目视比色法和分光光度法的分析和比较

目视比色法和分光光度法的分析和比较

2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳

临床医学院

指导教师：徐尧

一、摘要

本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优

缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有

不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。由此针对不同情况给出了不同的选择方案。这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。

二、前言

在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定

量分析的方法被应用到研究和生产中。常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。

三、内容

（一）两种比色方法优缺点比较

1.目视比色法

1）优点

（1）比色时操作简便，成本较低

相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。

在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。

（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况

目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在

2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍

过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。

本实验中，目视比色法实际上测量的是通过Fe(SCN)3溶液的光的强度，而

在分光光度法中实际测定的是某一单色光（如蓝色）被吸收的情况。

1）缺点

（1）精确度较差

目视比色法主要依靠人的眼睛来观察颜色深度，不可避免地会受到观测者主观因素的影响，因此其准确性自然会受到显著影响。一般来说，目视比色法的相对误差为5%-10%。

通过询问助教老师，我们知道本次实验中所测未知液浓度为1.5×10-3mg/mL。由此，我们比较了教学网上本次实验的数据，对于233组未知液浓度的有效数据，一共有96组数据目视比色法得到的浓度范围为0-2.00×10-3mg/mL，统计中我们发现大量同学的浓度范围在0-8.00×10-4mg/mL，这显然是没有换算为原溶液浓

度所致，故这部分同学也认为读数正确（而计算错误）。两部分同学总计为126名，比例达到54.1%。对于同样的未知液，我们发现不同组的结果有较大差距，这同样说明了目视比色法有较大的主观性和偶然性，只能用于精确度要求不高的场合。

另外，由于人眼辨色能力的限制，所配置的浓度梯度间距不能过小，这就意味着我们只能给出浓度范围，极大地限制了所测定浓度的精确度。

（2）多次测量过程中操作繁琐

数不准确等因素造成的，但是一定型号的分光光度计透光度读数误差是一常数（0.2 %～2 %）。如果有多人同时使用一台或一个型号的分光光度计，或者一人

多次使用同一台分光光度计，理论上只需要配制一组不同浓度标准液即可。

2.分光光度法

1）优点

（1）灵敏度高

分光光度法有很高的灵敏度，其测量下限可以达到10-6~10-5M（本次实验中达到10-3mg/mL），这主要是由分光光度计的原理所致。分光光度计所使用的光

接近于真正的单色光，其光谱最大带宽不超过（3~5）nm，在紫外光区甚至可以达到1nm以下[1]。此外，分光光度计测定时选用的波长通常为被测物质的最大吸收波长，物质在含量上的稍许变化将会引起较大的吸光度差异，同时也避免了其它物质的影响。因此，分光光度法的灵敏度相当高。

（2）准确度高

分光光度法的另一个优点是准确度高，其相对误差约为2%~5%，优于目视

比色法的5%~10%[3]。这是因为该方法基本消除了主观因素的影响，同时利用了作工作曲线的方法来降低偶然误差。又由于仪器本身的精确度是非常高的，因此分光光度法所产生的误差相对较小，其测量值更加接近于真实值。

（3）可适用于无法使用目视比色法进行测量的情况

分光光度法还可以同时测定溶液中两种或两种以上的组分。根据吸光度的可加性，溶液的吸光度等于溶液中各组分的吸光度之和，即A=ΣA i=κ1b1c1+κ

b2c+…+κn b n c n，只要能够测得多组波长下对应吸光度的值，就能够通过解方程2

组的的方式求出每一组分的吸光度和含量（这种方法精度较低，精度更高的方法有AKC矩阵法、最小二乘法、CPA矩阵法、岭回归法、偏最小二乘法、卡尔曼滤波法、人工神经网络法[4]）。而目视比色法对于同时有多种显色物质的溶液就

显得无能为力了。

分光光度法甚至还适用于许多无色物质，因为分光光度法是通过比较物质对某一波长光的吸收情况来测定其含量，故只要无色物质在紫外或红外光区域有吸收峰，就可以由紫外光或红外光测定。[3]

2）缺点

除了操作复杂，使用成本高以外，分光光度法还具有另外一些目视比色法没有的局限性。

（1）不能适用于偏离Lambert-Beer定律的情况

由于我们需要通过制作工作曲线来测量浓度，分光光度法严格依赖于Lambert-Beer定律，但是实际情况中，在许多溶液中Lambert-Beer定律并不完全适用。物理因素方面，当待测液为胶体、悬浊液、乳浊液时，就会由于散射作用使测得吸光度增大。入射单色光的纯度、是否垂直透过比色皿也会产生影响。化学因素方面，由于吸光质点间会产生相互作用，当待测液浓度较高时，就会产生较大误差。此外平衡效应，物质的解离、缔合、形成新化合物、互变异构等化学反应也会引起对定律的偏离[3]。在这些情况下，分光光度法的使用就会受到局限。

在下一节的适用范围中，我们将对这些情况进行详述。

（二）两种比色方法的适用范围

1.目视比色法

目视比色法的的适用范围较广，一般来说，对于低精度，大批量的试样测定，目视比色法是非常适合的。在实际的生产或调查中，往往不需要非常高的精度，而且实际情况一般比较复杂，很难像在实验室中那样用分光光度计进行测定。这时，用目视比色法就是一个非常好的选择。只需要简单的几件仪器设备，就可以做到随时随地取样，随时随地测定。但是目视比色法也不是所有的情况都适合。1）目视比色法仅适用于吸收峰在可见光区的物质

人眼的辨色区间为400-750nm，这也就意味着如果所测物质的吸收峰仅在红外或紫外光区出现，则物质在白光下呈无色透明，不可用目视比色法进行浓度的测定。在测定摩尔盐中Fe3+含量的实验中，吸收峰在480nm左右，因此可以用目视比色法进行测量。

2）目视比色法仅适用于单组分有色物质的测量

2.分光光度法

1）分光光度法可测量无色物质的浓度

对于很多无色物质，只要其在紫外或红外区具有吸收峰，就可以用分光光度计进行浓度的测定。

2）分光光度法可测量多组分体系中各组成部分的浓度

3）分光光度法适用于吸光度属于0.2-0.8的情况

在光度计中，透射比的标尺刻度是均匀的（因为测量方法是由透过的光子引发电流，并测量电流）。吸光度与透射比呈负对数关系，故它的标尺刻度是不均匀的。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也就越大。

图1.A-T对应示意图

以下我们来计算吸光度具有较小浓度测量误差的适用范围：

若在测量吸光度A时产生了一个微小的绝对误差dA，则测量A的相对误差（E r）为：E r=

根据朗伯-比尔定律：A=εbc

对其两边微分，得：dA=εb dc，其中dc即为浓度c的微小绝对误差。二式相，由此我们知道A和c的测量相对误差完全相等。

除可得： c

c

A与T（透光率）的测量误差之间的关系如下：

可见A与T不是正比关系而是负对数关系，它们的测量相对误差并不相等。

于是，引起的浓度c的测量相对误差为：

c

c

由于T的测量绝对误差或不确定性是固定的，即dT=ΔT=±0.01，故

图2.E r-T示意图

由图可知，若T = 36.8%(A =0.4343)，相对误差最小，这是测定的最佳透光率（吸光度）；若T在15%~65％之间，即A在0.2~0.8之间时，相对误差较小，而一旦超出这个范围，相对误差就会迅速增大，所以分光光度法不适用于A在这个范围之外的情况。[3]

在测定摩尔盐中Fe3+含量的实验中，本实验组所测吸光度值未知液、摩尔盐溶液、母液的吸光度分别为0.072、0.145、0.657，从而可知后两者相对误差较小，而未知液浓度的测量相对误差则较大。

4）分光光度法仅适用于介质符合朗伯-比尔定律的情况

在分光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质

浓度较高时，明显看到通过原点向浓度轴/吸光度轴弯曲的情况。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。从而对所测物质有以下要求

（1）朗伯-比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的

如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，导致透射比减少，从而使得实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。

本实验中溶液组成部分不含胶体溶液、乳浊或悬浊，因此满足分光光度法对于这项条件的要求。

（2）要求被测组分以一种形式存在

如果体系中随浓度变化进行了不同程度的组分反应，则会导致对朗伯-比尔定律的偏移。

如果显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN –浓度越大，溶液颜色越深，吸光度越大。这显然已经不符合吸光度仅随所测物质浓度变化的要求[3]。故在本实验中加入了过量的KSCN，使溶液中存在的主要为高配物，从而消除这一影响。

在发生缔合反应的情况中，例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。

（三）两种比色方法对溶液浓度的不同要求

1.目视比色法

由于人眼色觉分辨能力的限制，目视比色法要求所测溶液浓度控制在一定范围，而这一范围与所测物质的吸光系数有关。比如，检测水质的纳氏试剂比色法中，使用目视比色法时，最低检出浓度为0.2mg/L，上限浓度为2 mg/L；在使用次氯酸钠法检测水中的三乙胺时，目视比色法的最低检出浓度为0.4mg/L[5]。2.分光光度法

由于Lambert-Beer定律是一个有限的定律，它只适用于浓度小于0.01mol/L 的稀溶液。因为浓度高时，吸光粒子间的平均距离减小，受粒子间电荷分布相互作用的影响，它们的摩尔吸收系数发生改变，导致偏离Lambert-Beer定律。因此，待测溶液的浓度应该控制在0.01mol/L以下。

另外，根据适用范围的讨论中对于吸光度范围的限定，由朗伯-比尔定律，并以比色皿透光厚度为1.0cm为例，我们可以推算出可以使用分光光度法而不产

mol/L，以测量时加入显色剂后所成物质ε 为生较大误差的浓度范围为

εε

例，则浓度范围为--。不同物质对于其浓度区间有不同要求。

四、结论

由以上讨论，我们可以合理地得出以下结论：

目视比色法具有设备简单、操作简便及适用某些不严格服从Lambert-Beer

定律待测液的优点，缺点是准确性不高，并且每次都需要重新配制标准色阶。适用于可见光区、单组份的测量。

分光光度法优点是准确度高，适用于有多种显色组分及吸收峰分布在红外或紫外区域的试样组分含量的确定。但它不适合胶体、悬浊液、乳浊液等有较强散射作用的液体。同时只有吸光度A的范围在0.2~0.8之间时才适用。