猪肺炎支原体P97TaqMan_BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用
中图分类号：Ｓ ８５２．６２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７３－４６９６（２０１２）１２－１２６８－
０５猪肺炎支原体Ｐ９７ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量
ＰＣＲ检测方法的建立及应用
武昱孜１，靳蒙蒙１，２
，白方方１，张 旭１，华利忠１，雷治海２，邵国青１＊
（１．
江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 ２１００１４；２．南京农业大学动物医学院，江苏南京 ２１００１４
） 摘要：根据猪肺炎支原体（Ｍｈｐ）Ｐ９７基因的保守序列设计合成了引物和Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ探针，建立了快速检测Ｍｈｐ的ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ方法。结果显示，该方法特异性良好，与其他病原不发生交叉反应；最低检测限可达１０ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ，敏感性高；不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ｃｔ值之间的线性关系表达式为Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，有良好的线性关系，标准曲线的相关系数为０．９９７，扩增效率为９５．８５％，重复性良好。对江苏省某猪场的４８份猪肺组织进行荧光定量ＰＣＲ检测，结果有４３份肺组织呈现阳性，阳性检出率为８９．５８％，比巢式ＰＣＲ的敏感性高。表明，该检测方法能用于Ｍｈｐ的快速检测，
可对猪支原体肺炎的早期诊断和流行病学调查提供新的技术手段。
关键词：猪肺炎支原体；Ｐ９７基因；荧光定量ＰＣＲ；Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ探针Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ
ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ９７ＷＵ Ｙｕ－ｚｉ １，ＪＩＮ Ｍｅｎｇ－ｍｅｎｇ１，２，ＢＡＩ Ｆａｎｇ－ｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｘｕ１，ＨＵＡ Ｌｉ－ｚｈｏｎｇ１
，
ＬＥＩ Ｚｈｉ－ｈａｉ ２，ＳＨＡＯ Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ
１（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏ－ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２
１００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｏ ｔｈｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏ－ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｈｐ）Ｐ９７ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｈｐ．Ｉｎ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔ Ｍｈｐ，ａｎｄ ｈａｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｓｗｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎ－ｔｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １０１ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ｔｏ １０７
ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ １０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ
ｗａｓ Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｗａｓ ０．９９７，ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ９５．８５％ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ ４８ｐｉｇ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ８９．５８％．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｈｐ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒ ｅｐｉ－ｄｅｍｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｓｔｕｄｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐ９７ｇｅｎｅ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｐｒｏｂｅ 猪支原体肺炎（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆｓｗｉｎｅ，ＭＰＳ）
又称“气喘病”，是由猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）引起的一种慢性接触性传染病，以高发病率和低死亡率为特点，世
收稿日期：２０１２－０６－２８；修回日期：２０１２－０９－
２９基金项目：江苏省农业自主创新基金项目［ＣＸ（１１）２０５９］；国家自然科学基金项目（３１１００１３５）作者简介：武昱孜（１９８４－）
，女，山西太谷人，硕士。＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：８４３９１９７３＠１６３．ｃｏｍ中国兽医科学 ２０１２，４２（１２）：１２６８－
１２７２Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
界范围内广泛流行，且易引起猪呼吸道疾病综合征（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＰＲＤＣ），严重威胁养猪业的发展［１］。
荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）因具有精确度高、特异性强、重复性好、自动化程度高［２］等优点，已成为疾病诊断的良好工具，可快速、灵敏地对病原进行定性和定量检测，使ＰＣＲ扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对ＰＣＲ扩增产物进行实时动态检测和自动分析［３－６］，可以动态地研究病原数量与疾病发生和发展的规律，从而为疾病的早期诊断和药物疗效观察［７－８］提供参考，具有极大的应用价值。
本研究选择了具有高度保守性的Ｍｈｐ Ｐ９７基因作为研究对象，根据Ｐ９７基因序列设计了特异性引物和探针，建立了ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测方法，并对该方法的敏感性、特异性进行试验，旨在建立成熟、稳定的Ｍｈｐ Ｐ９７检测方法，为ＭＰＳ的流行病学调查以及疫病诊断和监测提供技术储备。
１ 材料与方法
１．１ 菌（毒）株、质粒载体及病料
猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）、猪鼻支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ，Ｍｈｒ）、鸡毒支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ，ＭＧ）、副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）、猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２，ＰＣＶ２）、猪胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）、猪瘟病毒（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＳ－ＦＶ）和猪流感病毒（ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）均由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室保存。大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。质粒载体ｐＭＤ１８－Ｔ购自大连宝生物工程有限公司。
４８头猪由江苏省某猪场提供，４８份肺组织由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室剖杀提供。
１．２ 主要试剂及仪器
ＤＮＡ提取、ＰＣＲ产物回收试剂盒为天根生物技术有限公司产品。Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ ＲｅａｌＴｉｍｅ）为大连宝生物工程有限公司产品。ＡＢＩ ７５００实时荧光定量ＰＣＲ仪为美国Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司产品。
１．３ 引物、探针的设计与合成
根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的猪肺炎支原体Ｐ９７全基因序列（ＣＰ００２２７４．１），利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计
引物，进行Ｐ９７基因编码区的扩增，其引物序列为：Ｍｈｐ Ｐ９７／Ｆ：５′－ＧＣＣＴＴＧＧＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣ－３′，Ｍｈｐ Ｐ９７／Ｒ：５′－ＣＧＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴ－ＴＡＧ－３′，该引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，产物长度为４６０ｂｐ。
根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的Ｍｈｐ Ｐ９７全基因序列，设计合成了ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ引物对Ｍｈｐ ｒｅａｌ／Ｆ和ｒｅａｌ／Ｒ及Ｍｈｐ ｒｅａｌ Ｐ探针，其上、下游引物扩增的片段长度为９０ｂｐ。引物序列为：Ｍｈｐ ｒｅａｌ／Ｆ：５′－ＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＴＣＧＣＴＧ－３′；Ｍｈｐ ｒｅａｌ／Ｒ：５′－ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＡ－３′。探针序列为：Ｍｈｐ ｒｅａｌ／Ｐ：５′－ＦＡＭ－ＡＧＣＡＧＡＴＣＴ－ＴＡＧＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＧＴＧ－ＢＨＱ－３′。引物和探针均由南京金斯瑞生物科技公司合成。
１．４ 阳性标准品的制备
用Ｔｉａｎｇｅｎ公司的柱式细菌ＤＮＡｏｕｔ试剂盒提取Ｍｈｐ菌种的基因组ＤＮＡ，以提取的产物为模板，Ｍｈｐ Ｐ９７／Ｆ、Ｐ９７／Ｒ为引物，常规ＰＣＲ扩增ＭｈｐＰ９７基因。２５μＬ反应体系为：１０×缓冲液２．５μＬ，ＭｇＣｌ２（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，Ｐ９７／Ｆ １．０μＬ，Ｐ９７／Ｒ １．０μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １１．２μＬ，模板ＤＮＡ ５．０μＬ。反应程序为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。取扩增产物５．０μＬ于１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中进行检测。将切胶纯化的ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ５α，构建重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ９７。按照ＡｘｙＰｒｅｐ质量ＤＮＡ小量试剂盒提取重组质粒作为标准品，用于ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增。
１．５ 标准品拷贝数的计算
重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ９７通过紫外分光光度计测定浓度，根据下列公式计算，拷贝数＝质粒浓度（ｇ／μＬ）×加样体积×阿氏常数／（质粒总长度×１个碱基对的平均分子质量），并用ｄｄＨ２Ｏ将质粒做１０倍稀释。
１．６ 敏感性检测
将质粒标准品做１０倍稀释，取１×１０１～１×１０７ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ７个稀释度，按照Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒ－ｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）试剂盒进行ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增，每个稀释度做３次重复。２５μＬ反应体系为：Ｐｒｅｍｉｘ（２×）１２．５μＬ，ｒｅａｌ／Ｐ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，Ｒｏｘ（５０×）０．５μＬ，ｒｅａｌ／Ｆ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ，ｒｅａｌ／Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１．０μＬ，ｄｄＨ
２Ｏ ８．５μＬ
，ＤＮＡ模板１．０μＬ。扩增条件为：９５℃１０ｍｉｎ；９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，共４０个循环。由计算机自动绘制标准曲线。
９
６
２
１
第１２期 武昱孜等：猪肺炎支原体Ｐ９７ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立及应用
根据曲线的荧光强度、斜率和相关系数判定敏感性。１．７ 特异性检测
分别用Ｍｈｒ、Ｍｈｐ、ＭＧ、ＨＰＳ、ＰＣＶ２、ＡＰＰ、ＣＳ－ＦＶ、ＳＩＶ的核酸样品作为模板，用Ｐ９７序列的荧光定量ＰＣＲ引物ｒｅａｌ／Ｆ、ｒｅａｌ／Ｒ，在相同条件下进行荧光定量ＰＣＲ扩增，每次扩增设阴阳性对照，鉴定该引物的特异性。１．８ 重复性检测
用１×１０６
ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ的质粒标准品在同一次反应中分别进行３次Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ重复测定，计算每个样本反应管之间的组内变异系数（ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ ＣＶ）。１．９ 临床样本的检测
对江苏省某猪场的４
８头猪进行检测，采集４８份肺组织，充分研磨提取基因组ＤＮＡ［９］
，
在实验室已用巢式ＰＣＲ方法［１０］
检测的基础上，进行Ｔａｑ
－Ｍａｎ－
ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测，以检验该方法的临床检测效果。
２ 结果
２．１ Ｍｈｐ
Ｐ９７的扩增 以提取的Ｍｈｐ全基因组为模板，用引物Ｍｈｐ
Ｐ９７／Ｆ和Ｐ９７／Ｒ进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明，获得了４６０ｂｐ的特异性目的条带（见图１），与Ｍｈｐ标准阳性对照相符
。
图１ Ｍｈｐ
Ｐ９７基因的普通ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｈｐ Ｐ９７ｇｅｎｅ ｂｙ
ＰＣＲＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：阳性对照；２：阴性对照；３：Ｍｈｐ Ｐ９７基因的ＰＣＲ产物
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；３：ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｍｈｐ
Ｐ９７ｇｅｎｅ２．２ 标准品制备及拷贝数的计算
构建重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ９７，并对测序结果进行比对分析。结果显示，重组质粒的序列与Ｍｈｐ
Ｐ９７基因（ＣＰ００２２７４．１）的同源性为１００％，表明构建的标准质粒符合要求。
重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－
Ｐ９７通过紫外分光光度计测定，浓度为３５．７μｇ
／ｍＬ。ｐＭＤ１８－Ｔ载体长２ ６９２ｂｐ，
插入的片段长４６０ｂｐ，拷贝数＝质粒浓度（ｇ／μ
Ｌ）×加样体积×阿氏常数／（质粒总长度×１个碱基对的平均分子质量）＝１．０３×１０１０
ｃｏｐｉｅｓ，用ｄｄＨ２Ｏ将质粒进行１０倍稀释。２．３ 标准曲线的建立及灵敏度的检测
以１０倍稀释的标准质粒为模板进行ｒｅａｌ
ｔｉｍｅＰＣＲ扩增，绘制扩增曲线。结果显示，该方法的最低检测限可达１０拷贝（见图２）。以Ｃｔ值为ｙ轴，重组质粒标准品拷贝数为ｘ轴绘制标准曲线，其斜率为－３．４２６，截矩为４３．３４３，表达式为Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ
（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，Ｒ２＝０．９９７，呈现良好的线性关系（见图３）。其扩增效率为９５．８５％，标准品符合要求
。
图２ 荧光定量ＰＣＲ扩增的动力学曲线Ｆｉｇ．２ Ｄｙ
ｎａｍｉｃ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣ
Ｒ图３ 荧光定量ＰＣＲ的标准曲线
Ｆｉｇ
．３ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ２．４ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量Ｐ
ＣＲ的特异性试验 由图４所示，用建立的ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测，只有Ｍｈｐ出现特异性扩增反应，
而Ｍｈｒ、ＭＧ、ＨＰＳ、ＰＣＶ２、ＡＰＰ、ＣＳＦＶ、ＳＩＶ的ＤＮＡ
０
７２１中国兽医科学第４２卷
样本及阴性对照均未见荧光信号，呈阴性，表明该方法具有较好的特异性
。
图４ Ｍｈｐ特异性试验结果
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｈｐ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｅｘｐｅｒｉ－ｍｅｎｔ
１：Ｍｈｐ；２－８：Ｍｈｒ，ＭＧ，ＨＰＳ，ＰＣＶ２，ＡＰＰ，ＣＳＦＶ，ＳＩＶ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；９：阴性对照Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ２．５ 重复性试验
以１×１０６
ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ质粒为模板，进行Ｔａｑ－Ｍａｎ－
ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ扩增，重复３次，结果（见图５），３次检测的Ｃｔ值分别为２
３．８７、２３．７６、２３．７７，Ｃｔ变异系数均小于５％。故此检测方法的重复性良好
。
图５ 荧光定量ＰＣＲ的重复性试验
Ｆｉｇ．５ Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ
ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ１－３：１×１０６ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ９７２．６ 临床样品的检测
对江苏省某猪场４
８头猪的肺组织进行巢式ＰＣＲ检测，结果有４２份肺组织检出为阳性，阳性检出率为８７．５％；用ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ对上述样品进行检测，结果有４３份肺组织呈现典型的扩增曲线，阳性检出率为８９．５８％。将两种检测方法相比较，Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ比巢式ＰＣＲ敏感。
３ 讨论
近年来对Ｍｈｐ的快速检测方法主要有临床诊断（屠宰场监测）、分离培养、染色电镜观察、核酸探
针技术、ＰＣＲ诊断技术等［１１］
，荧光定量ＰＣＲ方法操
作简便，快速高效，灵敏度高，特异性好，不需要ＰＣＲ后处理，
降低了污染的可能性，被广泛应用于病原检测、基因分型等领域，也作为一种检测方法应用于临床，尤其是对未知样本病毒量的检测。 荧光定量Ｐ
ＣＲ准确检测的关键因素，一是模板ＤＮＡ的制备，实验室常用的制备模板ＤＮＡ的方法
有双蒸水煮裂解法、
酚－氯仿法、试剂盒法等［９］
。二是探针的标记，这也是荧光定量ＰＣＲ最为重要的一个因素。一般探针５′端标记的发光基团为ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＶＩＣ、ＨＥＸ等，ＦＡＭ为常用的发光基团，
性价比很好，通用性强，而３′端标记的淬灭基团多为
ＴＡＭＲＡ。但是ＴＡＭＲＡ自身也有荧光信号，可能给试验造成了较高的背景信号。本研究选用的ＢＨＱ（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｄａｒｋ ｑ
ｕｅｎｃｈｅｒ）是黑色背景、无荧光的淬灭基团，
具有更高的信噪比，提高了检测的敏感性和准确性。三是标准曲线的绘制，标准曲线对于定量结果很重要，前提是标准品的制备及标准品的梯度稀释。
国内外研究表明，
Ｐ９７基因是猪肺炎支原体的重要黏附因子，
存在于所有分离到的猪肺炎支原体中［１２］
，它是Ｍｈｐ的特异性免疫原基因，
位于该基因Ｃ端的Ｒ１区，被证实为Ｐ９７的抗原决定簇，
直接参与黏附。本试验根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的Ｍｈｐ
Ｐ９７基因序列，设计特异性引物，用ＰＣＲ扩增目的片段，构建重组质粒，经确定拷贝数后作为标准品进行绝对定量分析。对Ｍｈｐ进行ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ，建立了稳定的ＰＣＲ反应体系和程序，具有良好的特异性，与Ｍｈｒ、ＭＧ、ＨＰＳ、ＰＣＶ２、ＡＰＰ、ＣＳ－
ＦＶ、ＳＩＶ这些猪常见病病原均不发生交叉反应；
检测范围为１×１０１～１×１０７
ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ，最低检测限可达１０ｃｏｐｉｅｓ／μ
Ｌ，敏感性高；不同梯度定量模板的对数值拷贝数与Ｃｔ值之间的线性关系表达式为Ｃｔ＝
－３．４２６×ｌｇ（
ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，呈现良好的线性关系，相关系数为０．９９７，扩增效率为９５．８５％；重复性良好。
本研究建立的Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ方法可对病料或未知样品的组织进行实时监测和定量检测，显著简化了操作步骤；采用闭管检测，避免了巢式ＰＣＲ开盖污染的情况发生；不需凝胶电泳等ＰＣＲ后处理；
反应结束后由系统直接给出结果，避免了由于样本间交叉污染而引起的假阳性。用该法对４８份肺组织进行检测，结果阳性检出率达到８９．５８％，比巢式ＰＣＲ方法更敏感，可用于Ｍｈｐ含量较少的临床样品的检测。在扩增其他常见的支原
１
７２１第１２期 武昱孜等：猪肺炎支原体Ｐ９７Ｔａｑ
Ｍａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立及应用
体、引起猪病的细菌与病毒时无扩增反应，具有良好的特异性和重复性，可用于Ｍｈｐ培养物和组织样品的快速定性、定量检测，临床发病的早期阶段，更适合推广和应用于兽医病原的诊断。
参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
［１］ ＷＯＥＳＴＥ Ｋ，ＧＲＯＳＳＥ ＢＥＩＬＡＧＥ Ｅ．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ ｏｆｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＲＤＣ）ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｗｉｎｅｈｅｒｄｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，１１４（９）：３２４－３２６．
［２］ ＨＥＩＤ Ｃ Ａ，ＳＴＥＶＥＮＳ Ｊ，ＬＩＶＡＫ Ｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉ－ｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１９９６，６（１０）：９８６－９９４．
［３］ 邓少丽，罗阳．荧光定量ＰＣＲ技术及其在临床上的应用［Ｊ］．国外医学：临床生物化学与检验学分册，２００２，２３（５）：３０１－３０３．
ＤＥＮＧ Ｓｈａｏ－ｌｉ，ＬＵＯ Ｙａｎｇ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａ－ｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉ－ｅｎｃｅｓ，２００２，２３（５）：３０１－３０３．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［４］ 帅小蓉，夏庆友．定量ＰＣＲ技术的研究现状及应用概述［Ｊ］．蚕学通讯，２００２，２２（４）：２０－２８．
ＳＨＵＡＩ Ｘｉａｏ－ｒｏｎｇ，ＸＩＡ Ｑｉｎｇ－ｙｏｕ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ｏｆ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２２（４）：２０－２８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［５］ 朱水芳．实时荧光聚合酶链式反应检测技术［Ｍ］．北京：中国计量出版社，２００３：３３－４９．
ＺＨＵ Ｓｈｕｉ－ｆａｎｇ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎａ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３：３３－４９．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）［６］ ＮＡＺＡＲＥＮＫＯ Ａ，ＢＨＡＴＮＡＧＡＲ Ｓ Ｋ，ＨＯＨＭＡＮ Ｒ Ｊ．Ａｃｌｏｓｅｄ ｔｕｂｅ ｆｒｏｍａｔ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９７，２５（１２）：２５１６－２５２１．
［７］ 薛霜，独军政．实时荧光定量ＰＣＲ技术研究进展及其在兽医学
中的应用［Ｊ］．中国农学通报，２０１０，２６（７）：１１－１５．
ＸＵＥ Ｓｈｕａｎｇ，ＤＵ Ｊｕｎ－ｚｈｅｎｇ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕ－ｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１０，２６（７）：１１－１５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［８］ ＡＬＭＥＩＤＡ Ａ，ＰＯＺＩＯ Ｅ，ＣＡＣＣＩ Ｓ Ｍ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｇｉａｒｄｉａｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ ｃｙｓｔｓ ｂｙ ｎｅｗ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｍｉｘｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ－ｏｌ，２０１０，７６（６）：１８９５－１９０１．
［９］ 张旭，白方方，武昱孜，等．ＰＣＲ技术检测猪肺炎支原体的研究进展［Ｊ］．生物技术通报，２０１２（５）：５４－６０．
ＺＨＡＮＧ Ｘｕ，ＢＡＩ Ｆａｎｇ－ｆａｎｇ，ＷＵ Ｙｕ－ｚｉ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄ－ｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｙＰＣＲ．［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１２（５）：５４－６０．（ｉｎ Ｃｈｉ－ｎｅｓｅ）
［１０］ 逯晓敏，冯志新，刘茂军，等．猪肺炎支原体套式ＰＣＲ检测方法的建立及应用［Ｊ］．江苏农业学报，２０１０，２６（１）：９１－９５．
ＬＵ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ，ＦＥＮＧ Ｚｈｉ－ｘｉｎ，ＬＩＵ Ｍａｏ－ｊｕｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ－
ｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏ－
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１０，２６（１）：９１－９５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１１］ 申开梅，李颖平，张映．猪支原体肺炎诊断及检测技术［Ｊ］．畜禽业，２００６（１１）：４２－４４．
ＳＨＥＮ Ｋａｉ－ｍｅｉ，ＬＩ Ｙｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄ－
ｖａｎｃｅ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｏｆ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００６（１１）：４２－４４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１２］ ＳＴＲＡＩＴ Ｅ Ｌ，ＭＡＤＳＥＮ Ｍ Ｌ，ＭＩＮＩＯＮ Ｆ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｍｙ－
ｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，４６（８）：２４９１－２４９８．
（责任编辑 胡弘博）
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１中国兽医科学第４２卷
猪支原体肺炎治疗方法.doc
猪支原体肺炎治疗方法 概述：猪支原体肺炎也可称为猪霉形体肺炎、猪地方流行性肺炎，属于慢性呼吸道病的一种，主要是由支原体科支原体属的猪肺炎支原体引起。本病致死率并不是很高，但会使猪群的生长受到严重影响，降低饲料利用率，增大料肉比;如果继发感染其他疾病也具有较高的死亡率。猪支原体肺炎的症状 急性型：病猪采食较少，甚至完全停止，精神萎靡，咳嗽，尤其是在剧烈运动、清晨、夜间和喂食后咳嗽更加明显。随着病情的发展，导致气喘和呼吸困难，一般呈腹式呼吸，即呈犬坐姿势，并张口喘气，有泡沫从口鼻流出。病猪通常会有窒息而发生死亡，能够耐过的病猪则变成慢性型。此外，病猪体温基本正常，约37.5℃，精神萎靡，呼吸次数每分钟大约130次，由于出现气喘而无法咽下食物，体质消瘦，发育较慢，被毛粗乱失去光泽。 慢性型：病猪长时间咳嗽，开始时是干咳，严重时会出现连续痉挛性咳嗽，且随着病情恶化，会出现难以呼吸和喘气的现象，腹式呼吸非常明显，夜间能够清晰的听到哮喘声。病猪可视黏膜发绀，往往会流鼻液，但体温及食欲基本没有明显变化，严重时才会减少采食或者停止采食，最终由于体质衰弱而发生死亡。 猪支原体肺炎紧急治疗方案
猪支原体肺炎的西药紧急治疗方案: 方法1，林可霉素进行肌肉注射，持续5天以上，或在饲料中添加林可霉素，进行喂食。 方法2，盐酸霉素，硼酸溶液进行肌肉注射，一天一次，持续用药5天以上。 猪支原体肺炎的中药紧急治疗方案: 方法1，杏、白果、麻黄、甘草、苏叶、黄芪、石膏，熬汤冠服。 方法2，炒白芍、桔梗、党参、桂枝花粉、甘草、金银花、柴胡、五味子、葶苈子、杏、山药、连翘，熬汤灌服。 方案3，皂角、醉鱼草跟、石菖蒲、臭牡丹、苦参、甘草，熬药灌服。 猪支原体肺炎治疗方法 发现病猪后要立即将其与群猪进行隔离，并对其污染的环境进行消毒，可喷洒2%～3%氢氧化钠溶液进行消毒。对于病猪所在猪群的同群猪只也要采取隔离观察，并在饲料中添加土霉素拌料，一般每千克饲料中添加60～80mg，采取预防性治疗，每天饲喂1次，1个疗程是5～7天，需要连续用药3个疗程，如果经过2月后没有可疑病
解脲支原体检查方法
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 解脲支原体检查方法 导语：解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会 解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会表现出来的，而解脲支原体的检查方法有是有很多的，一般在做这个检查的时候都是很多男性出现了尿多尿急尿频繁的现象，所以才到医院做检查，那么解脲支原体检查方法有哪些？ 解脲支原体的检查方法主要有三种，第一种检查方法就是血液检查，主要是通过抽血化验。第二种检查方法就是通过口腔的涂片的培养来进行检查。第三种检查方式就是PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出igm的抗体情况，然后再判断感染的情况。这种疾病的治疗可以使用四环素，比如米诺环素、多西环素等等，但是建议最好两种到三种的抗生素结合一起使用，治疗效果更好。 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。 男性支原体检查方法有哪些？男性支原体检查方法如下： 1、血常规：周围血白细胞计数一般正常嗜酸性粒细胞增多。 2、血清学检全：采用补体结合试验着恢复期血清抗体效价比急性预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
1医学检验毕业论文 (三种肺炎支原体检测法的临床应用分析)
毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日
三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究
目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。
猪支原体肺炎(喘气病)的防治策略
猪支原体肺炎（喘气病）的防治策略 喘气病，又称猪地方性流行性肺炎、支原体肺炎，是由猪肺炎支原体直接引起的猪呼吸道疾病，其特点是病猪咳嗽、生长不良、发病率高而死亡率低。临床症状最常见于6-12周龄的猪，支原体感染常常诱发生长肥育猪13-15周龄、18-20周龄时比较严重的呼吸道疾病综合症，使得育肥期猪只生长速度变慢，死亡率升高。病猪的临床症状通常至少持续三周，最重要的是使得断奶体重相同的猪逐渐变得体重参差不齐，上市时间推迟。有资料表明，受支原体感染的影响，8kg-85kg的猪的生长率下降15.9%，10kg-85kg的猪的生长率下降13.8%，饲料利用率损失22%。由于支原体的感染，生长肥育猪每增重1千克体重比健康猪多消耗 0.09-0.2千克饲料。而且屠宰猪30%-80%的肺病变与肺炎支原体感染有关。 1、支原体的普遍存在性 支原体是养殖环境中普遍存在的病原体，支原体感染也是一个全球关注的养殖疾病问题。而且猪只一旦感染支原体，就很难根除，带菌猪通常表现为亚临床状态。当外界感染压力大，或动物应激时，支原体将会诱发综合性呼吸道综合症，如猪PRDC。 2、支原体的传染方式 带菌猪( 病猪和隐性感染猪)是猪支原体肺炎感染的主要传染源。病原体随带菌猪的咳嗽和喘气排出体外后，易感猪通过与带菌猪的呼吸道分泌物直接接触或经由空气流动接触而感染。一旦猪群中有几头猪被感染，就会在同圈猪之间传播，特别是在断奶时将猪只混养以后更是这样。在连续生产系统中，猪肺炎支原体可以由母猪传给仔猪，由大猪传给小猪，但直到仔猪 6周或更大日龄时才能见到明显的症状。其严重程度常因管理水平、季节、通风条件、猪的密度以及其它环境因素改变而有很大差异。 3、支原体的危害 呼吸系统有三道防线用以保障呼吸通畅，防御疾病。第一道防线是鼻腔，第二道防线是气管和支气管，第三道防线是肺泡防御。肺炎支原体感染后，首先聚集在纤毛上皮细胞上，然后逐渐引起感染细胞发生病变、死亡，导致气管发炎、纤毛脱落或蠕动减弱；由于肺炎支原体感染引起纤毛变短变少，纤毛正常的摆动功能显著的下降，消除灰尘、病原菌及分泌杀菌(病毒)粘液的功能降低，增强对其它呼吸道疾病的易感性，为继发性感染大开方便之门。 4、支原体与各种疾病的关系 4.1支原体与猪呼吸道综合症 目前，呼吸道综合症是严重影响猪场经济效益的疾病之一。猪呼吸道疾病综合症是一种多因素引起的呼吸道疾病的总称，它是由病毒、细菌、环境应激和猪体免疫力低下相互作用造成的。由于猪场的感染压力大，从断奶开始，一直到肥育期均可发生呼吸道综合症。该病除了造成直接的死亡之外，更为严重的是使猪增重缓慢(5-25%)，饲料利用率减少5-25%，出栏时间推迟15-20天；2－4月龄成活率下降2%。而肺炎支原体是在呼吸道综合症（PRDC）中扮演着始作俑者和疾病第一感染的角色。肺炎支原体感染后，是呼吸系统的抗病能力降低，增强对其它呼吸道疾病的易感性，导致继发感染其他细菌、病毒（如链球菌，APP, HPS, PRRSV, PCV），从而诱发呼吸道综合症（PRDC），严重的可以导致猪只死亡，造成巨大经济损失。 有统计表明，呼吸道综合症可带来如下的经济损失： 4.1.1料肉比下降0.1： 即：正常商品肉猪全程料肉比2.8：1，而由于呼吸道病影响成了2.9：1 按100kg体重出栏计算：无病猪耗料280公斤，而有此病的猪耗料为290公斤，多耗料10公斤，约14元/头损失。 4.1.2晚出栏15天：
支原体检查
附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基
内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。
治疗猪喘气病的有效药物和方法
猪喘气病又名猪支原体肺炎、猪霉形体肺炎、猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体感染而发生的一种接触性慢性呼吸道传染病，临床上呈慢性经过，主要症状为咳嗽和气喘。现将治疗该病有较好疗效的药物及方法荟萃于 猪喘气病又名猪支原体肺炎、猪霉形体肺炎、猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体感染而发生的一种接触性慢性呼吸道传染病，临床上呈慢性经过，主要症状为咳嗽和气喘。病变的特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉”样实变。现将治疗该病有较好疗效的药物及方法荟萃于后，供读者参考。 １盐酸土霉素 日用量300mg/kg体重（第一次用量加倍），用0.25％普鲁卡因或5％的葡萄糖生理盐水稀释后肌肉注射，每日1次，连续注射5天为一个疗程。重症者可适当延长一个疗程。按6mg/kg体重作气管内注射效果较好。 2 恩诺沙星 用量2.5mg/kg体重，每日2次，肌注。 3 泰妙菌素 泰妙菌素的商品名为“支原净”，是一种白色结晶粉末，以拌入饲料内给药为主。对猪喘气病预防剂量为每天50mg/kg体重拌料，口服连续2周。治疗期间有明显的疗效，但部分治疗猪仍会复发。被治疗猪在治疗后6天，剖杀做病原分离，部分猪仍会带菌。从实践来看，泰妙菌素仅能使有食欲的健康猪拌料作预防猪喘气病使用，对较轻有食欲的喘气病猪治疗有效，对明显减食或废食病重的病猪疗效不理想。如果用泰妙菌素和磺胺嘧啶钠按每千克体重分别添加20mg拌入饲料，连喂10天，对该病预防效果好。
4 卡那霉素 硫酸卡那霉素药效较高，一般病猪2.5万IU/kg肌肉注射，可作为延缓疾病急性症状发作的有效药物。此药治疗喘气病疗效快，但是复发率较高，一般治愈率仅占50％左右。如用卡那霉素与土霉素交替使用，其疗效会提高。 5 泰乐菌素 泰乐菌素注射液，按4-9ml/kg体重肌肉注射，1次/天，连用3天。 6 氟苯尼考 猪早期喘气病用此药疗效很好，按0。2ml/kg体重肌肉注射或肺内注射，每天1次，连用3天。如在饲料中添加氟苯尼考治疗效果也不错。 7 林可霉素 又称洁霉素，对猪喘气病有特效。按50mg/kg体重给药，5天一个疗程，杂交猪2周治愈率可达88.67％，但对二花脸猪疗效差。如在饲料中添加，按每吨饲料加入200ｇ，连续喂3周，疗效较好，休药期为宰前1天。 8 丁胺卡那霉素 50IU～100IU，在右侧苏气穴注射，每天1次，连用3天，疗效很好。
儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较
儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较 发表时间：2016-05-09T11:40:39.230Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年1月第2期作者：王玉琪 [导读] 比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 王玉琪 浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州 310052 【摘要】目前：通过对肺炎支原体（MP）RNA检测及抗炎支原体抗体（MP-IgM）的研究，探讨两种检测方法在临床中的应用。方法：对208例肺炎住院患儿行呼吸道分泌物MP-RNA及血清MP-IgM测定，比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 【关键词】肺炎支原体；抗体检测；RNA检测 肺炎支原体是（MP）是小儿呼吸道感染常见的病原体之一，可引起上呼吸道及下呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原[1]。MP的实验室检测方法有很多，血清学检测是目前MP感染的常规实验室手段[1]，利用酶联免疫吸附试验，如检测持续高滴度MP-IgM或恢复期抗体滴度较急性期4倍或4倍以上变化可诊断。近年随着分子生物学技术的发展，RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）技术应用于临床，为MP感染的早期诊断提供了新的检测方法。本研究对本院208例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集呼吸道分泌物及血清同时检测患儿的MP RNA及MP-IgM，现将结果报告如下。 1资料与方法 1.1 一般资料 选择2015年6月1日~2015年12月1日在本院住院的疑似MP呼吸道感染的患儿208例，其中男性106例，女性102例，年龄1个月~13岁。根据年龄分为两组，A组（0~3岁，n=128），B组（3~12岁，n=80）。两组患者的一般资料具有可比性（P<0.05）。 1.2 仪器与试剂 杭州……………… 1.3方法 采集患静脉全血，常规分离血清后检测肺炎支原体抗体（MP-IgM），同时用灭菌棉签采集受试者咽部样本（大于1岁患儿）或痰液（小于1岁）行MP RNA检测。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。 1.4 肺炎支原体肺炎临床诊断标准：持续咳嗽，可伴有发热，白细胞计数正常或稍高，X线提示两肺均匀一致改变的片状阴影或大叶性肺炎改变。 1.5 统计学处理采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 208例患中，MP-IgM阳性率34.1%（71/208），MP RNA检测结果阳性共率31.2%（65/208），两者比较差异无统计学意义 （P>0.05）。 3 讨论 肺炎支原体（MP）是引起儿童呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎的常见病原体之一，临床表现为干咳、发热，部分患儿可出现胸腔积液、肺纤维化，肺外损害，如皮肤、胃肠道、血液系统损害、骨关节肌肉、中枢神经系统、心血管系统等[2-4]。MP感染症状可持续或迁延数周或数月，常可引起慢性咳嗽和反复呼吸道感染，还可能引起喘息。MP感染患儿临床表现常不典型，常规抗生素治疗效果欠佳，因此，早期诊断对临床治疗有着重要意义。目前，多种检测方法针对MP-IgM，具有灵敏度高，特异性强，操作简便快速的特点，已作为早期诊断MP感染的客观指标而应用于临床。本研究结果显示，208例患儿中，痰液标本或咽拭子SAT法，MP RNA阳性率34.6%，ELASA法测定MP-IgM阳性率29.3%，两者比较有统计学意义（P<0.05），这可能与血清标本留取时间有关，MP感染后约7d可在血清中检测出MP-DNA抗体，疾病早期可呈假阴性[5]。同时，在组内两种检测手段也呈现了不同结果。A组中的MP RNA的阳性率高于MP-IgM的检测 （P<0.01），这可能由于婴儿免疫系统发育不完善，当MP感染后不能产生或产生效价较低的抗体而导致漏诊，提示MP RNA方法更适于年幼儿和免疫损害患儿的MP感染的早期诊断[5]；而核酸检测受年龄影响较小，故阳性率较高。B组中，两种检测方法阳性率分别相比较无统计学意义（P>0.05），说明咽拭子MP RNA检测方法同样具有较高的敏感性，但同时需结合MP-IgM检测结果，以除外假阳性结果。综上所述，MP-IgM检测及MP RNA检测在诊断MP感染均有较高的价值，二者联合应用可提高检测的准确性，为临床诊断提供有力的依据。 参考文献： [1]Vervloet LA，Marguet C，Camargos PA．Infection byMycoplasma pneumoniae and its importance as an etiologicalagent in childhoodcommunity-acquired pneumonias[J]．Braz J Infect Dis，2007，11（5）：507—514． [2]Gaillat J，Elahault A，deBarbeyrac B，et https://www.360docs.net/doc/a03520882.html,munity epidemiology of Chlamydiaand Mycoplasma pneumoniae in LRTI in France over 29 months[J].Eur JEpidemiol，2005，20（7）：643-651. [3]Blasi F．Atypical pathogens and respiratory tract infee—tions[J]．Eur Respir J，2004，24（1）：171—181． [4]Hansbro PM，Beagley KW，Horvat JC，et a1．Role ofatypical bacterial infection of the lung in predisposition／protection ofasthma[J]．Pharnlaeol Ther，2004，101（3）：193-210． [5] Kim NH，Lee JA，Eun BW，et a1．Comparison of poly-merase chain reaction and the indirect particle agglutinationantibody test for
猪支原体肺炎的鉴别诊断和预防
猪支原体肺炎的鉴别诊断和预防 猪支原体肺炎（猪气喘病）是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性呼吸道疾病，表现咳嗽、气喘和生长迟缓，感染率高、死亡率低。感染猪的呼吸道纤毛屏障被破坏，使其它疾病（如猪蓝耳病、圆环病毒、胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病等）混合感染的几率大大增加，肺脏病变加重，呼吸功能和饲料转化率下降，经济损失巨大。该病是一种原发性呼吸道疾病，也是呼吸道病复合体（PRDC）最重要的病原之一，多与其它病原混合感染，使临床表现和剖检症状变得复杂。本文通过对猪支原体肺炎的流行病学、临床评价和检测方法的分析，为其鉴别诊断和防治提供依据。 1 猪支原体肺炎的流行病学和发病机制 目前，商品猪场几乎100%感染猪肺炎支原体，带菌散毒猪群普遍存在。仔猪出生后两周内，一般不会自然感染猪支原体肺炎。随着日龄增加，应激增大、抵抗力降低，感染几率随之提升。感染猪肺炎支原体后的潜伏期为3周左右，所以咳嗽症状多出现在7周龄之后，10周龄为发病和抗体转阳高峰，被称之谓“十周龄墙”。 猪肺炎支原体通过空气中的气溶胶，经呼吸道感染，首先黏附在猪呼吸道纤毛顶端，进而繁殖并释放代谢中间产物，使纤毛脱落、黏膜受损，呼吸道屏障系统被破坏。吸入空气中的异物、黏膜分泌物和脱落的纤毛，沉降到肺泡中，导致连续干咳和气喘的发生，并逐渐形成肺脏肉变或胰样变。肺脏功能遭到破坏，生长受阻、饲料转化率下降；同时呼吸道纤毛脱落，失去过滤异物、清除病原的能力，增加了其它病原混合感染可能。 猪肺炎支原体能长期定居于猪呼吸系统，且具有免疫逃避的特性，难以通过药物或免疫清除，经常反复发病。而纤毛脱落和肺部实变，均是不可逆的，一旦发生终生受其影响，严重的可变成僵猪。 2 猪支原体肺炎的临床症状与咳嗽指数 感染猪肺炎支原体后的猪群，体温和食欲无明显变化。发病初期多表现连续性的干咳，后期出现气喘、呼吸困难（猪呈腹式呼吸），部分严重的极度消瘦。若继发感染其它细菌和病毒，则体温升高，死亡率增加。临床上为了与其他因素引起的咳嗽症状进行区分，现将不同因素引发的疾病与咳嗽类型和所对应的临床表现总结如下：猪传染性胸膜肺炎表现为咳嗽、体温高且口鼻流有泡沫或带血黏液、可视粘膜发绀等；猪肺疫表现为连续咳嗽、时有喘鸣声、咽喉部肿胀导致呼
PCR法支原体检测
PCR法支原体测定PROTOCOL 生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部
1.目的 规范PCR法支原体检测的操作方法。 2.范围 适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。 3.责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。 4.定义 N/A 5.设备、材料和试剂 5.1设备、材料 设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A 小型台式冷冻离心 机Thermo HERAEUS Fresco 21 N/A 单道移液器 (10ul,20ul,100ul) Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A 凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc? XRS+ System N/A 5.2试剂 试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq? TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A
10×Loading Buffer TaKaRa 9157 DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A 内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司 6.溶液配制 6.1 50× TAE Buffer 称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。 6.2 1× TAE Buffer 量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。 7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。 7.1 1st PCR反应 7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系） 试剂用量（ul） 内毒素检查用水37.75~38.75 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F1 Primer 0.5 MCGp R1 Primer 0.5
肺炎支原体检测方法的选择
肺炎支原体检测方法选择的几个注意点 肺炎支原体（MP ），主要引起咽炎及支气管炎，少数累及肺。以其顶端结构与宿主细胞上受体结合粘附于上皮细胞上，一般为表面感染，除穿透支原体外（艾滋病人感染）大多不侵入血液。产生有毒代谢产物如外毒素或过氧化氢等引起发热及局部细胞损伤。 选择检测方法的注意事项： 1.临床常用全血（指尖血）或血清（橘黄管）检测IgM 来判定肺炎支原体的感染，但是，抗体检测只是各种实验室方法的一种，尚有其他方法可用，如培养及DNA 检测，每种方法各有利弊，对不同病程各有针对性。 2.每一种实验结果都需要另外一种实验结果来验证，正常人咽部或支气管可携带MP ，所以不能用一种实验数据来下诊断。 3.初次感染时， IgM 、IgG 都会产生，再次感染时，有时IgM 不产生。 4.儿童由于初次感染几率大，常能产生IgM ，成人由于机体可能感染过多次，常不产生IgM 。 5. 检测方法的选择需要根据病程确定： <6个月 6-12个月 1-9岁 IgM + IgM — 年龄对IgM 抗体产生的影响
抗体 抗原 MP感染不同时段产物的比较 由此图可以看出： a.感染早期，7天之内以检测抗原为主，宜培养或DNA检测： 培养为“金标准”，据国内文献显示，快速培养法阳性率为24%；PCR--DNA检测为96%。美国一篇文献显示，培养阳性率为5%，DNA为57%。 b.早期未产生抗体，导致延误治疗，后期抗体阳性，病原体消失，导致过用抗生素。 c.7天之后可检测IgM抗体； d.IgM可持续较长时间，感染后三个月抗体浓度依然较高，有的可以终生阳性，如果短时间内检测抗体，常不能分辨是否为MP现症感染或其他感染。 e.感染早期宜病原体筛查，此时抗体尚未产生，可导致延误治疗；中后期适宜抗体检测，主要用于回顾性验证试验，此时病原体消失，可导致过用抗生素。
肺炎支原体两种检测方法的比对分析
肺炎支原体两种检测方法的比对分析 目的：探讨肺炎支原体（MP）咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）两种检测方法的不同。方法：将198例疑似MP感染的患儿根据年龄分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123），分别取咽拭子用PCR法测MP-DNA，取血清用IIFA法测MP-IgM，比较两种方法的阳性率。结果：MP-DNA检测阳性率为57.07%，MP-IgM检测阳性率为47.47%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。A组MP-DNA阳性率48.00%明显高于同组MP-IgM阳性率25.33%，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率分别为62.60%、60.98%比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PCR与IIFA联合检测可以提高MP感染诊断的准确性。 标签：肺炎支原体；聚合酶链反应；间接免疫荧光法；肺炎支原体抗体 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 仪器与试剂杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR 法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。 1.3 方法用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。 1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。 1.5 统计学处理
猪支原体肺炎的诊断及防治
猪支原体肺炎的诊断与防治 （代刚1 1.奇峰畜牧兽医站） 摘要：猪支原体肺炎是养猪业中常遇到的疾病，该病广泛流行于世界各养猪国家和地区，已成为世界性问题。单独地发生本病对猪致死率不高，但它使感染、发病猪的生产性能、抵抗力下降，易导致猪爆发其他传染性疾病，并且猪场一旦发生此病常常难以根治，是危害养猪业健康发展的一个大病老病，在养猪业中需要引起重视。本文就该病的病原、发病机理、临床症状及诊断、预防措施等进行讨论，以期为养猪业避免或减少本病发生，健康发展提供参考。 关键词：猪支原体肺炎诊断防治 猪衣原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS），又称猪地方流行性肺炎（swine enzootic pneumonia）,俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的猪的一种慢性呼吸道传染病[1]。主要临床症状为咳嗽和气喘，病理变化特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘成肉样或虾肉样实变。本病不同年龄、品种的猪，一年四季均可发病，尤其在寒冷多雨潮湿或气候骤变时多发[2]。单独地发生本病对猪致死率虽然不高，但它使感染、发病猪的生产性能、抵抗力下降，易导致猪爆发其他传染性疾病，是危害养猪业健康发展的一个大病老病，一直以来在养猪业中都极为重视。 1.病原 本病病原为猪肺炎支原体（Mycoplasmal hyopneumonia），又称为霉形体，是一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小原核细胞型微生物,缺乏细胞壁,不能维持固定的形态,呈球形、短杆形、分支丝状等多形态性,最常呈分支丝状[3]。其革兰氏染色阴性，但着色不佳，吉
姆萨或瑞士染色良好。本菌在无细胞人工培养基上培养条件苛刻。液体培养基由水解乳蛋白的组织缓冲液、酵母浸液和猪血清组成。细胞培养可选用猪肺埋块、猪肾和猪睾丸细胞继代培养。病料接种乳兔，经连续传代600多代，对猪的致病力减弱，并仍保持较好的免疫原性，也可在鸡胚中生长。猪肺炎支原体对自然环境抵抗力不强，圈舍、用具上的支原体，一般在2-3d失活，病料悬液中支原体在15-20℃放置36℃即丧失致病力。对青霉素、链霉素、红霉素和磺胺类药物不敏感，对放线菌素D、丝裂菌素C最敏感，对壮观霉素、土霉素、卡那霉素、泰乐菌素、林可霉素、螺旋霉素敏感。常用的化学消毒剂均能达到消毒目的。 2.流行病学 自然条件下，仅感染猪，不同年龄段、品种猪均能感染，但乳猪和断乳仔猪易感性最高，发病率和死亡率较高，其次是怀孕后期和哺乳期的母猪，育肥猪发病较少，病情也较轻。母猪和成年猪多呈慢性和隐性。本病一年四季均可发生，但在寒冷、多雨、潮湿或气候骤变时较为多见。饲养管理和卫生条件是影响本病发病率和死亡率的重要因素，尤其在饲料质量、猪舍潮湿和拥挤、通风不良等影响较大。如继发或并发其他疾病，常引起临诊症状加剧和死亡率升高。本病传染源是病猪和带病猪，主要通过接触或飞沫经呼吸道传染，皮下、静脉、肌注或胃管接种病原体都不致病。 3.发病机理 支原体聚集并粘连在支气管、细致器官及器官上皮细胞上，首先
肺炎支原体及其快速培养法概要
肺炎支原体及其快速培养法 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、nbsp;动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。 作者：罗三艳作者单位：412001 湖南株洲，株洲田心医院检验科支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。目前证明对人体有致病作用的支原体有肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体等几种，但临床以肺炎支原体最为常见［1］。肺炎支原体主要以飞沫传播，引起儿童、青少年呼吸道感染、咽炎、气管炎、肺炎等。近年肺炎支原体感染病例明显增多并有局部流行的趋势，早期诊断极为重要。 1 肺炎支原体的实验室检测方法目前，肺炎支原体的实验室检测方法有支原体分离培养、 PCR法检测质粒核酸、抗体检测、支原体快速培养法、分子生物学方法等。支原体细胞分离培养可获得肺炎支原体，可以确诊。由于支原体分离培养要求苛刻，一般医院实验室难以推广。此法阳性率低，需时3 周甚至更长时间，对临床快速诊断意义不大。PCR法检测质粒核酸快速、特异、敏感，但需昂贵设备，不易普及，且方法过于敏感，容易受污染。传统的冷凝集法检测肺炎支原体的IgM 抗体，方法简单、易行，但其敏感性和特异性均较差，易受病程影响。ELISA 检测支原体抗体法较为简便、可靠。由于发病初期，机体中尚未产生抗体不能被检出，发病时间较长此法才有意义。而快速培养法正以其简单、快速、经济、无创伤等优点，被越来越多的临床实验室所推广，也被越来越多的患者所接受。 2 肺炎支原体快速培养法肺炎支原体快速培养法是利用肺炎支原体的代谢产物使培养基液体中的指示剂颜色发生改变来判断其生长，标本中的其他支原体和细菌则被培养基中的青霉素和醋酸陀抑制［2］。此法操作简便、快速、无痛苦。先从冰箱中取出快速培养基，复温，按常规方法采集患者咽拭标本，将标本棉签浸入培养液，沿瓶壁挤压棉签，取出棉签、丢弃。旋紧瓶盖，登记标本号，35℃～37℃孵育24～ 48h，观察结果。培养基由红色变为绿色、黄色，且仍保持清晰透明，说明有肺炎支原体生长，明显混浊变色者不能视为阳性。培养液颜色不变，应判为无肺炎支原体生长。我院检验科是从2007年4月份开始展开此项检测，共检测293 例疑似肺炎支原体感染病例，阳性病例161 例，阳性率54.9%，及早为临床诊断、治疗肺炎支原体感染提供了依据。 3 讨论近年来，肺炎支原体感染明显上升，危害较大，其临床表现常无特异性，易与一般病毒性感冒相混淆。临床医生为了尽快缓解患者的症状，需根据患者症状、体征及肺炎支原体的相关检测，及早诊断、治疗。快速培养法不受病程影响，感染初期就可检测出肺炎支原体。有资料报道，在肺炎支原体检测的各种方法中，该法阳性病例病程最短，提示病程时间较短的患者选择此法检测的阳性率较高。快速培养法是诊断肺炎支原体的金标准 ［2］。肺炎支原体快速培养法采咽拭标本，采集标本前，用生理盐水漱口。所采集的标本应迅速接种，若不能及时接种，室温保存不超过2h。使用
支原体检测
支原体检验法 1 培养基 1.1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey 氏培养基。 1.2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 1.3 检验血清用无血清的支原体培养基 2 检查法 2.1 样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2.2 疫苗的检测 2.2.1 接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测 2.2.2.1 液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。 2.2.2.2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的
环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.2.2 对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.3 血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。 3.2 阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 附注：上述小瓶培养基是指在100ml小瓶中盛20ml液体培养基；小管培养基是指在1.0cm*10cm中盛1.8ml培养基。小管与小瓶须用胶塞封口。
肺炎支原体感染的血清学检验
肺炎支原体感染的血清学试验 参考范围： 补体结合试验(CF) <1:8 代谢抑制试验(M1) 阴性 问接血凝试验(PHA) 阴性 酶联免疫吸附试验(ELISA) 阴性 MG链球菌凝集试验<1:40 临床评价： 1．肺炎支原体（MP）是主要的病原性支原体之一，在临床上主要引起上呼吸道感染、气管艾气管炎及支原潍肺炎。过去称为“原发性非典型性肺炎”的病原体中，MP最为常见。约有80％的慢性支气管炎患者合并MP感染。肺炎病例中约有10％～20％由MP引起。MP感染后，可用各种血清学试验检测体内产生的特异性抗体，有助于疾病的诊断。 2．测定病人血清中特异性抗体，常用的方法有CF、MI、PHA和ELISA等，其中CF 试验是诊断支原体肺炎最常应用的方法。支原体有较强的补体结合反应，单份血清抗体效价>1：6 4或恢复期较急性期抗体滴度增加4倍以上即有诊断价值。一般补体结合抗体在感染后7～9天开始上升，3～4周达到高峰，维持4～6个月。问接血凝试验在MP感染的急性期即可出现阳性，血凝抗体可存在数年。代谢抑制试验可测定MP脂多糖胞膜抗原的相应抗体，方法敏感且特异性强。这种抗体的出现较上二者为迟。ELISA所用抗原为MP表面P蛋白，采用间接法检测特异IgM抗体，具有早期诊断意义。 MG链球菌凝集试验是检测患者血清中MG链球菌凝集素效价的一种方法。MG链球菌是从某些原发性非典型性肺炎病人的呼吸道或肺部分离出的一种非溶血性菌株，约有40％～50％的支原体肺炎患者恢复期血清中常产生MG链球菌凝集素，本试验呈阳性，故检测患者血清内凝集素效价对支原体肺炎有辅助诊断意义。本试验还有助于与病毒性肺炎的鉴别，病毒性肺炎不出现MG链球菌凝集反应。 3．采用分离培养的方法检测患者痰、咽拭等标本中的MP，对支原体肺炎具有病原确诊意义，但需要2周以上时间，且阳性率不等，在临床上不能早期、快速诊断。寒冷凝集试验是一种非特异性反应，在临床上常用作支原体肺炎的辅助诊断，约有50％以上病例可出现冷凝集抗体。应用PCR技术检测患者呼吸道分泌物和支气管肺泡冲洗物中MP的DNA，是敏感、特异且快速的实验室诊断方法。 4．影响本试验结果的因素 (1)CF试验的敏感性和特异性不高，所用的MP糖脂抗原可与许多微生物、植物及人体组织有交叉反应。 (2)MG链球菌凝集试验在某些严重感染性疾病也可呈阳性。 寒冷凝集试验 参考范围： 寒冷凝集试验 临床评价： 1．寒冷凝集素是由I抗原刺激机体产生的一种非特异性抗体，属IgM类，在0～10℃的寒冷情况下，能与O型人红细胞或自身红细胞的膜抗原结合，产生凝集现象。此种凝集反应具有可逆性，若将已凝集的红细胞再放置于37℃时，凝集现象即可消失。支原体肺炎患者血清中常可出现高效价的寒冷凝集素，寒冷凝集试验可用于测定该抗体的效价，有助于支原体肺炎的诊断。 2．寒冷凝集素大多在发病后1～2周开始出现，以后继续增高，于病程3～4周达到