40℃±2℃水浴中准确反应15 min 在B 瓶中立即补加95%乙醇15.0mL 终止反应，取出。
6. 于空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液
滴定直至微红色并保持30s不褪为其终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。
7. 将滴定值代入以下公式中计算脂肪酶酶活：
X=200/3×(B-A)×c×n
（X——样品的酶活力，U/g；B——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；A——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL；c——氢氧化钠标准溶液浓度,mol/L；0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;n——稀释倍数）8. 依据水解圈比值D/d，及体外酶活测定值，选出3株酶活较高且稳定性较好的菌株作为后期研究菌株。
2.2.4 产纤维素酶菌株的筛选
2.2.4.1 初筛水解圈的测定
1. 将保种菌株平板划线活化后，挑取单菌落在产酶筛选培养基平板上点种，分离温度下培养3-5d。
2. 培养结束后在平板上滴加1-2mL 1mg/mol的刚果红染液染色30min（尽量避免滴加到菌落上），用1mol/L的NaCl溶液脱色30min后，测量菌落直径（d）与水解圈直径（D），并计算D/d的比值，以此判断待测菌株对淀粉的分解能力。
3. 选出D/d比值较高的菌株，重新编号。
2.2.4.2 复筛酶活的测定[Horikoshi，1984]
【Horikoshi K, Nakao M, Kurono Y, et al. Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil[J]. Can J Micriobiol,1984,30:774-779】
1. 葡萄糖标准溶液的配制[张树政，1984]
【张树政,等. 酶制剂工业[M].北京:科学出版社,1984,595-623】
1）将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100mL。
2）取16支具塞试管，依次编号为0，1，2，3，4，5，6，7并作平行实验。总体积定为9mL，按表1比例混合后，摇匀置于沸水浴中加热5min，冷却后定容至25mL。
3）以0号管为对照分别测定各管的OD540值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线［4］。
表1 葡萄糖曲线制作比例
管号
0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖量（mL ）
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 蒸馏水（mL ）
7 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 DNS （mL ）
2 2 2 2 2 2 2 2
2. 同2.2.1.2中1。
3. 同2.2.1.2中2。
4. 同2.2.1.2中3。
5. 将酶液用0.1mol/L Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液（pH10）适当稀释。取0.2mL 稀释液加入试管中，加入0.5mL 1%CMC-Na 底物溶液，50℃水浴保温30min ，等量失活酶液同样处理作对照，以扣除酶液中的还原糖。
6. 反应结束后的试管中加入DNS 试剂1mL ，沸水浴5min ，冷却后加入4mL 蒸馏水，震荡摇匀，540nm 波长下测定OD 值。
7. 将OD 540值代入以下公式中计算纤维素酶酶活：
)()1000X M T N W ???=（
（N:酶液稀释总倍数；T ：反应时间；X ：酶活，U/mL ；M:样品的体积；W ：从葡糖曲线中查得的葡糖的浓度）
标准菌株的鉴定及其特点
埃希菌属（Escherichia） 1、形态与染色：为革兰阴性短杆菌，多数有周鞭毛，能运动。有菌毛、荚膜及微荚膜。 2、培养特性：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上呈灰白色的光滑型菌落。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。 3、生化反应：吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐（柠檬酸盐）试验（IMViC试验）为++--（肠杆菌属多为--++）。克氏双糖铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸产气，H2S阴性。动力、吲哚、尿素（MIU）培养基的生化反应为++-. 4、致病性大肠埃希菌有下列五个病原群。 （1）肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）：引起儿童腹泻和旅行者腹泻（水样泻）。 （2）肠致病型大肠埃希菌（EPEC）：主要引起婴幼儿腹泻。 （3）肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）：可侵入结肠黏膜上皮，引起志贺样腹泻（能产生粘液脓血便）。 （4）肠出血型大肠埃希菌（EHEC）：又称产志贺样毒素（VT）大肠埃希菌（SLTEC或UTEC），其中O157：H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS）。严重者可发展为急性肾衰竭。 （5）肠粘附（集聚）型大肠埃希菌（EAggEC）：与世界各地慢性腹泻有关。 5、CDC将大肠埃希氏菌O157：H7列为常规检测项目 沙门菌属（salmonella）
1.形态与染色：为革兰阴性直杆菌，无芽胞，无荚膜。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。？ 2.培养特性：营养要求不高，在普通琼脂培养上即能生长，在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35℃～37℃24h可形成直径约2～4mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。？ 3.生化反应：除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖，大多数IMViC试验为-+-+，KIA：K／A、产气+／-、H2S+／-，MIU：动力+、吲哚-、尿素酶-。 4.致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种。临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。？ （1）肠热症：即伤寒与副伤寒病。由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状。为法定传染病之一。？ （2）食物中毒：引起食物中毒的沙门菌以鼠伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。？ （3）慢性肠炎：沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。？ （4）败血症：多由猪霍乱沙门菌引起。？ （5）沙门菌的局部感染如颈部、腰部等。 血清学诊断：肥达试验：用已知的伤寒沙门菌0、H抗原，甲乙丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。 志贺菌属（shigella） 1.形态与染色：革兰染色阴性，杆菌，无鞭毛,有菌毛.？ 2.培养特性：在肠道鉴别培养基上形成无色,半透明的菌落.均能分解葡萄糖只产酸不产气,
青霉素高产菌株的理性筛选
遗传育种与生物合成 文章编号:1001-8689(2007)07-0403-02 青霉素高产菌株的理性筛选 娄忻 张莉 刘靓 张玉莲 陈丽华 刘静 贺建功 (华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心, 石家庄050015) 摘要: 以青霉素生产菌种87117#为出发菌种,采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法,结合限氧条件下的摇瓶筛选,从177支前体抗性株中筛出XY -137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定,单位菌丝产物合成能力强。XY -137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证,其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 关键词: 紫外诱变; 动态后处理; 理性筛选; 青霉素高产菌株中图分类号:T Q 465.1 文献标识码:A Rational screening of penicillin high producing strain Lo u Xin, Zhang Li, Liu Liang, Zhang Yu-lian, Chen Li-hua, Liu Jing and H e Jian-g ong (N ew Dr ug R&D Co.,L td of N or th China Phar macentical Co rp., N ational Eng ineering Resear ch Center of M icro bial M edicine , Shijiazhuang 050015) ABSTRACT U sing Penicillium chry sogenum #87117as starting strain ,a penicillin high yield str ain #XY-137w as obtained by U V irr adiation com bined w ith precurso r-resistant strain in shake flask selection metho d under lim ited o xyg en.Penicillin potency of strain #XY-137w as increased by 8.8%cultured in shaking flasks.Average pr oductivity o f about 100batches ferm entation level w as increased by 2.69%～5.66%than that of strain #87117in 100-ton ferm entor . KEY WORDS U V m utagenesis; Dynamic po st-treatment; Rational screening ; Penicillin high-pr oducing strain 收稿日期:2007-03-15 修回日期:2007-05-08 作者简介:娄忻,女,生于1963年,高级工程师。主要从事微生物药物产生菌的遗传育种研究。 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛,世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平,降低生产成本以增强企业的竞争力,而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高,传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理,根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计筛选方法,定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念,参照现有生产条件设立基本筛选模型,采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构,再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选,达到选育高产菌株的目的。1 材料与方法1.1 出发菌种 青霉素生产菌种P enicillium chry sogenum 87117#。 1.2 培养基 (1)分离及斜面培养基 蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl 、CaSO 4、微量元素、琼脂。(2)种子培养基 以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基 以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源,加无机盐类组成。1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变 将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm 处照射90s 。 (2)前体动态后处理 定量吸取经过紫外线照射后的孢子液,分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中,使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h 左右,然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出 平板置25℃恒温培养 ? 403?中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期
菌株筛选方法
第二章餐厨垃圾堆肥产酶菌株筛选 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验材料 1）筛选材料：HM菌剂（河南恒隆态生物工程股份有限公司）；EM菌剂（江西天意集团）；金宝贝菌剂（北京华夏康源科技有限公司）；群林发酵剂（广西北海群林生物工程有限公司）。 2）发酵材料：餐厨垃圾（购自贵州大学南校区学生食堂）；稻草（购自铜仁市，晒干后粉碎至5mm左右）。 2.1.2 主要药品及试剂 2.1.3 实验仪器 电子分析天平（EL-2005）西特传感技术有限公司 高速台式离心机（TGL-161）Thermo公司 冷冻离心机（2-16k）德国eppendorf公司 标准型净化工作台上海锦星科学仪器有限公司 低温冰箱〔BCD-108E）风华电器厂 超低温冰箱(Forma-6C ULT) Thermo公司 调温调湿箱（WS/08-01）重庆试验设备厂 干燥箱（101-2）上海实验仪器总厂 自动三重水蒸馏器（SZ-97）上海亚荣生化仪器厂 高压灭菌锅（GMSX-280）英国阿斯太欧（Astell）公司 循环水浴锅（RET7）Thermo公司 电热恒温培养箱（DH3600) 天津泰斯特仪器有限公司
恒温摇床（SKY-2102C) 上海苏坤实业有限公司 高速组织捣碎机（DS-1) 上海标本模型厂 磁力双向搅拌器（90-1）上海亚荣生化仪器厂 pH计 ACS交直流两用电子计价秤昆明金瑞克电子衡器有限公司 双金属温度计（WSS-411）天津市新华热工仪表有限公司 河北铁狮磨浆机械有限公司 秸秆揉丝饲料粉碎多用机 （9R-30) 紫外分光光度计 2.1.6 培养基 1）初筛培养基 （1）细菌培养基（%）：牛肉膏0.3；蛋白胨1.0；氯化钠0.5；琼脂粉2.0；pH7.2 （2）霉菌培养基（%）：磷酸二氢钾0.1；七水硫酸镁0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；琼脂粉2.0；孟加拉红0.03；pH自然；链霉素30μg/m L （3）乳酸菌培养基（%）：蛋白胨1；牛肉膏1；酵母膏0.5；柠檬酸二铵0.2；葡萄糖2.0；吐温80 0.1；乙酸钠0.5；三水磷酸氢二钾0.2；七水硫酸镁0.058；七水硫酸锰0.025；琼脂粉2.0；pH6.2 （4）放线菌培养基（%）：可溶性淀粉2；氯化钠0.05；硝酸钾0.1；磷酸氢二钾0.05；七水硫酸镁0.05；七水硫酸亚铁0.001；重铬酸钾0.015；琼脂粉2.0；pH7.4；青霉素3μg/ml 2）复筛培养基 （1）产淀粉酶筛选培养基（%）：可溶性淀粉0.2；蛋白胨1.0；酵母膏0.5；磷酸氢二钾0.3；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；琼脂粉2.0；pH7.0 【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】 （2）产脂肪酶筛选培养基（%）：硫酸铵0.1；磷酸氢二钾0.1；氯化钾0.05；七水硫酸镁0.01；橄榄油1.0；聚乙烯醇0.1；琼脂粉2.0；pH8.5 【刘敏,曹志军,焦艳芬,等. UHT 乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究[J]. 内蒙古农业大学学报.2008,29(1):230-233】 （3）产纤维素酶筛选培养基（%）：七水硫酸镁0.01；羧甲基纤维素钠1.5；氯
(完整word版)菌种筛选方法
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化 反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group
青霉素高产菌株的理性筛选
作者：娄忻张莉刘靓张玉莲陈丽华刘静贺建功 【摘要】以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出xy-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。xy-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 【关键词】紫外诱变；动态后处理；理性筛选；青霉素高产菌株 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛，世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平，降低生产成本以增强企业的竞争力，而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高，传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念，参照现有生产条件设立基本筛选模型，采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构，再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选，达到选育高产菌株的目的。 1 材料与方法 1.1 出发菌种 青霉素生产菌种penicillium chrysogenum 87117#。1.2 培养基 (1)分离及斜面培养基蔗糖、甘油、酵母粉、nacl、caso4、微量元素、琼脂。 (2)种子培养基以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成。 1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm处照射90s。 (2)前体动态后处理定量吸取经过紫外线照射后的孢子液，分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中，使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h左右，然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出平板置25℃恒温培养8d。从耐受不同浓度前体处理后长出的抗性菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养，以备摇瓶筛选。 (4)摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株将摇瓶机转速由通常的220r/min降至160r/min，在低通气条件下进行摇瓶筛选。后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。 摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量(packed mycelial volume,pmv)。 1.4 样品检测 2 结果 2.1 xy-137#高产突变株的选育 出发菌株87117#先经过两次自然选育，然后采用紫外线复合前体动态后处理，挑取177支抗性株，在限氧条件下进行摇瓶筛选。于3.84%前体耐受浓度下获得xy-137#高产突变株，以87117#为对照，其5d和7d摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%，摇瓶效价平均提高了8.8%。
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确 保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容： 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即 称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购 买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及 每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种 的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同， 细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），
菌种筛选方法
菌种筛选方法 5.6 菌种筛选方法 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也 为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 5.6.1菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质 为主，应精确测定每个菌株的生产指标。 5.6.2 菌种筛选的手段筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、 简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。 5.6.2.1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremohow(event)" class="t_tag">thecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 5.6.2.2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图 5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体
标准菌株
概述：标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。 1.对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等 2.每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。 3.购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉汤中，-20℃以下保存。 4.新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。 5.标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。 本篇文章来源于检验在线https://www.360docs.net/doc/9f9751976.html,/ 原文链接：https://www.360docs.net/doc/9f9751976.html,/paper/manual/1OMDAwMDAwMDc1OQ.html 目的: 建立检定菌的管理制度。 范围: 检验用菌种的管理。 责任者: 化验员、中心化验室主任。 程序： 1、菌种接收 （1）检定菌由专人保管，此人须受过专业培训，有足够的菌种保存经验。 （2）根据检验品种的需要，由检定菌保管员制定购买计划，报中心化验室主任审核、质量部负责人批准。（3）检定菌保管员在接收标准菌种时，须填写接收记录，并在保存菌种容器外加贴标签（内容为名称、编号、接收日期），妥善保管。 2、菌种的移植传代 （1）长久保存的菌种在启用时，要经移种至适宜的培养基上进行培养，待生长后再行移种，如此连续2—3次，甚至多次，直至出现典型的形态和生化特征为止。 （2）保存的菌种须按规定时间进行传代。 （3）在检查或保存菌种过程中，遇有形态构造上有变异或污染菌等情况，需进行菌种移植分离培养以得到纯菌。 （4）移植传代时须核对编号、传代次数、传代日期、所用培养基等并记录。每次移植传代后，要与原种的编号、名称核对，检查培养特征无误时方可再继续保存。 （5）传代次数必须控制，传代次数越多，突变的机率越大。因此要尽量少传代，必须根据菌种保存情况规定最多传代次数。 第2页共2页 3、菌种原种须按标签或所附说明书妥善保存，并上锁，以保证安全，防止意外。移植传代后的菌种于普通冰箱内2—8℃保存，每周检查一次冰箱温度、湿度，菌种管的棉塞是否松动生霉，有无异常，并逐次记录。 4、菌种的使用和销毁 （1）每次使用的菌种必须是培养后健康、生命力强、无变异的菌种。每次使用菌种均须作记录。 （2）超过传代限度或经鉴定检查不合格的菌种，报中心化验室主任、质量部负责人审核批准后销毁灭活（加
标准菌株质量控制作业指导书
标准菌株质量控制作业指导书 1、目的： 对微生物标准菌株的验收、复活、确认、转代、储存、使用、废弃等进行规定，确保标准菌株符合要求，保证检测结果。 2、职责： 2.1、检测中心主任负责标准菌株资源的配备。 2.2、微生物检测室工作人员负责标准菌株的有效储存和正确的使用。 3、要求： 3.1供应商的选择：选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须有附件的供应商的合格证或检测报告，来证明所采购的标准菌株是合格的。 3.2标准菌株和验收 菌株一到实验室，一定要记录好菌株号和标准菌株来源，确保溯源性清楚。同时，还应尽可能多的菌株信息，如：标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等。 3.3冻干标准菌株的复活： 3.3.1、开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，从凹口处撕开产品外包装，撕掉标签上的拉片，将其贴于菌株保藏管上。 3.3.2、复活：选择合适的培养基和培养条件（根据生产商说明）进行复活。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。捏管帽处安瓿瓶（仅一次）使其释放水合液体。垂直握住安瓿瓶并轻拍之，使液体流入含小球的管底。通过挤捏压碎小球使其与液体混合，立即将拭子浸于水合液体。挤压并旋转拭子，接种于初级培养平板，接种圈的直径约为25mm，用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20次，促使分离出单菌落。同时吸出部分菌液接种胰蛋白胨大豆肉汤管，副溶血性弧菌接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤管。将接种好的平板和管立即进行培养。细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出，但是少数菌会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。复活后的菌株为F1代。 3.3.3将TSB生长的浓菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混匀后将液体吸出，将保藏管-18℃保存1-3年为标准储备菌株F2代。将平板上生长的良好菌株接种
生物腐殖酸高产菌株筛选详解
实习报告 题目：生物腐殖酸高产菌株的筛选姓名：黄兆峰 学号：080500130 学院：生物科学与工程学院 专业：微生物工程 年级：2005
生物腐植酸高产菌株的筛选 摘要：腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中，目前已在工农业、医学与环境保护等方面发挥着重要的作用。 福建省诏安县绿洲生化有限公司自主研制的生物腐植酸，富含多种有益微生物，已在水产养殖、水质改良、发酵泥炭生产高养分绿色环保肥料等方面取得了良好的社会经济效益。但由于生产仍是土法建堆的模式，并未筛选功能明确的发酵菌种进行发酵，因此存在产酸低、产品质量不稳定等缺陷。为此，本课题以工厂发酵原料与发酵产品为基质，进行腐植酸高产菌株的分离筛选，测试初筛的单一菌株产腐植酸的能力，并开展了优势单一菌株的复合发酵与扩大发酵研究，结果如下： 1）从发酵蔗渣原料与发酵产品中进行菌种分离，经耐45℃高温和降解纤维素试验，共初筛获得12株能在45℃下生长且降解纤维素良好的菌株，其中细菌11株，霉菌1株。 2）将初筛的菌株以模拟工厂发酵生产腐植酸的条件对其产腐植酸能力进行测试。通过300ml三角瓶发酵,以产腐植酸为指标，测定分离菌株25号菌和A号菌产腐植酸为最优，12#和E号菌次之。其中25号菌株腐植酸含量增长为6.98%，A号增长6.63%，12号菌增长5.63%， E号增长5.22%。由于A号菌为霉菌，所以暂不考虑其发酵能力。故筛选出12号菌，25号菌和E号菌为优势菌株。 关键词：菌种筛选，腐植酸含量，分离纯化
第一章前言 1.1腐植酸的概述 腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中。近年来，腐植酸类物质的应用越来越广，涵盖了农业、医药、工业等多个领域。腐植酸在农业上的应用以肥料为主。一方面，其本身就可以促进作物呼吸和新陈代谢、促进各种酶特别是糖转化酶的活性、促进细胞发育和植物生长、增强植物吸收养分能力等，从而提高作物的产量。另一方面，腐植酸对化肥和微肥有明显的增效作用，它能与化学肥料复配成有机—无机复合肥，增加肥效，减少化肥被固定和流失，提高化肥的利用率；同时，腐植酸结构单元上含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、半醌基、甲氧基、烯醇基、胺基等多种活性功能团，作为一种源广价廉的天然螯合剂，腐植酸与土壤中难溶于水的微量元素等螯合后使得微量元素很容易被作物吸收和运转。自然界腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及煤炭中。我国是腐植酸资源大国，其资源储量大，分布广，品位好[1，2,3]。近年来，我国也通过秸杆发酵生产人工合成腐植酸类物质的生化腐植酸[4]。腐植酸类物质的基本性质和特征决定了它在保持农业生态系统健康中有着重要的应用意义，因而也越来越引起人们的重视[5]。 1.2 腐植酸的形成 关于腐植酸形成的微生物学机理在20世纪主要有七种影响着我国学术界。一是瓦克斯曼提出的木质素----蛋白质复合体学说；二是威廉斯提出的微生物作用学说；三是微生物合成假说；四是植物和微生物细胞自溶假说；五是科诺诺娃学说；六是恩德斯提出的植物残体形成腐植酸的过程和煤化机制；七是我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论,即水解阶段—产酸阶段—合成和聚合阶段。指出参与厌氧发酵形成腐植酸的微生物不是一个纯菌种,而是由多个微生物生理群联合作用的结果。在此对我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论进行阐述。 边文骅学者从自然界选取优质活性污泥为菌种，在室内富集培养扩大，优化生产条件，在500mL、5000mL发酵器发酵试验的基础上，扩大为1m3、20m3环流厌氧发酵器的中试生产规模均获得了良好的效果。从而认识到，腐植酸是有机物质（动、植物残体）在适当的温度、湿度、酸碱度和厌氧条件下，通过功能不同的多种微生物的代谢，形成腐植酸的过程，这一过程大概分为三个阶段。 第一阶段，或称水解阶段，由发酵细菌产生胞外酶水解大分子有机物质如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶质、脂肪和蛋白质等。根据他们作用的底物不同，分别称为纤维素分解菌、半纤维素分解菌、木质素分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌和蛋白质分解菌等生理群，在它们的作用下，多糖类物质水解为单糖，蛋白质水解为肽和氨基酸，脂肪
葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序
葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序 1 概述 葡萄球菌属是一类触媒试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌，表面葡萄球菌、腐生葡萄球菌等32个种。是临床最常见的化脓性球菌，广泛分布于自然界中，在人体表面鼻、咽、肠道也经常存在。 2 形态与染色 革兰阳性球菌，直径0.4~1.2μm成单、双、短链或不规则状排列。在液体培养基浓汁标本中，往往排列成双或短链状多数有鞭毛。 3 培养特性 金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上典型菌落为金黄色，周围有明显的透明（β）溶血环，部分菌落呈橙色，在高盐甘露醇平板上呈橙色菌落。表皮葡萄球菌等其他葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，不溶血。 4 生化反应 触酶试验阳性，多数能分解葡萄糖、麦蚜糖、蔗糖和甘露醇。不分解棉籽糖和水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶实验分阳性。 5 鉴别要点 5.1 本菌属特征：触酶实验阳性，革兰阳性球菌，葡萄状排列，菌落中等大小，中等干燥。 5.2 与微球菌属的鉴别：触酶实验都为阳性，但O∕F试验葡萄球菌属为发酵型，而微球菌为氧化型或无反应，而且菌体较葡萄菌属更大，排列呈四联状为主。5.3 与链球菌属的鉴别：葡萄球菌属触酶试验都为阳性，而链球菌为阴性，O∕F试验葡萄球菌属为发酵型而链球菌为氧化型。 5.4 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表。 结合型凝游离型凝鸟氨酸脱 菌名PYP试验DNA试验VP试 验 固酶试验固酶试验 羧酶实验
金黄色葡萄球菌+ + - + + - 中间型葡萄球菌- + + + - - 施氏葡萄球菌+ - + + + - 路邓葡萄球菌+ - + - + + 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“--”为90%以上菌株为阳性。 5.5 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表 + 腐生葡萄球菌——+ V + + — 溶血葡萄球菌+ ——V + — — 人型葡萄球菌——+ —+ — — 华纳葡萄球菌——+ V + —— 模仿葡萄球菌+ —+ + + —— 头状葡萄球菌——V + + ——
脂肪酶高产菌株筛选材料方法
2 脂肪酶高产菌株筛选 2.1 前言 常见的筛选脂肪酶高产菌的方法是含甘油三酯琼脂平板法，我们以橄榄油为底物，溴甲酚紫为指示剂，通过平板法筛选脂肪酶高产菌株。 2.2 材料和方法 2.2.1 土样 从襄樊、武汉、十堰等地的油脂厂、油坊、奶牛场、食堂采集土样208份。 2.2.2 设备与试剂 本试验所用到的药品试剂除橄榄油外均为分析纯；橄榄油为国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯。 试验仪器和设备如下： OHAUS分析天平AR1530 奥豪斯国际贸易有限公司 乳化机CZD3 上海氟鲁克流体机械制造有限公司 磁力搅拌器79-2 金坛市新航仪器厂 灭菌锅YX-400B 上海三申医疗器械有限公司 超净工作台SW-CT-2FD 苏州净化设备有限公司 生化培养箱SPX-150B-Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂 2.2.3 溶液配制 2％（w/v）的聚乙烯醇水溶液：称取聚乙烯醇固体20g，倾入1000mL蒸馏水中，然后边加热边搅拌直到聚乙烯醇全部溶解。静置冷却至室温备用。若有少量杂质不溶解，可通过滤纸过滤去除杂质。
橄榄油乳化液：分别量取橄榄油25mL和2％聚乙烯醇水溶液75mL，混合，置4℃平衡1h，然后10000r/min乳化三次，每次一分钟。4℃保存备用。若高温灭菌后产生分层，可充分振荡至分层现象消失，而无需重新乳化。 2.2.4 筛选培养基 平板粗筛培养基（％）：酵母膏0.1，蛋白胨0.2，硫酸铵0.2，橄榄油乳化液1.2，磷酸氢二钾0.1，氯化钾0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。 平板复筛培养基组成（％）：蛋白胨1.0，蔗糖0.5，橄榄油乳化液1.2，硫酸铵0.1, 磷酸氢二钾0.1,氯化钾0.1,硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。 摇瓶复筛液体培养基（％）:蛋白胨2.0，蔗糖1.0，橄榄油乳化液1.0，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.2。 筛选培养基于121℃灭菌20min，平板粗筛培养基和平板复筛培养基从灭菌锅取出后，每升培养基冷却到60℃加入无菌的10mg/mL溴钾酚紫10mL，混匀，趁热倒平板。 2.2.5 筛选方法 平板初筛：称取10g土样，倾入100mL无菌水中，充分振荡10min后，移取1mL梯度稀释至10－6倍浓度，取10－4～10-6稀释液20μL～50μL涂平板，28℃培养72h，挑选有黄色变色圈和透明圈菌落，经划线或无菌水梯度稀释平板培养获得单菌落，PDA试管保藏供平板复筛。 平板复筛：将粗筛菌种穿刺接种在复筛平板上，每平板（d9cm）可接三株，于28℃培养72h。挑选变色圈和透明圈较大的菌株进行摇瓶复筛。 摇瓶复筛：平板复筛挑选出的菌株进行摇瓶复筛，250mL三角瓶装液50mL,28℃, 200r/min培养72h。发酵液离心（3000r/min,15min），取上清液测酶活。 脂肪酶活力测定：滴定法测酶活[109]。酶活力测定以橄榄油乳化液为底物, 底物4mL、Tris·HCl（pH7.20, 50mmol/L）5mL、发酵上清液1mL组成10mL反应体系，31℃水浴反应十分钟，然后加入95％乙醇10mL终止反应。酶催化水解脂肪酸量通过0.05mol/L NaOH滴定测得，加二滴1％酚酞指示滴定终点。在上述条件下，水解橄榄
a-淀粉酶高产菌株筛选实验
a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。 淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。 a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。 【实验一】 一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选 二、【实验原理】 大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。透明圈越大，产酶能力越强。 三、【实验仪器和材料】 1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液 配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 2、淀粉酶筛选富集培养液（细菌） 淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至 pH 为7，取300ml分装9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 3、淀粉酶筛选培养基I（细菌） 淀粉3g、硫酸铵3g、氯化钠1.5g，用无机酸碱调pH值至7.0左右，加蒸馏水定容至300 ml，再加琼脂5.4g，装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。 4、淀粉酶筛选培养基II（细菌） 淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L，调至 pH 为7，再加18g琼脂，取300ml分装9 ml 于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 5、器材 烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片
标准储备菌株纯度确认标准操作规程
1.目的：建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2.范围：微生物限度实验室所用标准储备菌株。。 3.职责：QC主管生测员对本规程的实施负责。 4.依据：中国药典2015年版四部通则。 5.内容： 5.1.实验菌株 5.1.1 标准菌株 5.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2 工作菌株 5.1.2.1 标准储备菌株可用于定期转种（每3个月）或制备工作菌株。 5.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2 菌种确认试验的主要内容 5.2.1 菌种的纯度确认 5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2 实验内容
⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，用一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ⑵镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2 菌种的特性确认 5.2.2.1 生化试验 各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1 大肠埃希菌的确认 5.3.1.1 菌落形态 ⑴取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 ⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24小时后，观察结果。 ⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。