分子生物学实验思考题答案

分子生物学实验思考题答案

实验一、基因组DNA的提取

1、为什么构建DNA文库时,一定要用大分子DNA?

答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小与片段的大小,片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作与文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段、

2、如何检测与保证DNA的质量？

答、用凝胶电泳瞧,有没有质白质与RNA等物质的污染,还可以测OD,用OD260/280来判断, 当OD260/OD280< 1、8,表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> 2、0,表示RNA 含量较高当OD260/OD280=1、8～2、0,表示DNA较纯。

实验二、植物总RNA的提取

1、RNA酶的变性与失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？

答、有DEPC,Trizol,氧钒核糖核苷复合物,RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS,尿素,硅藻土等;在总RNA提取中用PEPC,Trizol

2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离与纯化。

答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物,根据碱基互补配对原则,可将mRNA从总RNA中分离出来

实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备

1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？

答、A)细菌的生长状态:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0、5时,细胞密度在5×107 个/mL左右,这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

B)所有操作均应在无菌条件与冰上进行;实验操作时要格外小心,悬浮细胞时要轻柔,以免造成菌体破裂,影响转化。

C)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这就是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);

D) 化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其她二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍);

E)所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;

2、感受态细胞制备可用在哪些研究与应用领域？

答、在基因工程中将质粒导入受体细胞就是如果受体细胞就是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。

实验五、质粒在大肠杆菌中的转化与鉴定

1、在热激以后进行活化培养,这时的培养基中为什么不加入抗生素？

答、活化培养用的一般就是SOC培养基,这种培养基比LB培养基营养,此时进行的活化培养只就是为了让大肠杆菌迅速复苏,恢复分裂活性,此时的细胞还不具抗性,加入抗生素会细胞会死亡。

2、什么就是质粒？根据在细菌中的复制,质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？

答、质粒就是细菌体内的环状DNA分子。

质粒也就是作为细菌遗传载体的一部分,但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如,抗性基因,荧光蛋白基因等等。

根据质粒随细胞分裂而分裂的次数,将其分为两类:一类就是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1～2个质粒;另一类就是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒。

常用于基因重组的质粒就是pBR322质粒,因为其基因测序已经完成,而且它携带了两个标记基因,一个就是氨苄青霉素抗性基因Apr,另一个就是四环素抗性基因Tetr。

实验六、质粒DNA的分离纯化与鉴定

1、在实验过程中,加入的EDTA、SDS分别起什么作用?

答、EDTA可以结合DNA酶等,可以抑制其活性;SDS主要就是裂解细菌与沉淀蛋白。

2、乙酸钾在实验过程中主要起什么作用?

答、主要就是在分离过程中起着中与PH的作用,DNA经碱(NaoH)裂解后,染色体DNA氢键断裂,双螺旋解开,质粒DNA氢键断裂,互补链不能完全分离,再经乙酸钾中与成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。

3、氯仿在核酸的提取过程中有何作用？

答、克服酚的特点,加速有机层与液相的分层。最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中迹量酚。

4、本实验整个过程中应该注意些什么？

答、1、提取过程应尽量保持低温;

2、提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要,采用酚、氯仿去除蛋白质要比单独用酚或者氯仿要好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。

3、沉淀DNA一般使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可以使沉淀完全。沉淀DNA 也可以使用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀,所以多数还就是用乙醇。

实验七、聚合酶链式反应——一般原理与技术

1、降低退火温度对反应有何影响？

答、变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。双链 DNA 中的 G+C 的比率越高,则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度相关,DNA 分子越长,在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短,则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性,当PCR 循环中的反应温度降低时,部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA,从而导致 PCR 的失败。非特异性条带数增多。

2、PCR 循环次数就是否越多越好？为何?

答、循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

3、PCR技术可应用与哪些方面？举例。

答、1、核酸的基础研究:基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序

3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA

5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控

6、cDNA末端快速扩增技术

7、检测基因的表达

8、医学应用:检测细菌、病毒类疾病;诊断遗传疾病;诊断肿瘤;应用于法医物证学

实验八、DNA的限制性内切酶酶切与鉴定

1、写出ECORI与Hind3两种内切酶消化产物的末端序列。

答、G^AATTC EcoRI的识别序列与切割位点,粘性末端即:AATTC- CTTAA^G G- HindⅢ的识别序列为:A^AGCTT “^”为切割位点,黏性末端为:AGCTT- A-

2、什么就是粘性末端与平末端？

答、用限制酶切割后得到的末端齐平就就是平末端,一长一短就就是粘性末端

3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？

答、用同种限制酶对含目的基因的DNA分子与运载体(如:质粒)进行切割,产生同种黏性末端(核苷酸序列),从而进行重组(加DNA连接酶),以导入目的基因。