硕士学位论文 猪细胞因子检测方法的建立与初步应用

硕士学位论文

多头带绦虫Tmls基因的克隆与原核表达

目录

中文摘要.......................................……，.....……‘...................……，......................................……I

英文摘要....................……，.............……‘…，..............................................……‘.................……n

目录..................................................................，.................................，...................，. (i)

第一章文献综述.....................................................，.. (1)

动物绦虫坳病疫苗研究进展 (1)

l天然抗原..............................................，........................，...........‘ (1)

1.1六钩拗及其分泌/排泄物二，................................，...，.........................，...，. (1)

1‘2原头拗及其组分抗原.....，二‘. (2)

1.3细胞苗..................................................................，...............，.. (3)

2基因工程疫苗...........................， (3)

2.2重组蛋白疫苗 (4)

2.2.145w家族.............，.........................，.................................................................、. (4)

2.2.216kDa和18kDa抗原............，..........，.........................，.......， (6)

2.2.3Eg95和Em95 (7)

2.2.4多肤疫苗..................................， (8)

2.3核酸疫苗.......，，二，.............................，....................................，............，.. (10)

3疫苗研究展望.....，，.....................................................，.......................，. (12)

4本试验的目的意义.....................................................................，.. (12)

第二章多头带绦虫Tmls抗原基因的克隆和原核表达.....， (13)

1材料和方法......................................................................................................，.. (13)

1.1材料........................................................................................，.，..........、，，. (13)

1.1.1虫株和实验动物....................................................................................，.. (13)

1.1.2主要试剂.......，.................................................‘.，.，. (13)

1.1.3菌株及质粒载体....……，.....................................··········································……

14

1.1.4主要仪器设备 (14)

1.1.5培养基及常用液体的配制......................................，.. (14)

1.1.6主要生物信息数据库和计算机软件.................‘......................................，. (16)

1.2试验方法..................................，...................，........， (16)

1.2.1多头带绦虫虫卵的收集和六钩坳总RNA的提取..............................。.. (16)

1.2.2多头带绦虫Tmls基因的克隆.................................................，.. (17)

l.2.3Tm18基因原核表达载体构建.......................，..........................，.. (20)

1.2.4重组pGEX一4T-1一Tmls质粒在大肠杆菌中的诱导表达 (21)

1.2.5重组蛋白的纯化.....................................................................................，. (23)

1.2.6重组蛋白的免疫印迹(Westem一Blotting)检测..............，.. (24)

脚1.2.7重组蛋白免疫小鼠的抗体水平的检测 (25)

2结果..........................................................................................‘.. (26)

2.1多头带绦虫Tmls基因的克隆....................................................，.. (26)

2.1.1多头带绦虫Tmls的扩增和克隆质粒的鉴定 (26)

2.1.2多头带绦虫Tmls基因测序鉴定........................................， (26)

2.1.3多头带绦虫Tmls基因的序列分析.，...............，..................， (26)

2.1.4多头带绦虫Tmls基因的蛋白质生物信息学分析......‘ (29)

2.2重组Tmls基因的亚克隆 (34)

2.2.1重组Tmls基因片段的扩增.，...............‘. (34)

2.2.2pMD18一T-rTmls质粒的鉴定 (34)

2.3pGEX一4T-rTmls重组表达质粒的构建与鉴定 (34)

2.4pGEX一4T-rTmls重组质粒表达产物的SDS一PAGE电泳分析…‘.................……‘.34

2.5重组蛋白的纯化和免疫印迹检测....................................................，............‘ (36)

2.6重组蛋白免疫小鼠的抗体水平的检测.......................................，..............， (37)

2.6.1小鼠血清中lgG的检测结果............................................，. (37)

2.6.2小鼠血清中lgGI的检测结果.....................................， (38)

2.6.3小鼠血清中IgGZa的检测结果...............................................。 (39)

2.6.4小鼠血清中IgE的检测结果 (40)

2.6.5小鼠血清中IgM的检测结果 (41)

3讨论二， (42)

3.1关于绦虫的18kDa抗原.........................，......‘ (42)

3.2多头带绦虫的Tmls抗原 (42)

3.3多头带绦虫Tm18的表达....，................，.，.，.........，.....................。.. (43)

3.4重组抗原的免疫活性............................，，..............，.. (44)

4结论与创新点...........................................................................·...............············，···一44

4.1结论..…，.…，.........................................................................................................……，44

4.2创新点........................................................................................................，....‘....，. (45)

参考文献……，...................................……，..…‘.……，.........……，.......................................……‘46

致谢..........................................................................................................，.. (50)

攻读学位期间发表的学术论文 (51)

第一章文献综述

动物绦虫蜘病疫苗研究进展

动物绦虫蝴病是带科绦虫的中绦期幼虫寄生于中间宿主体内所引起的寄生虫病，

包括猪囊尾坳病(Cystieereuseellulosae)、牛囊尾坳病(Cystieereusbovis)、细颈

囊尾坳病(Cystieereustenuieollis)、羊囊尾坳病(Cystieercusovis)、豆状囊尾坳

病(Cystieereuspistiformis)、脑多头坳病(Coen二5cerebralis)、连续多头坳病(C

oenurusSerialis)、棘球坳病(Echinocoeeiosis)、链尾拗病(Strobiloeercosis)等。

中间宿主吞食了含有虫卵的食物和水后，在胃液和肠液的作用下，六钩拗从虫卵中孵

化出来并被激活后，钻入肠粘膜侵入宿主的体内，再通过体液循环到达其定居的组织

和器官，并发育成为成熟的中绦期幼虫。动物绦虫坳病是一种慢性的，消耗性的疾病，

多数并不致死，包括人在内的多种哺乳动物都可以感染。绦虫蝴病不但在经济上给畜

主造成了很大损失，且由于该类疾病可在人和家畜、人和野生动物、家畜和野生动物

之间传播，危害人体健康，因此，具有重要的公共卫生学意义。

对于动物绦虫坳病的防控，长期以来存在两种方法:一种是药物防治;另外一种

是免疫预防。由于寄生虫抗原的复杂性及免疫逃避机制的存在，抗原来源的局限性，

疫苗的成本过高等因素的制约，免疫预防无法在生产实践中大规模应用。然而，随着

寄生虫抗药性的出现以及人们对食品中药物残留的关注，免疫预防又重新受到关注，

寄生虫疫苗的研制又有了新的动力。绦虫坳病是作为一类重要的人畜共患病，研究人

员格外关注，随着对绦虫坳病研究的不断深入，绦虫坳病的疫苗研究也取得了一定的

突破。下文主要从抗原的角度阐述绦虫病疫苗的研究现状。

1天然抗原

1.1六钩蜘及其分泌/排泄物

早期绦虫坳病疫苗与其它的寄生虫病疫苗一样，主要的抗原成分为天然抗原。天

然抗原主要来自于六钩坳及其分泌/排泄物(Es)，原头拗及其分泌/排泄物、囊液、囊

壁等，其经过处理后用于制备的绦虫坳病疫苗。

在上世纪的60一70年代，Gemmell就发现通过肌肉注射活的同种或异种绦虫虫卵，

可以使绵羊产生有效的免疫保护反应川;而经过冻融或超声破碎处理后则不会lz]。然

而，Rickard和Ben设计了一个特殊装置，排除了六钩坳对实验的影响，证明了绵羊

带绦虫和带状绦虫的六钩坳排泄/分泌产物可刺激宿主产生免疫保护反应I3j。verster等I’1用多头绦虫的六钩坳分泌性抗原(oncosPheresecretoryAntigenosA)间隔两

周免疫四月龄羔羊，再用虫卵感染，动物剖检结果显示免疫组的感染率为16.6%(5/

30)，而对照组为72.7%(8/11)。Pathak等[5]发现猪带绦虫六钩坳的E/s也能诱导

机体产生对攻击感染的高度抵抗力，免疫猪和对照组之间猪囊尾坳平均数有非常显著

性差异，8头免疫猪的囊尾坳平均为19个，而8头对照猪的囊尾坳平均为369个。

随后的研究证实，其它带科绦虫的六钩坳体外培养的上清液和六钩坳粗提物都有抗绦

虫蝴病的感染的效果，并发现这种抗原是一些能被尿素溶解的膜结合蛋白[6]。这一

基础研究为后来的基因工程疫苗的研究奠定了基础。

国内也进行了相似的研究，张文宝等[7l用多头带绦虫六钩蝴代谢物制备的疫苗，

免疫12周龄的羔羊(相当于13000个六钩坳的代谢产物)，24天后再用7500个虫

卵感染，结果显示相对于对照组(6只全部死亡)免疫组的保护率为75%(9/12)。

同时田间实验的感染率下降了70.7%(11.6%/15%)。此外，朱兴全等l8]用细粒棘球

绦虫六钩拗排泄分泌(ES)抗原加入弗氏不完全佐剂两次免疫绵羊后，用1000枚虫卵

攻击感染，七个月后的剖检结果显示其减囊率达%.04%。Fan等191分别用猪带绦虫和

亚洲带绦虫(https://www.360docs.net/doc/a314658102.html,tica)的灭活六钩坳皮下免疫猪，一个月后用10000个活虫卵攻击感

染。结果免疫组平均检出4个活囊尾坳和625个钙化或变性的囊尾坳，对照组则检出

2567个活的和10个钙化或变性的囊尾拗。

1.2原头蜘及其组分抗原

在绦虫拗病的疫苗研究中，有些人将原头拗及其组分制成疫苗免疫中间宿主。曾

经用过的抗原有囊尾坳的粗提物、囊尾坳的头节抗原(SPA)、囊尾坳的囊液及囊壁

蛋白。Molin硕等!’“]用猪囊尾坳制备的免疫复合物间隔7天接种猪两次后，用猪带绦

虫卵攻击感染。发现免疫组与对照组相比保护率达842%(63.1/74.9)。在墨西哥G

uerrero州北部猪囊尾坳病流行区进行了田间试验，在试验开始时通过流行病学调查

发现猪舌猪囊尾坳的感染率为2.4%(62/2650)，以150林g猪带绦虫囊尾坳粗抗原免疫

后，感染率下降到了0.45%l”]。Naseimenlo等[‘2]用猪囊尾坳头节抗原(seolexprotein antigenspA)，加福氏不完全佐剂(Freund，5adjuvantIFA)或棒状杆菌(Co叮nebaeteriu

mp一mCP)后间隔20天皮下注射猪3次，10天后用10000个猪带绦虫卵感染。

免疫组与对照组相比保护水平达71.43%和75.00%，并可检测到高滴度的的特异性抗

体。Manoutcharianl’3]等曾用带状带绦虫囊液的56、66和74kDa蛋白制备猪囊虫疫

苗，免疫猪后用10000个的猪带绦虫虫卵感染，结果获得了较高的保护84.0%(0.04

2 2/0.05)。

此外，国内的窦兰清【’4，”l等对多头坳囊液及囊壁抗原的免疫保护效果进行了研

究，用多头坳抗原三次免疫羊后，攻击感染2500个多头绦虫虫卵，囊壁抗原免疫组

羊只获得全保护(3/3)，囊液免疫组、原头节抗原免疫组和原头节E/S抗原免疫组

羊只均获得部分保护(3/4、2/3、2/3)。朱兴全等116]研究了细粒棘球绦虫原头节及其

E/S抗原的免疫原性，原头节ES抗原免疫绵羊诱导很强的免疫保护力，其减囊率达9

2.07%，原头节可溶性粗抗原为74.89%。

1.3细胞苗

尽管以天然抗原为主要组分制成的疫苗获得了不错的免疫保护效果，然而由于来

源的局限性以及生产工艺的不健全，导致其无法大规模的生产，在实践生产中无法广

泛应用。为了解决抗原的来源的局限的问题，后来出现了绦虫坳的组织细胞苗。

在对绦虫坳病的疫苗进行研究的同时，研究者一直在不断的探索建立绦虫的细胞

系。早期对绦虫的六钩坳的体外培养实验发现，六钩坳经过一段时间培养后，可以发

育成早期的原头拗。因此，后来的细胞系建立多以原头坳为细胞来源。Fiori等117]对

不同种源的细粒棘球拗的生发层细胞进行培养，发现牛源细粒棘球坳最容易培养，其

培养了720天。陆家海等【’“]从细粒棘球坳病人体内获取生发层和原头节作为培养材

料，首次成功培育出一株人源细粒棘球坳细胞系(13G一5)。该细胞系主要以成纤维

型细胞为主，呈贴壁生长;经接种小鼠后能形成包囊样结构;接种鼠产生对囊液抗原

的特异性抗体;用该细胞系细胞的代谢物作为粗制抗原进行的免疫预防接种实验可使

60%的小鼠获得保护。

李靓如等I’9]建立了猪囊尾拗cc一97免疫细胞系，并用细胞和代谢产物作为抗原

研制疫苗，进行了的动物保护实验。结果显示细胞系细胞(颗粒抗原)和代谢产物(可溶

性抗原)均具有高度的免疫原性，其中用300万个细胞制成的油乳剂灭活疫苗的完全

保护率达50%，减虫率达92.31%。张中庸等120]用该疫苗在全国进行了大范围的区域

性免疫试验，其平均保护率为%.18%。2006年4月猪囊尾蝴细胞灭活疫苗获得了农

业部的批准，并颁发了新兽药注册证书，证号:(2006)新兽药证字09号。

2基因工程疫苗

现代生物技术在寄生虫学的发展，尤其是分子生物学技术的应用，加之寄生虫免

疫学研究的进一步深入，保护性抗原分子的鉴定及抗原基因的分子克隆不断取得进展，为研制基因工程疫苗防治寄生虫病奠定了基础。三十多年来，经过科学家的不懈

努力，绦虫坳病的基因工程苗取得了令人鼓舞的成就，一些疫苗还进行了商业生产。

2.2重组蛋白疫苗

2.2.145w家族

应用分子生物学技术，1989年Johnson等f2’]首先开发出了羊带绦虫(Taeniaovi

，)基因工程疫苗一45W疫苗，这是绦虫坳病研究史上一个里程碑的发明，为后来绦

虫坳病疫苗的研究提供了模板。他们首先应用免疫杂交技术从丁ovis六钩坳ES抗原

中筛选出羊囊虫血清反应强烈的47一52kDa蛋白，该蛋白免疫羊后获得了很高的保护

率(98.0%);然后，用该蛋白制备的特异性抗体，筛选羊带绦虫的六钩坳文库，得到

了阳性克隆45W和455;将45W和455基因导入表达载体后，在大肠杆菌中与日本

血吸虫谷肤甘肤S转移酶(GST)共表达，获得的融合蛋白经亲和纯化后，以GST作对

照进行免疫实验。结果表明，45W一GST重组疫苗可有效抵抗里ovis虫卵的攻击，其

保护率可达94%;而455一GST重组抗原则没有免疫保护效果。序列分析发现455基

因为45W基因的短小转位。

rovis45WmRNA全长约l.lkb，有四个外显子剪接而成，完整的ORF(叩enr

eadingframe)为765bP，具有真核生物mRNA典型的5’帽子结构和Ploy(A)尾巴。T.

ovis的45W蛋白由254个氨基酸组成，推导分子量约为28kD，可能是由于缺少了糖

基化的缘故比实际的要小122)。

45W一GST疫苗的效果在新西兰得到了确认，无论是自然感染或实验攻击保护都

在90%以上。然而45W一GST蛋白很不稳定，大多以降解形式存在，所以不能满足疫

苗商业化发展的需要。T045WB/X为Tovis的45W基因的Bam一众。片段，表达的重

组蛋白与45W·GST蛋白相比缺失了N端的信号肤和C端的疏水区的氨基酸残基，其

稳定性较45w一GST蛋白的稳定性大大增强[23]。这一研究为疫苗的商业化生产提供了

技术支持。1994年以45WB仪一GST研制出的羊带绦虫疫苗“quovadit”，在新西兰

注册。45WB仄一GST蛋白在4℃下保存两年仍然稳定，包涵体用尿素或SDS等强变

性剂处理后，免疫原性仍然良好(保护率为89%一100%)[23]。在后继的研究中发现，

刃ovis455全长基因表达的GST重组蛋白可以保护羊对里ovis虫卵的感染，其保护率

可达86.9%124]。

随后，其它带科绦虫六钩坳的45w相继发现。LightowlerS等[2s]扩增出了牛带绦虫(Taeniasaginat。)的45w 家族的基因一TSA一9，与TO45W的序列和氨基酸同源

性为83%和72%。TSA一9导入大肠杆菌经表达获得其GST重组蛋白，该重组蛋白有

可溶性和包涵体两种形式。动物保护实验结果显示，分别用200林g可溶性的TSA一9-

GST和TSA一18一GST免疫牛后，可使27头牛中的14头获得了完全保护，减囊率可达

94%一99%。

猪带绦虫(Taeniasolium)45w基因可能以轮换剪接的方式，形成了A、B和c

型3种转录版本，这是绦虫中的首次发现126]。Flisse:等[27l将TsoL45一IA基因亚克

隆入pGEx一lT中，在大肠杆菌中表达融合蛋白，表达产物经纯化后获得TSoL45一IA

一GST重组蛋白。以该重组蛋白为抗原进行动物保护实验，结果显示，免疫组的减虫

率可达97.1%。TSO45W基因三个转录版本中同源性最高、转录量最大的TSO45一4B，

也被考虑作为疫苗抗原基因。骆学农等[28]对Tso45一4B的免疫活性进行了研究，Ts

045一4BX单独免疫后可获得94%的减虫率，与粗抗原免疫组的减虫率相当。而混合

免疫组TSO45一4BX+TSO一18+IL4的减虫率达99.7%，且保护率达到80%。

对多头带绦虫的45W基因的研究发现，在多头带绦虫的中绦期幼虫，成虫中均

可扩增出45W基因，由此认为在多头带绦虫45w基因仍是以基因家族的形式存在[29，

301。由弘等构建了多头坳的45w重组表达载体45m一pET4lb，成功诱导表达了重组蛋

白。用45W重组蛋白免疫动物后制备的高免血清，不仅可以与多头带绦虫的成虫和

幼虫抗原在63KDa处发生反应，也可与细粒棘球绦虫的不同阶段的虫体天然抗原(囊

液、囊壁、成虫和原头坳抗原)发生不同程度的免疫交叉反应，这一结果提示在细粒

棘球绦虫的不同发育阶段可能存在45m的同源蛋白，或者45m是某些带科绦虫虫种

发育的必需基因。

分析带科绦虫的45W蛋白的氨基酸序列，其N端有分泌性信号肤，C端的跨膜

区及可供粘多糖结合sGsG序列，提示45w蛋白为糖基磷脂酞肌醇锚定(glycosylPh osphatidylinositolanchor，Gpl)蛋白，而Gpl一蛋白多为分泌性蛋白或膜结合蛋白，这

恰好与天然45W蛋白的特性相符。同时，45W蛋白存在多个与糖基化有关的位点，

如Tovis的45w六个N一x一s/T位点和(190，0)s/T残基122]，Tso45一A型蛋白中存在5

个N连糖基化位点，分别在74，96，106，139和169位的氨基酸(Asn)处[26]。在

对应外显子11和111的氨基酸残基分别构成了纤连蛋白111型(fibronectin111typedomai

n，Fnlll)结构域，Fnlll结构域与免疫球蛋白超家族、细胞粘附分子、细胞表面受体和

糖结合蛋白有部分同源性，是胞外分泌性蛋白的典型结构。因缺失外显子H的TSO4

55一B型只有一个Fnln结构域【26]。45w蛋白作为一种胞外蛋白和具有的免疫保护特性，

提示45W蛋白可能在六钩坳感染宿主的过程中有重要的作用[3l]。

对带科绦虫45W蛋白的研究，显示45W蛋白是一种优良的疫苗抗原，可以实现

良好的免疫保护效果，相信在后继的其它带科绦虫研究中，45W蛋白也是重点。

2.2.216kDa和18kDa抗原

H翻son等[32l发现经sDS一PAGE分离的12一18kDa的羊带绦虫六钩坳抗原对在

了ovis感染中具有很高的免疫保护效果。而其中16kDa和18kDa能与兔抗丁ovis六

钩拗12一18kDa抗原发生强烈反应，于是用16kDa和18kDa特异性抗血清筛选羊

绦虫六钩坳cDNA文库，共筛选出了的10个16kDa和1个18kDa基因，将其亚克

隆到pGEX一IT中表达GST融合蛋白，表达产物免疫羊后进行的动物保护实验。结果，

TO18一GST、TO16.17一GST融合蛋白能诱导羊产生高水平的免疫，并能抵抗羊绦虫虫

卵的攻击感染。而TO18和Tol6.17基因与TO45W基因并无同源性，因此，被认为

是能诱导高免疫保护效果的新型抗原基因。

Lightowlers等125]用Tols的cDNA为探针，分析牛带绦虫基因组，从其m翩A

中克隆了一个同源序列TSA18，与TO18的氨基酸同源性为80%。表达的蛋白可诱导

高水平的免疫保护，可作为疫苗抵抗牛绦虫虫卵的攻击感染。Benitez等133]用免疫定

位牛带绦虫的18kDa抗原在六钩坳上的分布，发现其主要分布在小钩上和与穿刺腺

附近，推测18kDa抗原可能有一定的酶活力，并与六钩坳入侵组织有关。

Gauci等[3’l用DIG标记的作为TO18探针，从猪带绦虫六钩坳cDNA文库中筛选

出了出了Tso一18基因(U75739一42)。TSo一18基因长579bp，含有一个390bP的开

放阅读框，编码130个氨基酸，预测的蛋白质分子量为14.7kDa。TSO一18的撷氨酸扭

al)残基含量高达12%，并有一个N连糖基化位点。TSO一18基因与其他绦虫的18kDa

基因的同源吐都为540，0(Tols，TsA一18，HP6一4)[3，]。Flisse:等[27]在墨西哥和喀麦隆进

行的动物保护实验显示TSO一18一GST疫苗对猪带绦虫虫卵的免疫保护率为99.5%一10

0o’o。Gonzalez等136]也取得99.9%保护率。骆学农对TSO一28的研究也显示TSO一28一G

sT抗原能对猪带绦虫虫卵的感染形成有效的保护，其减囊率达到940/01281。Assana

等137】在喀麦隆进行了TSO一18一GST疫苗的田间试验，结果发现免疫组无一感染，而

对照组感染率为19.6%。通过RT一PCR扩增得到的猪带绦虫16kDa抗原基因(TSOL

16A和TsoL16B))，其与羊带绦虫的Tol6基因的同源性很高，其基因结构也十分

相似，两者的基因序列很保守，尤其是在编码信号肤和Fnlll片层的区域[38]oGauci等139]通过RT一PCR 扩增获得了多头带绦虫的Tmls和Tml6基因，构建了

GST融合表达载体，获得了具有免疫活性的Tm18一GST和Tm16一GST重组蛋白。Tm

18和Tml6基因与其他带科绦虫的同源基因的同源性很高。此外，还发现威尔士、

英国、土耳其三个不同地理株的Tmls和Tml6基因序列并无差异。动物保护实验中，

对照组感染率100%(9/9)、死亡率55.6%(5/9);而免疫组无一死亡，Tm16一GST

免疫组感染率50.0%(3/6)，与Tm18-GST共同免疫组感染率42.9%(3/7)。随后

在意大利进行了田间试验，与对照组7.78%(33/424)的发病率相比Tm18一GST免疫

组的发病率仅为0.48%(1/208)，这一结果提示Tmls一GST重组疫苗有良好的免疫

保护效果，具有推广的价值1401。

2.2.3Eg95和Em95

Ligntowlers等[4’]用抗细粒棘球绦虫(及人inocoecus脚nutosus)六钩坳抗原(23-

25kDa)的抗血清筛选细粒棘球绦虫六钩坳cDNA文库，成功筛选出了Eg95基因，并

表达出Eg95一GST融合蛋白。融合蛋白加入佐剂后免疫动物，保护率为可达98%。其

获得的Eg95基因长715bP，其中开放阅读框为462bP，编码153个氨基酸，预测的蛋

白质分子量为16.skDa。序列分析发现:Eg95和其他带科绦虫保护性抗原一样，含有

Fnln结构域，提示Eg叱可能在细粒棘球绦虫六钩坳入侵小肠绒毛上皮的过程中起重

要作用。

对Eg95基因的研究发现，在细粒棘球绦虫的六钩坳、原头坳和成虫三个阶段的

噬菌体文库和总拟A中均可克隆出Eg95基因，同源性分析结果与GenBank基因序

列一致，表明Eg95基因是高度保守的，提示Eg95可在细粒棘球绦虫的几个不同发

育阶段表达，是细粒棘球绦虫生长发育中所必需的142，43]。

Eg95疫苗初步的动物实验就表现了不错的抗感染能力(96一98%)，由此也被认为

是预防细粒棘球坳最有前途的疫苗川]。随后，Lightowle:等在新西兰，澳大利亚和阿

根廷进行了Eg95疫苗的动物保护实验，用50林g的Eg95一GST融合抗原加lmg的Qul !A，间隔一个月经皮下免疫4一6月龄绵羊2次，两周后再用当地细粒棘球绦虫虫卵感染，一年后剖杀检查。相对于对照组免疫组羊保护率分别为100%、%%、99%，平

均为99.3%，其中86%的羊获得了完全保护[44]。该疫苗二免后可产生至少12月的免

疫保护，若是第二次免疫后隔6一12个月再加免一次可以产生记忆反映，保护率达10 O%免疫期为3一4年，畜群可以获得理想的免疫效果。另外免疫能力可通过怀孕母畜

垂直传给新生幼畜，对初生羔羊和犊牛的保护期分别为3个月和4一5个月[45]。在新疆，7青海和四川进行的田间实验和人工感染实验显示Eg95的免疫保护效果良好14547】。据报道IL的大肠杆菌培养物可生产出10000份免疫剂量，说明该疫苗用于大批量生产

是经济可行的[’8]。因此Eg95疫苗也是现在抗细粒棘球绦虫六钩坳感染的唯一商业化

生产的疫苗。此外国内外学者还构建了不同的Eg95表达载体，如甲醇酵母表达体系[4 91、卡介苗表达体系1501、口蹄疫病毒载体15’]、转基因植物载体[52]等。

oauei等[，，]用Eg95标记的探针从泡状棘球绦虫(及人inocoeeusmultilocularis)原

头坳的cDNA文库中筛选得到了一个克隆，将该基因命名为Em95。Em95cDNA长

570bp，其ORF为447bp，与从DNA推导的Em95基因相比，其缺失了ATG及编码

七个氨基酸的序列，与Eg95一1和Eg95一6的氨基酸序列同源性分别为80%和84%。E m95基因编码156个氨基酸，分子量为17.IKDa。对氨基酸序列进行分析发现:N端

有信号肤区域(aal一16)，C端存在跨膜区域(aa139一155)，序列中有多个糖基化

位点，还有一个与免疫相关的Fnln结构域(aa34一119)，提示Em95蛋白是一种分

泌性的免疫相关性的蛋白。通过构建表达载体获得的Em95一GST融合蛋白能诱导小鼠

产生对泡状棘球绦虫虫卵的抵抗力，其动物实验的结果显示Em95一GST免疫组可以产

生63.1%一82.9%的保护率。

2.2.4多肤疫苗

蛋白质抗原的功能并不是通过完整分子发挥的，而是由其特异性的表位来体现

的。一组表位的合理组合与搭配则是产生免疫保护性的基础。因此，多肤疫苗的开发

是以抗原表位的研究为基础的。

Lightowlers等1241用9个氨基酸重叠多肤进行羊带绦虫的45w抗原表位分析，发

现其抗原决定簇可能由23个氨基酸(DYEQPIERTVVEYPSLRDIFAWE)和(或)9个氨

基酸(VwvTTsos)残基组成。Dadley等[，4]合成对应于4sw的N端和e端宿主保护

性区域，发现45W重组蛋白的抗血清能与N端多肤发生强烈反应。单独用N端和C

端多肤或与载体结合后免疫羊，发现N端多肤具有免疫原性，C端多肤只有与载体

蛋白结合才具有免疫原性，而且只有N端特异性多肤抗体可以与羊绦虫六钩坳抗原

结合。此外，经SDS处理的天然45W蛋白和45W重组蛋白的包涵体复性产物，免

疫原性仍然良好，提示45W的抗原决定簇可能呈线性。以上研究为45W多肤疫苗的

研究奠定了基础，然而并未见以45W为基础构建的多肤疫苗的报道，更多的是用肥

头绦虫(Taenia.cr口lsicePs)保护性多肤构建抗猪囊尾坳的多肤疫苗。

Toledo等[5s]根据肥头带绦虫的KETc7抗原合成了三个线性多肤GK一l，GK一2和GK一3，其中GK 一1(GYYYPSDPN吓Y ApPYSA)能诱导对鼠巨颈绦虫40·71%的保护。

此外，免疫荧光显示抗GK一1抗体可与猪带绦虫虫卵、六钩坳、囊虫和绦虫发生强烈

反应，提示该多肤可作为猪囊虫疫苗候选抗原。进一步研究证明，GK一1至少有一个

T细胞表位.并能刺激产生细胞因子。Toledo等〔56](2001)合成2个表位肤:KETcl (ApMsTpsATsVRo)和KETelZ(GNLLLSCLG)，免疫接种小鼠KETel和KETelZ分

别诱导出66.7一100%和52.7%一88.1%的抗囊虫病的保护力。免疫应答反应表明这2种

肤都至少含有一个B细胞表位和一个T细胞表位，高水平的细胞因子提示它们也许

都参与THI反应，3个保护性表位在猪带绦虫不同发育阶段均有表达，而且被证明能

作为疫苗抵抗猪带绦虫感染。由此认为他们能作为抗囊虫病多肤疫苗的候选肤。Hue

rta等l，7]合成3种多肤疫苗GKI、陇Tel和KetelZ，选择2个乡村农户家中240头猪

进行试验，试验前该地区猪囊虫的自然感染率为14%。10一12月后剖检结果显示:12

0头免疫猪共检出804个活囊虫，而对照猪检出63951个活囊虫，免疫组减囊率达9

8.7%，感染率下降了52.6%。这一结果验证了三种多肤疫苗的免疫保护效果，大大

增强了研究抗囊虫多肤疫苗的信心。

Manouteh丽an等[，8]2004年首次将三肤(旺Tcl，KET。12，GKI)和重组抗原KETe

7在丝状噬菌体(M13)表面表达，构建抗囊虫噬菌体疫苗(CPhV)，经皮下或口服免疫

猪后可产生特异性的细胞免疫反应，其减囊率分别为88.86%(244。5/275.2)和97.09%

(267.2反75.2)。随后，2005年Morales等I，9]将三肤(FK7，F以l和F既TclZ)与噬菌

体蛋白(M13cPVlll)融合表达构建抗囊虫病的口服三肤疫苗(s3Pvac)，田间试验结

果显示，与对照组相比免疫组的减囊率为87%，其舌检减囊率为70%。该疫苗有很

好免疫保护效果，其口服免疫也更容易在生产中推广。有研究者还希望能通过与布氏

杆菌的2，4一二氧四氢蝶睫合酶(Brueellas即.lumazinesynthase，BLS一KETel)偶联，

提高KETcl的免疫原性(Cruz一Revilla2006)[601。

有学者根据Eg95基因序列合成了25个Eg95多肚，每个多肤含有14个氨基酸，

同时在其氨基端有生物素标记(生物素一SGSG一EG95多肤)，相邻多肤有8个氨基酸

残基相同。通过ELISA筛选，发现抗EG95血清可识别P12/13、PZI/22、P24和P6

四条多肚。将以上多肤与与白喉类毒素(diPhtheriatoxnid，DT)偶联成为DT偶联肤

后进行动物实验，结果表明这些多肤都可以诱导出特异性抗体，但是并不能形成保护

力，也不能杀伤Eg六钩坳[6l，62]。这一研究提示了具有免疫原性的Eg95疫苗需要具

有一定的构象。该学者又研究了Eg95三段多肤(1一70，51一106和89一153)的GST

9融合表达产物，动物实验表明融合多肤几乎没有免疫保护效果，而且其抗血清对六钩

坳也没有杀伤作用。因此认为Eg95抗原的免疫反应取决于其特定抗原表位及恰当的

空间构象，而并不是线性的抗原表位[63l。最近，考虑到空间构象对Eg95抗原表位的

影响，Read等用Eg95抗体筛选噬菌体随机多肤文库，筛选的出20个多肤，除E14

外其它多肤与Eg95并没有序列同源性，筛选结果同时提示Eg95分子上有至少四个

构象依赖性抗原表位。其中的E100经Eg95抗血清纯化后，可以与重组或天然的Eg

95抗原反应，并能产生补体依赖性六钩坳杀伤作用。基于以上研究，作者认为E100

可成为Eg95多肤疫苗的研究的一个基础!641。

Guo等165]用毕赤酵母表达的糖基化TSOL18抗原免疫小鼠后，通过细胞瘤杂交技

术制备了TSOL18的鼠源单克隆抗体，并用该单抗筛选TSOL18的噬菌体肤库中与之

反应的模拟肤。结果筛选出的ETTKLQRFQAML和DHTXF两个多肤与TsoL18的

序列并无相似性，由此认为其为TSOL18的表位肤，可以用于后继的多肤疫苗的研究

和疾病的诊断。

2.3核酸疫苗

核酸疫苗又称DNA疫苗，是将外源基因插入真核表达载体中，构建重组质粒注

入动物而使其获得免疫的一种新型疫苗。绦虫坳病的抗原基因的研究是开发核酸疫苗

的前提和基础，因此，在发现抗原基因后相应核酸疫苗的报道比比皆是。

Rothel等1661早在1997年就对To45w的核酸疫苗进行了研究，发现对提前注射

过45w重组疫苗的羊只，免疫45w核酸疫苗后，其抗体水平显著升高，尤其是IgG

l亚群;再用45W重组疫苗免疫后其并IgGI水平并无显著的变化，而lgGZ水平则呈

10倍的增加。nrew等167]构建了羊带绦虫的To45w、Tols、Tol6的侧A疫苗，对

其进行了初步研究。经免疫印迹分析三种疫苗转染Cos一7细胞后分别产生了相应的抗

原;免疫小鼠后可产生特异性的抗体，而免疫羊后仅有45W能产生低滴度的抗体。

随后，Drew等168}又分别用羊绦虫45w的DNA和基因的不同截断形式构建了PcDN

A3一45w，peDNA3一K45w，PcDNA3一K以sw三种DNA疫苗，并转染细胞观察其免疫活

性。Cos一7细胞产生了完整的高度糖基化的40一65kDa的45W抗原，而经衣霉素(tun

icamycin)处理后仅表达28kDa的45W蛋白。在小鼠体内，无论基因是否含有内含

子，通过肌肉注射或基因枪导入的方法，三种DNA疫苗都产生相同的高滴度的抗体;

免疫羊也可产生的抗体但是滴度较低。与重组45W蛋白相比DNA疫苗产生的抗体特

异性更好;然而DNA免疫产生的抗体不与线性多肤反应，提示DNA免疫产生的主要是构象特异性抗体。Drew等[691还研究了k45w、k45wsec和k45WTR(膜结合型、

分泌性和非分泌性)三种形式的DNA疫苗的抗体应答水平。结果显示表达分泌型45

W的DNA免疫较膜结合型产生的抗体滴度高3倍，而比非分泌型高18倍。这一结

果表明肌肉注射45w基因疫苗的免疫需要抗原的活性分泌。王雪梅等I70，川成功构建

了peDNA3.1汀5045一4B重组质粒，免疫小鼠后使其在体内表达，免疫组化染色结果

显示注射部位肌肉表达了该质粒。

scheerlinck等1721研究了Eg95核酸疫苗的免疫效果。先用编码Eg95的质粒DNA

肌肉注射免疫羊1次，再用Eg95重组蛋白加强免疫，一周后便可检测到高水平的Ig

G抗体，而重组蛋白免疫组在两周后才检测到相同水平的抗体;当用Eg95核酸疫苗

免疫羊2次，再用Eg95重组蛋白加强免疫后可诱导高水平的IgGI抗体;而重组蛋白

免疫组则是可以检测到高水平的Igq抗体;当用编码Eg95与GM一CSF的DNA共同

免疫羊可提高IgG抗体水平，但用编码Eg95和IFN一Y或IL一4的DNA共同免疫则降

低IgG抗体水平，提示细胞因子可调节DNA疫苗诱导的免疫反应。林仁勇等[73一75]

将402bP的Eg95基因克隆入peDNA3.1，构建Eg95抗原基因DNA疫苗印cDNA3一E

995)。用100拌g疫苗间隔两周肌肉注射小鼠五次，在免疫后第4周IgG、lgGZa就开

始升高，并可持续到第10周;免疫小鼠脾T淋巴细胞经Eg95抗原刺激后增殖明显。

以上结果提示peDNA3一Eg95疫苗可诱发小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。

丁剑冰等176]用采用肌肉、静脉、‘皮下三种免疫注射途径和不同剂量的peDNA3一Egg

5重组质粒免疫小鼠，用ELISA测定小鼠的抗体滴度。结果同一剂量下，刺激机体产

生抗体反应强度的免疫途径依次为肌肉、皮下和静脉注射，阳性反应率由高到低依次

为皮下、肌肉和静脉注射。其中，以肌肉注射免疫小鼠的抗体反应维持时间较长，且

主要产生lgGZa为主的抗体。由此认为肌肉注射可作为免疫peDNA3一Eg95的最佳途

径。

国内的学者构建了TsoL18的真核表达载体[77l，并对其免疫原性和安全性进行

了研究178，791。构建成功的重组真核质粒pvAxl/TsoL18转染至BHK一21细胞后，用

免疫荧光实验可在转染细胞看到特异荧光，免疫印迹在18kDa处出现了阳性条带，

表明重组质粒表达了TSOL18蛋白，且表达的蛋白能被猪囊尾蝴病阳性血清所识别。

免疫动物后能有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，而且安全性也较好。3疫苗研究展望绦虫蝴病作为绦虫疾病中最主要的部分，科研人员进行了半个多世纪的研究，虽

研制成功的疫苗很多，其中也不乏免疫保护好的疫苗，但是真正用到生产中的屈指可

数。究其原因可能有以下几点:首先，免疫疫苗所能带来的直观的经济效益不大，不

能引起畜主的关注，因此关系到公共卫生的绦虫坳病免疫的经费来源有限，养殖畜主

的免疫积极性不高，导致流行地区的免疫率并不高。其次，与传统细菌病和病毒病疫

苗的生产相比较，动物绦虫坳病疫苗的规模化生产过程更为复杂，需要的技术要求更

高，而开发出来的适用于商业生产的疫苗不多。此外，绦虫坳病的疫苗多为单价苗，

抗原成分单一，很少多联或混合疫苗，一定程度上缩小了应用的范围。

绦虫坳病的疫苗作为防治绦虫坳病的有力武器，开发价格低廉，副作用小，免疫

效果好的绦虫坳疫苗仍是研究研究者的主要任务。随着对已知抗原的免疫原性和抗原

表位的深入的研究，以及对绦虫坳病的免疫学机理的进一步阐明，相信不久将有绦虫

坳病的基因工程多价疫苗或多联疫苗用于生产，从而达到用一种疫苗预防多种绦虫坳

病的目标。

4本试验的目的意义

脑包虫病是牧区的羔羊死亡的主要原因之一。而对于该病的治疗通常是长期投

服大剂量的驱虫药或是手术摘除包囊，两种方法的治疗成本都比较高，后者对操作

技能有一定的要求，因而生产中病畜大多淘汰处理。作为终末宿主的犬，在传播这

种疾病上起了十分重要的作用。牧区特有的生产模式，传统的生活习惯及风俗习惯

不可能对犬及时驱虫，并处理犬粪，从而无法从根本上消除传染源。因此，免疫接

种就成了一种确实可行的防控方法。目前有关动物脑包虫病的免疫防治，尚无研究

报道。本研究从脑包虫的患羊脑部采取脑多头拗，感染犬后收集节片孵化虫卵得到

六钩蝴，提取其总RNA，用特异性引物扩增多头带绦虫的Tmls抗原基因，将获得

的基因进行克隆后测序，并与已报道的同源基因进行基因序列比较分析，确定基因

的正确。随后，构建多头带绦虫的Tmls抗原基因的原核表达载体并进行表达，并验

证表达产物的免疫原性，为研究该抗原的生理功能和家畜的多头带绦虫的疫苗奠定

基础。第二章多头带绦虫Tmls抗原基因的克隆和原核表达

多头带绦虫(TaeniamultiPle)的中绦期幼虫(脑多头坳Coenurusce“rebralis)

寄生于绵羊、山羊、黄牛、耗牛和骆驼等有蹄动物的脑、脊髓内，引起脑及中枢神经

系统的功能障碍，称为脑包虫病。脑包虫的感染常常是致命的，也是牧区羔羊死亡的

主要原因之一。此外，脑包虫也是一种动物源性人兽共患寄生虫病180，8’]。

目前我国家畜的脑包虫病的治疗常采用两种方法:药物治疗和手术疗法。药物疗

法比较保守，效果常不稳定;而手术疗法效果虽好，但仅适用于脑表层的包囊182]。为

切实际有效地搞好家畜脑包虫病的防治，进行脑包虫疫苗的开发就显得十分必要。早

期进行疫苗研究的抗原有脑包虫的囊液抗原、囊壁抗原、六钩坳抗原、六钩坳排泄/

分泌抗原等，其对脑包虫的免疫预防都有一定的效果17，83，84]。但是由于受抗原来源的

限制，使其很难推广应用。随着分子生物学技术的发展，带科绦虫的基因工程疫苗研

究取得了很大的进展，羊带绦虫(Taeniaovis)、猪带绦虫(Taenia:olium)、牛带

绦虫(Taeniasaginata)和细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)基因工程疫苗均

己研究成功185]，而多头带绦虫的基因工程疫苗研究才刚刚起步。