金属硫蛋白基本知识

金属硫蛋白

1、MT命名及定义

根据与 MT结合的金属的不同，对只舍一种金属，例如 Cd或 Cu等，可分别定名为镉金属硫蛋白或铜金属碗蛋白等；还可根据结合金属的摩尔含量写成

Cd

7–MT、Zn

7

–MT等 (表示每分子结合7个分子Cd或Zn)。对于含一种以上金属，

如同时含 Cd和Zn时，可写成Cd，Zn-MT。对其分子结构上的差别，可用罗马数字和小写字母标出，例如MT-Ⅱ、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ

a

等。

经典MT定义：根据金属硫蛋白命名委员会（Thecommitteeon the Nomenclature of Metallothionein）的建议，1988年，Kagi将具有以下特征的蛋白质或多肽定义为MT（Kagi & Schaffer, 1988）。

1.低分子量，一般为6,000－7,000道尔顿，含60-63个氨基酸残基；

2.高金属含量，每分子蛋白质可结合7个二价金属离子，或多至18个一价金属离子；

3.特有的氨基酸组成，无芳香族氨基酸及组氨酸；

4.富含Cys残基(约23-33%)，无二硫键；特征的氨基酸序列，Cys残基在氨基酸序列中占据相当保守的位置；

5.所有的Cys残基均以还原态存在；并通过巯基以硫酯键结合金属离子；从而具有金属巯基化合物的特征吸收光谱。

实际上，这只是对经典MT的一个定义。现在MT家族所包括的成员远远超出以上定义的范围。

※ Cys半胱氨酸

2、MT的分类

1.1 根据 MT的结构差异，一般将其分3类

第1类：MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置与最先从马肾中分离的 MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置紧密相关的多肽。所有哺乳动物的 MT都属于这一类。其它来源的 MT只要其基本结构与哺乳动物的MT相似亦归这一类。

第2类：MT氨基酸序列结构中的半胱氨酸位置与马肾 MT关系较远，与哺乳动物 MT没有或很少有相似的进化关系。如酿酒酵母和某些高等植物的 MT属于这一类。

第 3类：非典型的 MT。是一类由非转译合成的金属硫醇盐多肽，由γ-谷氨酰半胱氨酰基单元组成。这类MT主要来源于真核微生物，常称之为类 MT。依据它们之间的差异，又可分为4种类 MT：

第一类：含大量的酸性氨基酸残基，天冬氨酸含量大于 14％，谷氨酸含量大于18％，这类 MT仅被Cu、Ag诱导。

第二类：它们由同样的肽基亚单位构成，基本结构为γ-谷氨酰肽或称(γ

-EC)

n G 或 (γ-Glu-Cys)

n

-Gly。

第三类: MT不舍芳香族氨基酸，分子量为9～9.5kD。

第四类：MT的分子量为 7kD，具有重复 Cys-Xaa- Cys多肽序列的二分子。

※巯(qiu)基-有机化合物中含硫和氢的基，通式为-SH

3、金属硫蛋白的诱导

用于诱导MT试验的动物很广泛。小鼠因其来源广、价廉常被用来做诱导 MT 试验。此外，田晓光等利用舍蝇幼虫提取了金属硫蛋白，发现每克舍蝇幼虫中约含金属硫蛋白0.8 mg，此结果显示，舍蝇可以用于提取金属硫蛋白。郭祥学等用锌诱导蓝藻也成功分离出了类金属硫蛋白。而兔子因具有来源广、价廉、易饲养、MT产率高等优点而常用于MT制备的诱导，其中尤以青紫兰家兔因其耐受性强而广泛应用。目前，诱导金属硫蛋白有如下几种方法：金属诱导、激素与应激诱导、在疾病状态下诱导等。

⑴金属诱导 MT。许多金属如 Cu、Ag、Au、Zn、H g、Cd、C0、Ni、Al等均能诱导MT的合成。大量研究表明，动物注射金属诱导后，其肝、肾、脾、肠等器官内MT的含量增加。Cd、Hg诱导金属硫蛋白的能力较强，而Zn稍弱。余美祥等给家兔注射CdC1，在肝脏中提取MT得到了良好的结果。但Cd对生物体有害，而去掉Cd的方法复杂，故此元素的应用受到一定的限制。目前的医药试验是通过直接注射ZnSO 诱导 MT合成，所得 MT完全是Zn—MT。郝守进等发现外源性的Zn诱导兔肝金属硫蛋白含量显著提高。

⑵激素与应激对MT的诱导。肝脏是 MT表达的主要场所。给兔注射激素，如糖皮质激素、胰高血糖素、肾上腺素等均能增加兔肝MT mRNA水平，从而使肝脏中MT合成增加。此外，各种生理、病理或心理应激状态，以及炎症因子、机体的应激状态也能增加兔肝 MT mRNA的转录，同时伴有血浆中Zn 浓度的下降。

目前，已有试验发现，应激能激活下丘脑一垂体肾上腺轴，引起糖皮质激素和儿茶酚胺的增加。这些物质能调节组织中(包含它们的感受器1不同目标基因的表达。而肾上腺轴被激活后，对提高 MT-I和 MT-1I基因表达至关重要。同时有些数据分析表明，面对抑制性心理应激，组织通过增加 MT-I和 MT-Ⅱ基因的表达，能有效抵抗应激的有害影响。

⑶疾病状态下诱导 MT。通过由增殖性因素刺激皮肤。对正常皮肤增生的表皮组织及增生的病损皮肤区域染色，发现 MT mRNA表达增加，这表明MT在表皮角质细胞的增生过程中发挥作用。另有试验发现，在皮肤伤处于早期急性阶段的细胞中MT mRNA表达增加。兔的外科手术中发现，随着局部使用氧化锌、氯化镉、硝酸银后，会出现局部 Zn浓度的积聚和伤口边缘基质细胞 MT的释放，使用氧化锌、硝酸银的兔子和对照组相比伤口愈合较快，这一点也给临床药物开发提供了潜在的治疗价值。肿瘤组织、癌组织和患有心血管系统疾病及中枢神经系统(CNS)疾病的动物组织中MT的含量普遍提高，目前在国外已有试验试图通过疾病提取诱导 MT，但试验方法有待于进一步优化，这将为以后人们对硫蛋白的提取提供新的思路。

⑷转基因诱导表达 MT。有人把结合重金属离子能力很强的小鼠 MT-I基因(mMT-I cDNA)与蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smtO-P)构成金属调控单元，导入

聚胞藻 PCC6803中进行金属诱导表达和纯化 mMT-I。在做小批量锌诱导表达和纯化了外源蛋白后，检测了转基因对于提高蓝藻金属离子耐受能力的作用，这为基因工程制药进行了有益的研究与探索。张晓钰等用另一个α结构域取代金属硫蛋白的β结构域，得到金属硫蛋白αα突变体后，再使这个突变体αα-cDNA在烟草中表达，发现αα-cDNA在烟草根部的表达强于叶部，同时，转基因烟草对Cd+抗性提高。而人们应用此方法对于兔肝中金属硫蛋白的提取尚在探索之中。

4、MT的分离纯化

分离纯化MT的常用方法是凝胶过滤和离子交换技术相结合的层析法，微量分离可以采用HPLC法,但是凝胶过滤法不能将MT的不同“亚型”分开。KIaassen 等建立的阴离子交换的HPLC-AAS法可将MT的亚型分开,KIauserdeng建立的反相HPLC法可分离不同来源的MT。此外，也有采用DEAE-Sepharose fast flow 方法分离MT的。这些分离纯化方法有其明显的优点，但也有不足之处，如何建立简便分离纯化MT的方法仍是一个热门课题。

凝胶过滤层析和离子交换层析技术相结合的是最常用的兔肝金属硫蛋白的分离纯化方法。分离纯化的一般流程为：粗分、拆分和脱盐。不同种属、不同组织 MT的分离纯化存在一定的差别，兔肝中常用两次离子交换层析张保林等则利用了MT强热稳定性这一特点，预先对萃取液进行热处理，以除去大部分杂蛋白，从而经一次凝胶分离，一次离子交换拆分得到了高纯度的 MT—I和 MT一Ⅱ，不仅简化了试验过程，也避免了多一次离子交换层析造成的样品损失，提高了回收率。

在对兔肝金属硫蛋白的分离中，微量分离常采用HPLC与阴离子交换的HPLC-AAS法，大量制备MT则增大层析面积即可。另外，也有采用DEAE-Sepharose Fast F1ow凝胶来分离金属硫蛋白，由于该凝胶具有流速快、容量大，而且溶涨体积不受缓冲液离子强度变化影响等优点，所以每次用完后，不需重新装柱。将二价铜离子螯合在 Chelating SepharoseFast Flow凝胶上制成亲和层析柱的方法，锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝经匀浆、乙醇处理后上柱，用pH值4.0的醋酸盐缓冲液平衡，再用 pH值 5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液洗脱，可得 MT-I和 MT-II两个洗脱峰，此法比传统的凝胶过滤一离子交换法简单、省时、适于实验室规模分离纯化。

5、MT的检测方法

现有的检测方法都是建立在MT的理化特性以及免疫学特性基础上。可分为以下几类：⑴测定结合金属以计算MT的含量，如镉血红蛋白饱和法和银血红蛋白饱和法；⑵测定SH基以计算MT的含量，主要有微分脉冲极谱法和循环伏安法；

⑶测定蛋白含量：包括免疫学方法，如RIA,ELISA等；还有色谱分析法,如HPLC 和HPLC-AAS法。从方法学上讲，测定组织器官中的的MT含量，首推HPLC-AAS 和血红蛋白饱和法，测定血液的MT含量，选用RIA和ELISA 法为佳。

6、一般理化特性

研究表明不同来源的MT的分子量一般为6500道尔顿, 去除金属后即硫蛋白

分子量（thionein）为6000道尔顿。从不同哺乳动物的组织中提取的MT的分子大小和形状基本是一致。从粗糙链孢霉菌(Neurospora crossa)中分离出的MT，其分子量比哺乳动物的MT低得多（只有25个氨基酸残基），但基本结构十分相似。

使各种金属硫蛋白中50%的金属离子发生解离的pH为：Zn-MT，PH3.5-4.5；Cd-MT，PH 2.5-3.5；Cu-MT的 PH低于1。脱掉金属后的硫蛋白在低PH值是很稳定的, 但当PH调至中性时,通过二硫键的形成, 蛋白分子间很快被相互交联而形成不同大小的分子。因此,金属硫蛋白的存在形式及稳定性与它所结合金属的种类、是否结合了金属及环境的PH密切相关。

金属硫蛋白的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外,也与它所结合的金属种类密切相关。因蛋白分子中不含芳香族氨基酸, 所以它没有280nm的吸收峰, 只具有与金属结合而产生的特征吸收峰：Zn-MT为220nm；Cd-MT为250nm；Cu-MT 为270nm。在脱掉了金属后,硫蛋白在190 nm处有一明显的肽键吸收峰。

7、MT的结构特性

根据已测定的几种不同生物的MT氨基酸序列可发现，它在生物进化上是很保守的，尤其是哺乳类动物的MT均含61个氨基酸残基，其中有38个相同，完全缺乏芳香族氨基酸和组氨酸,氨基末端皆为N-乙酰蛋氨酸，羧基末端皆为丙氨酸，更为惊奇的是所有这些MT都有20个半胱氨酸。

但从另一些生物中分离出的MT的氨基酸组成与以上所述有一些差别，如从稻类作物根部分离到的MT,分子量只有5600道尔顿，氨基酸组成中含44%半胱氨酸和39%的谷氨酸。另外,大多数哺乳动物组织中都含有两种以上的“亚型”,如小鼠肝脏分为MT-1和MT-2，而人肝脏中分离到的“亚型”至少有四种以上。这种“亚型”只是在离子交换层析分离时才能分开，因为它们之间所带电荷略有微小的差异。

8、MT的空间结构

通过圆二色性和晶体结构研究发现,金

属硫蛋白分子中不含α-螺旋和β-折叠片,

而存在一种十分坚固的构象,因此，它具有

很强的抗热性和抵抗蛋白酶消化的能力。MT

的三级结构以两个结构域(Domain)为特征，

即分子前半部(氨基端头30个氨基酸残基)

为β结构域，分子后半部(羧基端30个氨基

酸残基) 为α结构域，彼此都单独呈球状，两者通过第30和31位氨基酸残基连接使整个MT分子呈哑铃状。晶体结构分析表明,在这两个结构域内,为了更适于结合金属，多肽链盘绕着金属离子而各形成三个回折。

β区9个半胱氨酸残基结合3个原子的Zn或Cd或6个原子的Cu；

α区11个半胱氨酸，可结合4个Zn或Cd或结合5-6个原子的Cu。

金属离子全与所有半胱氨酸的巯基结合, 因此，天然的MT分子不含二硫键，也没有自由的巯基存在，在每个区中Zn或Cd都是以二价状态和4个半胱氮酸的巯

基相结合, 形成〔金属2+（Cys-）

4

〕2-复合物而使得整个分子带负电，但Cu则是以一价的形式结合。

9、MT金属结合位点

重金属离子与MT结合的相对亲合性不一样, Cu的稳定系数要比Cd大100倍，而Cd又比Zn大1000倍, Hg和Ag又比Cu稳定得多，即与蛋白结合的稳定性依次为Hg 和Ag＞Cu＞Cd＞Zn。在PH很低的情况下,金属离子从MTs上脱落而产生无金属的硫蛋白。体外金属重建实验表明：其和α和β结构域对Cd的络合常数相差约1000倍，即Zn和Cd首先和α区结合，然后才结合β区，但Cu则正好相反，不同的金属在完成结合时呈现出协同效应, 即在同一结构域内, 当一个金属离子结合后可促进另外其它金属离子的结合, 而不是两个结构域同步结合。

从组织中分离到的天然的MT金属成分很少是单一的, 甚至用金属诱导的方法而得到的MT也并不完全只含有用于诱导的金属,混合金属MT（特别Cu-MT）是一的结构和结合的协同作用尚不清楚，例如，不知道Zn和Cu是否能结合在同一结构域内, 但体外实验已证实，当β区已被Cu饱和后并不影响Cd对α区的正常结合,反之亦然。用Cd对Zn饱和了的MT中逐步取代Zn发现，在这一状态下, Cd的结合没有协同作用，并且对两个结构域也没有什么优先结合的问题。更进一步讲，由以

上方法逐步加入金属而产生的混合金属MT也不与在天然形成（Zn

7，Cd

7

）-MT的金

属族成分相似，因为天然MT不是通过Cd逐步加入到Zn-MT所形成的。然而,在体外

通过将适当的Cd

7-MT和Zn

7

-MT混合, 经过分子间金属的直接交换可得到天然金属

分布的MT这也可能是体内形成天然MT的一条重要途径。

Cd优先占领α区，而Zn优先占领β区,这样,当将Cd

7-MT和Zn

7

-MT混合在一起

时，出现明显的取代作用，结合Cd从Cd

7-MT的β区向Zn-MT的α区移动，取代Zn

7

-MT

区的Zn，而被取代下的Zn又取代Cd

7

-MT区的Cd，这些现象很可能与两个金属结合族的空间结构特征或MT的特异位点交换途径的存在有关。这些金属交换反应也证实了金属对MT的结合是可逆的和快速的, 这些反应对MT的生理学意义也是非常重要的。

10、金属硫蛋白的功能

⑴参与微量元素代谢和解毒作用。MT和金属离子在体内有很强的螯合力，这种作用在体内起着缓冲系统的功能。Schmidt等研究表明，MT在锌的代谢过程中有重要作用，它直接参与锌的储存、运输及其生物利用。消除 MT基因的小鼠对锌的吸收能力降低，表明 MT基因消除后破坏了体内锌的平衡。MT能调节小肠对 Cu和Zn等金属的吸收，小肠中 MT的水平与 Zn和 Cu的吸收量呈明显的反比关系。而小肠细胞与其它细胞之间 Zn的交换是比较快的，MT对 Zn和 Cu代谢起着细胞问和细胞内的控制作用，可能是因为 Zn-MT和 Cu-MT对许多辅酶有激活作用。Zn在转移过程中会受到各种因素的影响，包括各种酶类、氧化还原状态、能量供应等。不过有人证实，有些细胞虽然完全不能合成 MT，但仍可以生存，还能以正常的速度分裂和发育，原因是正常细胞分裂中有许多 Zn和 Cu 的酶参与，说明 MT与这些金属酶的激活没有必然的联系。

MT对重金属解毒作用的研究较多，特别是对镉的解毒作用。经研究表明，小剂量的 Zn、Cu、Hg和 Cd诱导 MT合成后，可降低高剂量镉中毒导致的死亡率。Park等通过研究敲除 MT基因的小鼠发现，MT对一些金属解毒能力的顺序为 Cd>Zn>Cu>Ag，而对铅和铁几乎无作用。MT的解毒机理可能为：减少进入细胞内的金属量，螯合进入细胞内的金属形成无活性的M-MT复合物和增加金属输出细胞。

⑵清除自由基，参与应激反应。正常情况下体内自由基除了参与细胞内重要的化学反应过程外，还可损伤生物活性分子，如蛋白质和 DNA等，从而导致癌症、肝脏损伤、自身免疫性疾病以及衰老等症状。体内除了具有自身抗氧化酶系外，在一定程度上需要外源物质或其刺激机体产生抗氧化剂，进而清除自由基。Zangger等研究报道，小鼠Cd

-MT与 NO暴露后导致其 N端β-结构域中3个金

7

属原子选择性释放，而α-结构域中的4个金属原子则原封不动，而且随后β-结构域中即形成二硫键。MT中富含半胱氨酸的巯基，清除羟基自由基能力是GSH-Px酶的100倍，是SOD酶的1 000倍。MT的抗氧化作用除表现为能直接清除OH-外，还能显著提高SOD、GSH-Px的活性。Cu、Zn、Mn、Fe、Se等微量元素又是机体内 SOD、GSH-Px等抗氧化酶系的组成成分MT参与微量元素的储存、运输及代谢，能及时提供SOD等抗氧化酶系所需的金属微量元素，从而增强了这些抗氧化酶的活性。

⑶参与调节机体生长发育。关于 MT的调节作用，主要体现在发育过程中的MT定位以及 MT含量的变化上。MT在细胞核与细胞质之间的转运还受到细胞周期的控制，在乳腺癌和结肠癌细胞中，都只能在 S期而不是 G1期细胞核中检测到 MT的存在。MT分子上并不存在定位信号，近年来研究表明，MT向核转移受细胞能量驱动，但具体的机制仍不明确。

11、植物金属硫蛋白的特性

植物金属硫蛋白的主要特性有：(1)分子量低，一般为6～7kD；(2)半胱氨酸含量高，约占全部氨基酸残基的1／3；(3)不含组氨酸和芳香族氨基酸残基；(4)金属含量高，半胱氨酸残基上的-SH可以和Zn、Cd、Hg、Cu等近20种金属离子配位结合；⑸具有广泛的存在性及高效的可诱导性，许多内源和外源激素均可诱导金属硫蛋白合成。

12、植物金属硫蛋白的多态性与分类

MT多态性最早由Mackay等提出，指一个在自然状态下发生的MT多种形态，是因为MT基因的多态性决定了不同亚型的MT异构体的存在。不同纲、目、属、种生物之间MT在分子量、金属含量、氨基酸组成等方面不尽相同。植物金属硫蛋白也同样具有多态性。

根据植物金属硫蛋白中半胱氨酸(Cys)残基的位置及排列方式，将植物金属硫蛋白分为3类：

1类金属硫蛋白的特点是N端和C端富含Cys，不含有芳香族氨基酸和疏水性氨基酸，两个富含Cys的结构域被一个不含Cys的中间区分开，Cys的排列方式一般

为CC、CXC和CXXC；2类金属硫蛋白Cys分布在整个酸序列中；3类金属硫蛋白是由长度不同的肽链构的多聚物，为非基因编码产物，是以谷胱甘肽为底物催化合成的金属硫醇盐多肽，被特称为植物螯合肽。

13、植物会属硫蛋白的的空间结构

用核磁共振、X射线等技术研究发现，动物MT中氨基酸顺序不同，但空间结构却相似，即MT整个分子呈哑铃形，由α和β两个大小相近的球形结构域组成，两个结构域通过第30，31位的Lys残基(铰链区)相连，MT铰链区的存在使2个结构域存在较大的柔性和可变性，从而使MT中的金属离子与溶液中的金属离子易于交换，为其调节体内金属离子的代谢提供了结构基础。而植物金属结合模型不同，认为植物MT蛋白两端富含Cys的区域在中间区的帮助下相互接近，和金属离子结合形成一个结构域。目前，Jordi Dom e nech等认为植物金属硫蛋白结合模型有3种，分别是hairpin、Dumbbell和double dumbbell模型，I类金属硫蛋白金属结合模型主要符合hairpin模型，而Ⅲ类金属硫蛋白金属结合模型符合Dumbbell模型。

14、植物金属硫蛋白的表达

植物MT基因因不同物种，不同MT类型、不同组织器官、不同外界条件而表达特性各异，与植物的生长发育阶段也密切相关。

植物I类MT基因的器官表达特异性差别很大。一般认为I型MT基因主要在根中表达，而Ⅱ型MT基因在叶等地上部分的表达量相对丰富。但就所有MT基因的表达而言，因不同的物种、不同的类型而表达特性各异。例如水稻ricMT在幼苗根、茎、叶、胚乳中均有表达，胚乳、根中的表达量较低，但在茎、节间中的表达量非常高，特别是第一节间的表达量高达叶片的150倍，第二、第三节间的表达量均低于第个一节间，但仍远远高于叶中的表达量。

Giritch等从番茄根中克隆了LEMTl、LEMT2、LEMT3，LEMT4，4个MT基因，LEMTl、LEMT3，LEMT4为Ⅱ型MT基因，LEMT2和I型、II型MT基因均不相同。根据它们表达的组织器官异性，LEMTl，LEMT4属于一个亚类，在根尖、叶、茎、花、未成熟的果实中均有表达，其中在花、幼叶中表达量丰富。LEMT2，LEMT3属于另一个亚类，它们主要在根尖中大量表达，LEMT3还在幼叶及花中有少量的表达。

Zhou等发现MTl，MT2在不同组织表达不同，MTl在幼苗和成熟植株的根中表达最为丰富，在叶中的表达量低，在花序中检测不到MTl的表达。MT2在幼苗期的根中表达量很低，在成熟植株的根、叶、花序中为组成型表达，表达量没有大的差异。

蚕豆MTI在根、茎、叶中大量表达，在成熟组织(叶、茎)中的表达量高于幼嫩组织。MT2则主要在地上部分，如叶、茎、花、萼片中表达，在根中不表达，RNA原位杂交显示，MT2在叶肉细胞中检测不到杂交信号，但在叶毛状体的杂交信号非常强烈。Hsieh等发现rgMT在根中表达丰富，叶、叶鞘中也表达，但不如根中的表达量高，根、叶、叶鞘中的比例约为8：5.3：1。

Jin等发现大米金属硫蛋白在根、叶中的表达量受外界环境(金属离子、盐离

子、热激等)的影响，在60mM NaCl处理后，在大米叶中的转录水平明显提高，48小时达到最高水平，而在根中6小时达到最大，过后表达水平减少。

15、植物金属硫蛋白的应用前景

MT具有广泛的应用前景和巨大的市场潜力。在生物学方面，MT可作为生物学标志物在疾病检测和环保检测中发挥作用；利用MT基因的高度可诱导性，通过MT 启动子建立一系列外源基因高效表达系统；利用MT可回收金属和清除土壤中重金属污染。由于MT有强的清除自由基能力，用MT生产的化妆品将会比SOD具有更好的美容效果及抗辐射作用。同时用MT生产的药物或保健品将会非常有效地增强机体的应激反应和抵抗力，为心血管疾病、糖尿病的治疗供一种新的途径。在肿瘤预防和治疗中，MT可抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突变作用。随着人们对MT 研究的深入，用MT治疗肿瘤有望成为一种有效手段。

总之，植物MT具有很大的开发潜力和无法估量的价值，随着人们对植物MT 研究的不断深入，植物MT的应用也会越来越广泛。

16、植物金属硫蛋白的功能

目前对植物MT的功能仅仅是根据其表达行为进行的推测。而且大多数MT蛋白尚未得到纯化，影响MT基因表达的因素很多，如金属离子、激素、胁迫、衰老，发育阶段等，同时MT基因以多基因家族成员的形式出现，各家族成员之间在结构和表达上的差异性很大，上述各方面的情况均增加了研究MT功能的复杂性及不确定性。从以下几个方面对植物金属硫蛋白的功能进行分析。

解除金属离子的毒害：将拟南芥MTI和MT2在酵母突变体cuplA中进行了表达，该突变体被删除了内源的MT基因cupl，对金属离子敏感。MT-l和MT-2的表达均使

突变体获得了高水平CuSO

4的抗性及对中等程度CdSO

4

的抗性，说明MTl和MT2与酵

母cupl在功能上具有同源性。拟南芥MT2在蓝细菌突变体SynechococcPCC7924中进行了表达，MT2部分互补了突变体对Zn2＋的超敏性。

维持内环境的稳定：番茄LEMT在各组织器官的表达及对金属、氧化胁迫的反应，认为LEMT各成员的功能存在差异，且LEMT的器官表达特征与对金属及氧化胁迫反应的相似性，同推测的LEMT蛋白结构的相似性之间无相关性。认为对金属及氧化胁迫的反应中，可能存在一个具有器官特异性及协同性的调控机制，以保证组织内环境中金属离子水平的稳定。

17、金属硫蛋白与金属代谢

MT与钙。给予大鼠钙12h后，其肝脏的MT随着补钙量的增加而增加，最高值可增加17.2倍，肾脏和胰腺的MT含量没有变化。当肝脏MT含量增加后，肝脏总锌浓度也增加。与对照组比较，补钙后肝脏总钙含量明显增加。摄入大量钙，细胞内钙积累量超过生理水平，就会损伤细胞功能，如不及时终止，便会造成细胞死亡。钙含量的变化在细胞中毒中具有极其重要的作用。当钙从细胞外液内流引起钙信号发生改变就会诱导肝脏MT，这时就会发生生理紊乱。动物实验表明，高钙（当钙摄入量40mg/kg时）能够降低锌的吸收和机体内锌的保存量并降低锌的生物利用度，同时肝脏的MT含量大幅度降低。小剂量的钙剂对肝脏MT产生有促进作

用；大剂量钙对MT的产生有抑制作用。

MT与锌。在MT中含有 9 个锌离子，学术界认为MT参与组织细胞中锌离子的保存和转运，是锌离子的贮存蛋白和转运蛋白。肝细胞中的锌离子可以调节肝脏MT的基因表达，两者呈正相关。Zn-MT是一种相对稳定的结构，但它可以通过提供Zn而激活许多以Zn为辅基的酶，通过作为一些反式作用因子锌指结构的锌供体而调节基因的表达。锌在MT与其他受体之间的交换并不通过传统的扩散作用，形成apo-MT和游离锌离子，锌再与其他受体结合，锌与MT的结合是一个双分子机制，受体与MT分子在瞬时的碰撞中夺取Zn，然后将Zn位点折叠进入蛋白疏水核，从而发挥其生物学作用。刘树刚研究了不同含锌饲料对幼鼠脑金属硫蛋白表达的影响。结果幼鼠在哺乳期末（4周）和7周末脑组织内MT含量：低锌饲料组明显低于常锌组，而高锌组明显高于常锌组。

机体处于营养性锌缺乏时，肝脏贮存锌含量下降，需要贮存锌离子的MT的需求量随之下降，MT的基因表达信号削弱，使MT的合成减少。动物实验表明，对缺锌大鼠补锌后1周，其肝脏锌含量提高，但肝脏MT含量仍处于低减状态。缺锌时体内铜含量也下降，缺锌时体内铁含量上升，铁含量的上升可以诱发组织氧化损伤，如果量大还可以致癌。这些因素可能都是锌缺乏影响运动能力和机体抵抗能力的重要因素，而MT可以适时地予以保护。实验证实MT在成骨细胞锌代谢中具有重要作用，细胞在高锌和锌缺乏时的耐受能力与细胞内MT的功能状况密切相关。Zn虽然是有益金属，但超过一定量会对机体产生有害作用。在一些实验中，锌能诱导产生MT，高锌产生大量MT，同时造成动物死亡。小鼠实验研究表明，锌摄入量在3mg/kg和5mg/kg体重时能产生较好的保护作用，当超过7mg/kg体重时便产生杀伤作用。

MT与锌营养。锌是机体必需微量元素,具有广泛的生理-生物功能.目前的研究并没有对锌的全部生物学-生理性意义得到最终的解答.营养性锌缺乏不仅造成机体运动能力降低,还导致机体组织器官中MT含量和产生降低.在MT中含有7个锌离子,学术界认为MT参与组织细胞中锌离子的保存和转运,是锌离子的贮存蛋白和转运蛋白.肝细胞中的锌离子可以调节肝脏MT的基因表达,两者呈正相关关系.Zn-MT是一种相对稳定的结构,但它可以通过提供Zn而激活许多以Zn为辅基的酶,通过作为一些反式作用因子锌指结构的锌供体而调节基因的表达.锌在MT 与其他受体之间的交换并不是通过传统的扩散作用,形成apo-MT和游离锌离子,进而锌再与其他受体结合.锌与MT的结合是一个双分子机制,受体与MT分子在瞬时的碰撞中夺取Zn,然后将Zn位点折叠进入蛋白疏水核,从而发挥其生物学作用。

机体处于营养性锌缺乏时,肝脏贮存锌含量下降,需要贮存锌离子的MT的需求量随之下降,MT的基因表达信号削弱,使MT的合成减少. MT合成减少和合成速率减慢,必将影响自由基清除和大分子物质和能量代谢,使运动后恢复过程大大减慢.锌离子是自由基清除剂,通过参与抗氧化系统的一些酶发挥作用.锌离子含量下降将严重影响这些酶的活性,降低自由基的清除能力.营养不良缺锌时肝脏锌含量下降,同时肝脏MT含量亦下降.动物实验表明,对缺锌大鼠补锌1周后,肝脏

锌含量提高,但肝脏MT含量仍处于低减状态.缺锌时体内铜含量也下降.缺锌时体内铁含量上升,铁含量的上升可以诱发组织氧化损伤,如果量大还可以致癌.这些因素可能都是锌缺乏影响运动能力和机体抵抗力的重要因素.而MT可以适时地予以保护.Zn虽然是有益金属,但超过一定的量会对机体产生有害作用.在一些实验中,锌能诱导产生MT,高锌产生大量MT,同时造成动物死亡.因此,无论是营养性补锌,还是诱导产生MT补锌都需严格掌握正确剂量.小鼠实验表明,锌摄入量在3和

5mg/kgBW是能产生较好的保护作用,当超过7mg/kgBW是便产生杀伤作用。

MT与铅。MT有61个氨基酸，其中有20个半胱氨酸，不含芳香氨基酸和组氨酸。这种特殊的结构可以使MT与金属离子结合形成特殊的金属簇。MT含有α、β两个结构域，这两种结构域与铅的结合形式和稳定性有所不同。在α-MT中，铅与MT 开始是以四面体配位结构形式结合的，其配位数为4，这种结合方式比较稳定。如果铅的含量加大，随着铅离子的竞争结合这种结构被打破，又增加一个三角形的配位结构，其配位数为3，其构象相对松散。这种结构不再随着铅离子含量的

增加再发生改变。从反应速率看，pb

4-α-MT的反应速度最快, pb

3

-α-MT的反应

速度最慢，pb

4-β-MT的速度居间。在这3种结构中pb

4

-α-MT最稳定，pb

4

-β-MT

稳定性较差，pb

3

-α-MT的稳定性最差。目前认为，MT的α结构域可协同结合4个铅离子，而β结构域只能松散结合3个铅离子，α结构域的稳定性要比β结构域要好。当α结构域结合7个以上的铅离子后，它也变成一种松散的结构，其稳定性也下降。体内的铅与Zn-MT置换产生一种半衰期较短的pb-MT，起着机体抵抗防御中毒的第一道防线的作用。Zn-MT的正四面体金属巯基簇核由于MT分子小而不可能象其他大分子金属那样将金属位点深埋于蛋白的内部疏区，而是基本上处于暴露状态，易于受到金属离子以及其他配基的攻击。Zn在MT中的存在提高了巯基反应的活化能，又使巯基更加有序地暴露在铅的进攻之下，降低了反应的动力学能差。同时，铅离子的电负性（1.17）远大于锌的电负性，此时与RS亲和力更强，综合因素使得铅离子在动力学上表现得易于同Zn-MT交换离子。

郝守进等将鼠原代肝细胞（RPHC）单层培养24h，然后进入一定浓度的Zn-MT 后，再将（RPHC）放入各种浓度的铅溶液中，暴露24h，分别测定细胞乳酸脱氢酶的渗出量，发现在Zn-MT的保护下，铅对细胞的毒性作用显著降低MT应用于环保具有重大的现实意义。目前正在研究将转基因蓝藻应用于重金属污染水体的净化，当无机铅离子水平上升时就可以引起MT与铅的大量结合。

MT与镉。镉对机体肝，肾，睾丸等均有一定的毒害，雄性生殖器官是镉毒害的靶目标部位。在睾丸，附睾和前列腺中均含有MT。MT缺乏的细胞对氧化损伤的

敏感性大大升高。研究表明，H

2O

2

与DNA上的 Fe2＋作用后，产生＋OH，可以引起DNA

链的交联。存在于细胞核内的MT是一种极好的＋OH自由基清除剂，其清除能力是谷胱苷肽（GSH）的800倍，对DNA的过氧化损伤起重要的保护作用。MT广泛存在于各级生殖细胞、精子和支持细胞中。当生殖细胞中镉的含量升高时，这些细胞中的MT含量随之上升，抑制了脂质过氧化作用的发生，产生保护作用。MT在生殖细胞中对抗镉中毒损伤作用的机制可能有2个，一是直接的抗氧化作用，二是通

过削弱镉对抗氧化酶的抑制，间接地对镉所致的氧化损伤起保护作用。

MT与辐射。辐射是我们日常生活中危害健康的一种常规环境危险因素，随着辐射剂量的不同，辐射损伤形式也不尽相同，哺乳动物实验表明，高剂量辐射造成脑血管死亡，中等剂量（5-12Gy）辐射造成胃肠道死亡，低剂量（2.5-5Gy）

）可能是造血细胞死亡剂量。辐射可以辐射造成血细胞死亡。半数致死量（LD

50

诱发MT的生成，诱导mRHA的表达与辐射剂量有相关。鞠桂芝观察了电离辐射对金属硫蛋白（MT）在免疫器官中表达的影响，发现在0.5-6Gy剂量范围内胸腺中MT 含量呈剂量依赖性增高，其中，4Gy和6Gy组有统计学意义（P＜0.05）。4Gy组X 射线照射后8-48h胸腺中MT的含量显著增高（P＜0.05- P＜0.01）。然而，研究均未见脾脏中MT含量的变化。以上结果表明X射线能诱导MT在免疫器官中表达，但同时表现出明显的组织特异性。贾乐报道酵母菌Cu-MT对由于γ射线引起的小鼠血小板降低有改善和回升作用，但并未观察到WBC总数的变化。薛宏伟应用体外微核试验和单细胞凝胶电泳法分别测定γ射线照射或MMC处理前后给以Zn-MT 对微核形成或DNA链断裂的影响，表明MT对5Gyγ射线诱发的小鼠骨髓微核形成有抑制作用，对 MMC诱发的DNA链断裂减少。潘爱华等检测了经不同剂量60C

照射

后第1、5、15、27d的小鼠肝脏中MT两种亚型（MT-1 和MT-2）的变化，发现照后第1和5d MT-1的增加为10-20倍，MT-2的增加为40-60倍，600 Rad较400 Rad增加显著，第15d趋于正常。MT的合成和mRNA的表达效应还与种系有关。

MT的抗辐射作用表现为经MT保护动物在辐射后其死亡率下降，伤害程度下降。文镜研究了口服MT对机体抵抗辐射能力的影响，发现灌胃MT O.6mg/kg和0.3mg/kg的小鼠经7Gy 1次辐照后，白细胞和淋巴细胞数量明显高于未服MT的辐照对照组。经8Gy照射后服用MT的小鼠比对辐射对照组小鼠平均存活时间提高了

射线照射小鼠，7次和8次照射后，服用MT的小鼠白细72%，每周1次Gy小剂量60C

胞和淋巴细胞数量明显高于未服用MT的辐照对照小鼠。MT在小剂量辐射诱导适应性反应中起到保护机体的作用，故MT作为保健预防辐射干预用品的应用具有广阔的前景。

MT与辐射损伤。辐射是我们日常生活中危害健康的一种常规环境危险因素,辐射电离细胞中的水产生氧化自由基,对细胞和机体产生氧化损伤，电离辐射与化学致变剂在日常生活中经常同时存在对机体产生联合打击,诱发包括癌症在内的生命伤害。随着辐射剂量的不同,辐射损伤形式也不尽相同,哺乳动物实验表明,高剂量辐射造成脑血管死亡中等剂量(5-12Gy)辐射造成胃肠道死亡;低剂量(2.5-5Gy)辐射造成造血细胞死亡.半数致死量(LD50)可能是造血细胞死亡剂量.辐射可以诱发MT的生成,诱导mRNA的表达,而且MT的产生和mRNA的表达与辐射剂量相关.MT的合成和mRNA的表达效应与种系有关。

MT的抗辐射作用表现为经MT保护的动物在辐射后其死亡率下降,伤害程度下降.其机制为:①MT的巯基物如半胱氨酸,半氨酸和谷胱甘肽能够保护哺乳动物细胞免受辐射诱发的细胞致死和DNA损伤. MT含有30%的半胱氨酸,能够抵御体内外氧化作用的氧化损伤.②辐射通过直接能量吸收和继发C-H键断裂;同时C基与氧

化反应形成过氧化结构造成至少10%DNA损伤.MT中亲电巯基基团通过氢供体使受伤的DNA得到恢复.③90%的低LE辐射引起DNA及其他分子损伤与羟基有关.MT对这类基团的进攻具有良好的防御作用.此外,内源性还原型谷胱甘肽(GSH)和MT有协同清除活性氧的功能.在一定的条件下,细胞因子可增强MT的蛋白合成,细胞因子可以防止辐射损伤,特别是对免疫系统和造血系统,降低辐射造成的骨髓毒性.MT 的预先效应在小剂量辐射诱导适应性反应中起到保护机体的作用.在对降低癌症发生率的保护作用中,MT作为保健预防干预用品的应用中具有广阔前景。

MT与甲基汞。甲基汞(HeHg)已被确定为人类致畸物之一,可导致胚胎死亡,畸形和发育迟缓，在甲基汞作用下,生殖细胞细胞膜的羟基酶被甲基汞结合,使细胞代谢紊乱,功能丧失乃至死亡。甲基汞在血清和组织内能与血浆蛋白,血红蛋白及膜蛋白的巯基结合成结合型汞, 同时产生大量自由基,破坏蛋白质的立体结构，造成功能丧失，α螺旋度是细胞膜蛋白序参量,是生命的一种标志,随着细胞膜的损伤和细胞的老化,膜蛋白α螺旋度含量下降,直至无序死亡。在实验中染毒组的α螺旋度含量下降证实了甲基汞的毒性作用，适量的MT可使膜蛋白的α螺旋度含量升高,改善细胞膜的功能，表明MT有拮抗MeHg对细胞膜蛋白构象的毒害。

细胞膜通透性是与细胞功能相匹配的,通透性改变是毒物作用育细胞膜的早期反应，实验表明甲基汞对红细胞的损伤是以增加红细胞膜的通透性开始的，MT 拮抗甲基汞对细胞膜通透性的破坏是由于MT提供了巯基保护了膜蛋白构象，以及抑制MeHg产生自由基造成的过氧化作用，细胞膜流动性是支持细胞功能的又一个基本保障，MeHg和高锌(10mg/kgBM)具有破坏细胞膜流动性的作用，MT具有对抗MeHg对细胞膜流动性的损伤作用，其机制为MT具有丰富的活性巯基,能保护

Na+,K+-ATP酶的活性,维持膜蛋白的构象,拮抗自由基过氧化产物MDA的形成,而使膜的流动性在外来毒物作用下保持正常，MT主要吸附在血细胞表面,和存在于血浆中的MT建立动态平衡,形成细胞表面吸附层,对各种异物(重金属,自由基)的攻击起到保护作用。

MT在预防甲基汞的生殖毒性中通过提供羟基与甲基汞结合,降低其毒性，MT 清除自由基是自由基在达到靶细胞或靶点之前被拦截或消灭，MT保护DNA免受OH-自由基的效率是GSH的400倍，此外,Zn-MT与甲基汞结合后释放出Zn+,Zn+除诱导产生MT外,对DNA的氧化损伤亦有保护作用。

MT与铜损伤。铜是机体所需的微量元素,但是,如果铜超量或在局部组织内浓度过大,亦可造成伤害.宫内节育器(IUD)广泛应用于避孕妇女,据统计,全球约有一亿妇女使用,我国避孕妇女约有80%使用此器具避孕.此器具有一个副作用是使用后增加经期流血和经期延长,其发生率约为20%-50%.研究表明,此种副作用的机理与局部宫腔内膜损伤,无菌性炎症,纤溶活性增加,宫腔Cu浓度增高,前列腺素代谢异常,自由基损伤,经血一氧化氮含量增高和血浆锌/铜比值降低有关.当局部组织(如宫腔,宫颈和输卵管等)铜浓度增加所产生的损伤有以下几种:⑴

Cu++的浓度与纤溶活性呈正相关,即纤溶酶原激活剂的活性和纤维蛋白降解产物含量明显升高,而纤维酶原含量明显降低.纤溶活性增高使上环后的出血副作用

发生率上升.⑵Cu++本身损伤子宫内膜,影响局部组织细胞代谢,妨碍组织更新和修复.⑶Cu++干扰宫内膜碳酸酐酶,碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性,使炎症反应增强.⑷过量Cu++增加使血浆Cu++上升,锌水平下降,迟缓组织更新和修复.

MT通过以下机制抵抗和减轻此种副作用,达到保护效果:⑴MT具有极强的消

除自由基,抗脂过氧化,保护DNA,稳定溶酶体,调节细胞钙稳定性和增加血小板凝集作用.通过这些作用抑制前列腺素的合成或减少前列腺素和自由基在节育环出血的副作用;⑵MT富含半胱氨酸,其巯基(-SH)与NO作用产生亚硝硫蛋白,而使NO

失去活性;而且Zn-MT在与NO作用同时,将与半胱氨酸结合的Zn++释出,发挥锌修

复组织和抗炎的作用,以减轻内膜组织局部坏死或无菌性刺激再产生NO.⑶MT为DNA和RNA合成酶(含锌酶)提供锌,而具有促进组织更生和恢复的作用;⑷MT促进

Zn++在小肠吸收,而Zn++可拮抗Cu++具有抗感染作用;⑸MT调节白介素-6合成,发挥抗炎作用;⑹MT可解重金属(包括铜)中毒,释放Zu++,拮抗Cu++,从而减少或消

除对Cu++的过量吸收,降低纤溶系统活性.

MT与铝。有关铝与MT的关系,研究报告很少.近年来已明确,铝对生物体有毒害,对钙,锌,铜,铁的代谢有影响.机体在高铝负荷下,血锌水平下降.小肠MT含量与锌,铜的吸收量成反比.当重金属毒物进入体内,诱导体内产生MT以驱除重金属毒物.此时随着MT上升,在小肠内锌,铜的吸收下降. 虽然许多重金属可以诱发产生MT,但MT不是对所有的重金属都具有解毒作用.MT的解毒作用取决于它是否能

与该重金属形成稳定的结合.从配位化学角度分析,率属于较硬的金属离子,硫属于较软的金属离子.因而铝与MT的结合不会很稳定.因此,尽管铝可以诱发产生MT, 但所产生的MT能否消除铝的毒性尚难肯定。

MT与红细胞。MT不仅存在于肝,肾细胞中,还存在于血液和组织液中，MT与红细胞膜之间存在着极强的相互关系，在MT的作用下膜向更伸展的构象转化，致使原来处于深层的巯基翻转到表面上来(表现为自旋标记人红细胞的ESR波谱W/S

增大,?

c 减小)。在给家兔皮下注射CdCl

2

后血浆和血细胞溶血液中都含有相当数

量的MT,红细胞溶血液中的MT含量明显高于血浆中的含量，有核红细胞可以在Cd2＋，Zn2＋的诱导下合成MT,目前认为血液中的MT主要来自肝脏,主要吸附在血细胞表面,并和存在于血浆中的MT形成一个动态平衡。其功能是在金属离子的运输中发挥重要作用。细胞表面MT吸附层的存在，对细胞免受各种异物(重金属,自由基)进攻和杀伤起到保护作用，此外,ZnMT的抗溃疡作用,CuMT的消炎,抗风湿作用可能与MT在细胞表面的强吸附作用有关。

MT与心血管内皮细胞。经主动脉给予MT,可淬熄动物心脏缺血后再灌注时出现的氧自由基信号,淬熄自旋，捕集剂α-苯基-Ν-特丁基萘龙(PBN)捕集的心脏缺血后再灌注时出现的PBN-氧自由基加合物信号，MT对缺血后再灌注的心脏损伤有明显保护作用，内皮细胞表面可能存在MT特异结合位点.内皮细胞遍布血管内腔表面,容易受到机械/化学和生物学方面的损伤.血中氧化修饰的低密度脂蛋白/氧化性固醇类毒物都是严重损伤血管内皮的危险因素.血管内皮一旦损不仅危及血管的完整,性,对循环的正常运转也构成严重伤害，MT提供所含的锌元素可以

保持细胞的正常生长和恢复;提供大量的巯基可以抗氧应激/维持细胞内氧化-还原稳态.最近的研究表明在脑星型胶质细胞上也存在MT特异结合位点。

18、淡水中鱼体内不同组织中MT含量

5种鱼体内不同组织中MT含量

每克湿组织中MT含量/μɡ

鱼名脑心脏肝脏肾脏鳃

鲤鱼 1.672(x) 2.238(x) 5.776(x) 4.663(x) 1.867(x) 标准差 0.378 0.318 0.544 0.640 0.410

鲫鱼 1.993(x) 3.156(x) 6.346(x) 4.479(x) 0.410(x) 标准差 0.401 0.545 0.504 0.377 0.521

鳊鱼 2.811(x) 2.286(x) 6.109(x) 4.173(x) 3.618(x) 标准差 0.546 0.194 0.740 0.412 0.882

草鱼 3.110(x) 3.680(x) 6.143(x) 4.070(x) 2.088(x) 标准差 0.414 0.407 0.571 0.903 0.438

鲢鱼 1.717(x) 2.834(x) 4.330(x) 3.733(x) 2.803(x) 标准差 0.334 0.536 0.432 0.363 0.559

注：每种鱼有5条，X是5条鱼平行实验的均值。