真菌基因(簇)的沉默及其激活机理

食品微生物课程论文

题目真菌基因（簇）的沉默及其激活机理

姓名费鹏学号2013309010006 专业食品科学评分

指导教师陈福生职称教授

中国·武汉

二○一三年十二月

真菌基因（簇）的沉默及其激活机理

摘要：真菌一直是人类获得各种抗生素、氨基酸、天然活性成分等的宝贵资源和天然加工厂。自从1986年Peerbolte发现基因沉默现象以来，如何利用真菌基因（簇）的沉默与激活一直是人们研究的热点。对真菌基因（簇）的沉默及其激活机理的深入研究不仅丰富和推动了真核生物表观遗传学的内容和发展，也极大地促进了真菌系统进化的研究和转基因沉默和激活问题的解决。本文介绍了真菌基因（簇）的沉默现象和机理，同时也对其激活方法与机理进行了综述。

关键词：真菌；基因沉默；基因激活

Abstract: Fungus has always been the precious resources and nature factory of various antibiotics, amino acids, natural active ingredients and so on for humans. Taking advantage of the fungus gene silencing and activation has attracted worldwide view since Peerbolte discovered gene silence in 1986. The in-depth study of the mechanism of fungus gene silencing and activation not only enriches and promotes epigenetics of eucaryon, but also greatly promotes the phylogenetic study of fungi and the research of taking advantage of the gene silencing and activation. This paper introduced the phenomenon and mechanism of fungus gene silencing and activation.

Keywords: fungus; gene silencing; gene activation

基因沉默(gene silencing) 是指生物体中特定基因由于种种原因不表达[1]，是生物细胞基因表达调节的一种重要手段。这种现象是Peerbolte 在1986 年首先在转基因植物中发现的，他发现导入并整合进受体基因组中的外源基因在当代转化体或其后代中表达受抑制[2]。后来，人们在线虫、真菌、昆虫、原生动物、果蝇、斑马鱼及老鼠中也陆续发现了基因沉默现象。

基因沉默一般发生在2种水平上，即：转录水平的基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)和转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)[3]。两者统称为同源依赖型基因沉默(homology dependent gene silencing，HDGS)，是指外源基因进入宿主细胞而不能正常表达的现象。TGS一般只发生

于外源基因转录的起始和终止，是由于DNA修饰染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS发生在转录后，外源基因能够转录但无法翻译出产物蛋白，而且外源基因和内源基因通常一起沉默。

发生沉默的基因可以是外源性转移基因，也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。研究发现，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等均与基因沉默有关，双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)作为启动因素或中间体为不同生物基因沉默所共有[3]。

1.转录水平的基因沉默

转录水平的基因沉默是DNA水平上的，主要是由于基因启动子甲基化、异染色质化及位置效应等造成DNA无法被转录成RNA，故表达受抑制。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一[4]，是最早发现的DNA修饰途径之一，也是造成TGS最主要的原因。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，使DNA失去核酶限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methylation transferase, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl methionine，SAM )为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程[5]。真核生物基因组中存在广泛的甲基化，CpG 二核苷酸是最主要是甲基化位点，它在基因组中广泛存在但呈不均匀分布，在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，长度为300～3000 bp，这些区段被称作“CpG岛”。“CpG岛”主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有“CpG”岛。“CpG”岛上的5’-胞嘧啶易被甲基化转变为5’-甲基胞嘧啶(5’-methylcytosine，5mC)。

真菌DNA甲基化位置与植物相同而与哺乳动物不同。在哺乳动物中，除位于第一外显子区域的CpG岛外，基因组中约75%的CpG二核苷酸被甲基化，其编码序列也常发生甲基化[6]。真菌和基因组的甲基化主要发生在转座子和其他重复序列，大部分基因组并不存在甲基化，包括CpG 二核苷酸。

目前已知甲基化影响基因表达的机制包括以下几种作用：

①直接作用: 甲基化直接干扰特异转录因子与启动子上识别位点的结合。转录因子AP2、Cmyc/Cmyn、CREB、E2F、NF2KB均可识别含有CpG残基的序列，每种转录因子与相应位点的结合都可由于甲基化而受到抑制，使基因转录终止。

②间接作用：基因5’端调控序列甲基化后与细胞核内甲基化CG序列结合蛋白结合，阻止了转录因子与基因形成转录复合物。

③染色质结构改变：具有转录活性的DNA 在甲基化后与甲基化CpG结合域( methyl-CpG binding domain，MBD )蛋白(如MBD2、MeCP2) 结合，而该蛋白所连接的组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)1和2使组蛋白脱乙酰化，导致染色质结构变化而使转录抑制。

1.2重复序列诱导的点突变(repeat-induced point mutation, RIP)

RIP是真菌特有的一个有效检查重复序列并使之发生突变的过程，由Selker 等[7]于1986年在脉孢菌中发现。与动植物中的重复序列诱导的基因沉默(repeat-induced gene silencing, RIGS)相类似，外源基因如果以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复(direct repeat ) 或头对头、尾对尾的反向重复( inverted repeat )，则不能表达。而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互配对还可以导致自身的异染色质化。其机理可能是异染色质化相关蛋白质识别重复序列间配对形成的拓扑结构与之结合，并将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序列局部异染色质化。

Selker等[7]用脉孢菌染色体的ζ-η区(ζ和η分别为5SRNA的基因，二者序列高度相似且位于同一染色体上)研究DNA序列对DNA甲基化的诱导作用，结果发现在脉孢菌生活史的有性阶段，二个不同交配型的单核菌丝融合后，在核融合前，二个不同交配型的核处于同一原生质中时，重复序列很不稳定，尤其是前后连锁的重复序列容易缺失或发生新始甲基化(denovomethylation)，而不连锁的重复序列发生修饰的几率相对低些。相反，单拷贝序列在整个生活史都是稳定的。重复序列的变化是由于其中的GpC 发生转换突变成为ApT [7]。

全基因组分析表明，粗糙脉孢菌基因组的甲基化绝大多数与RIP 有关，在发生RIP 的序列中，80% 以上的胞嘧啶被甲基化。触发RIP 的二个重复序列既可以位于不同染色体上，也可以位于同一条染色体上，当二个重复序列的长度超过约400 bp (或不连锁的重复序列超过约1 kb)、相似性大于80%，即可发生RIP[8]。但在脉孢菌中也存在一些不发生RIP的重复基因，如绝大多数rRNA和tRNA基因的序列[9]。通过RIP，脉孢菌序列中约30%的GpC对突变成为ApT对，其主要发生在CpA二核苷酸，使CpA转换成为TpA，从而形成富TpA 片段。RIP 突变的序列在营养细胞中常常引起DNA甲基化导致基因沉默，有时这种甲基化不仅包括重复序列自身，还会延伸至重复序列之外。

除脉孢菌中外，在其他真菌中也先后发现有RIP，如子囊菌鹅柄孢壳菌(Podospora anserina)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、子囊菌中的无性态真菌曲霉(Aspergillus)[10]包括米曲霉(A. oryzae)、黑曲霉(A. niger )、构巢曲霉(A. nidulans)和烟曲霉(A. fumigatus )以及产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和谷类炭疽病菌(Colletotrichum cereale)[11,12]等、担子菌花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)。与粗糙脉孢菌相比，其他真菌的RIP比较温和，许多重复序列具有活性或即使没有活性也很少发生突变，如黑曲霉RIP仅限于使少数转座子序列的开放阅读框中止，而产黄青霉中受RIP影响的序列则较多[13]。进一步研究发现，RIP需要一个RIP缺陷型(RIP defective) 基因，该基因编码一个甲基转移酶RID，其首先将C 甲基化，随后在某种酶促作用下脱氨基生成Ｔ[14]。

1.3 减数分裂前诱导的甲基化(methylation induced premeiotically, MIP)

在脉孢菌中发现RIP 后不久，Goyon等[15]和Faugeron 等[16]又相继在粪盘菌(A. immersus )中发现一种与RIP相似但又有明显差异的基因沉默机制MIP。将含有met2基因(编码高丝氨酸O-转乙酰酶)的质粒在met2基因内部切开成为线性双链DNA，再转入粪盘菌中，70%转化子的met2基因位点处整合有1至多个转入的DNA，在met2基因区域形成前后相连的重复序列，重复序列之间由质粒DNA分隔。Met+转化子的杂交后代中这些重复序列中的胞嘧啶在有性阶段的减数分裂前常常发生甲基化并导致整合的met2基因失活。异位的重复基因约有50%失活，而大于90%的前后位重复基因发生失活。即使是将构巢曲霉的amdS 基因(编码乙酰胺酶)转入粪盘菌中产生含有1~3个外源amdS基因(在染色体上异

位整合)的转化子之间的杂交后代中，同样在减数分裂前每个异位的amdS基因被失活。与RIP不同的是，失活的基因序列仅发生了胞嘧啶的甲基化而没有点突变，甲基化也不会波及邻近序列，在随后的DNA复制过程中甲基化并不能严格地被维持，经过连续的有丝分裂失活基因能够恢复活性。

除粪盘菌属外，目前已在多个属的真菌中发现有MIP，如子囊菌中的酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、赤霉属(Gibberella)、孢壳菌属(Podospora)、粪壳菌属(Sordaria)、黑粉菌属(Ustilago)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、曲霉属(Aspergillus)和Magnaporthe，担子菌中的裂褶菌属(Schizophyllum )、鬼伞菌属(Coprinus )等[17]。粪盘菌中MIP 导致的甲基化与脉孢菌中由RIP 引起的甲基化相似，重复序列都可能被甲基化，尤其是CpG二核甘酸。但在灰盖鬼伞(Coprinus cinereus) 中DNA甲基化主要集中于CpG二核甘酸，且甲基化程度很低[18]。

1.4位置效应

位置效应是指基因在基组中的位置对其表达的影响。当外源基网整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻DNA的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平失活。如果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域，转基因通常会融入该区域的染色质结构，使转染基因进进行低水平的转录，或使转染基因发生异染色质化而导致转染基因沉默。

1.5 同源基因间的反式失活

这种方式是由于同源序列的沉默位点和其它位点的DNA相互作用而致外源基因沉默。顺式作用引起甲基化而失活的外源基因能作为“沉默因子”，对与之分离的同源靶基因施加反式作用，使同源序列的靶基因甲基化而失活。反式失活主要是基因启动子间同源序列相互作用而引起，该区域只要有90bp的序列源，就可导致两个基因间发生反式失活。

1.6 后生修饰作用

后生修饰作用(epigenetic effected)是指转染基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转染基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除的。

2.转录后水平的基因沉默

转录后水平的基因沉默是RNA水平基因调控的结果，比转录水平的基因沉默更普遍，到目前为止在真菌、拟南芥线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马小鼠等真核生物中都发现存在这一基因沉默机制，PTGS特点是外源基因能够转录成mRNA，但在细胞质中却无相应稳定态mRNA存在的，即正常的mRNA不能积累，mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，从而失去功能。转录后基因沉默与转录基因沉默不同，它具有逆转性，即受抑基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂的不可遗传性。

在真菌中已发现的RNA 沉默现象有基因压制(quelling)、非配对DNA介导的减数分裂沉默(meiotic silencing by unpaired DNA，MSUD)及其他RNA 沉默机制。

2.1 基因压制

TGS发生于转录的起始和终止，是由于DNA 修饰染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录，一般只有外源基因发生沉默；而在PTGS中，沉默发生在转录后，外源基因能够正常或高速率转录成mRNA，但转录的mRNA 在细胞质内积累水平很低或根本检测不到，通常是外源基因和内源基因一起沉默，在植物、动物及真菌上普遍发生，分别称为共抑制、RNAi和基因压制作用，导致的基因沉默是生物体内最普遍的一种转录后水平的基因沉默。

基因压制现象是1992年Romano等[19]在粗糙脉孢菌中首先发现的，其发生在脉孢菌生活史的营养阶段，是由DNA 序列的同源性引发的转录后基因沉默，其与植物的共抑制相似，对转入的外源基因和内源基因都有影响[20]。所不同的是，异核体的脉孢菌一个核中重复序列引发的基因沉默还能够导致另一核中相同基因的沉默，并同时发生有DNA甲基化，尽管DNA甲基化并不是压制所必须的，该现象表明压制过程存在有一反式作用信号。对粗糙脉孢菌一系列压制缺陷型突变株的研究发现，压制过程有小的干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)、压制缺陷-1蛋白(quelling deficient-1，QDE-1)、一种RNA依赖的RNA多聚酶(RDRP)和QDE-2 (Argonaute)、DCL-2 (Dicer)[21]参与，但没有发现有miRNA （MicroRNAs）参与。因此，基因压制的机制可能是RNA干涉引起的基因沉默。

RNA干涉与基因沉默现象的关系，最初是在对植物和线虫的研究中发现的。

1990年，Jorgensen等[22]设想由一强有力启动子控制的基因pigment-produing导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果出其预料不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。不仅没有新的基因表达反而原有的基因表达也受到了抑制，因此称这种现象为共抑制(cosupression)现象。1995年，Guo等[23]在利用反义RNA和正义RNA干预秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中的par-1基因表达时，意外地发现了两者同样地抑制了par-1基因的表达；1998年，Fire等[24]研究发现，正义RNA与反义RNA对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA被微量的dsRNA污染所致，并将动物体内的这种现象称之为RNAi。

基因压制的机制现在还尚未清楚，但人们对此提出了3种模型：

2.1.1 RNA 阈值模型

在转基因实验中，为了实现外源基因在受体细胞中的高效表达，人们往往给外源基因带上强启动子，但事实上却常常导致基因沉默。于是Lindbo等提出了RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA 的监控系统，当某种mRNA 超量表达以后，监控系统就起作用，将这种超量表达的mRNA 降解。然而人们随后发现某些不带有启动子的基因转入细胞后同样也能引起PTGS现象，其作用效果与带有启动子的序列相近。V oinnet[25]等在研究PTGS在植物中的传递时发现，带有和不带有35S启动子的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP) 基因都能引起沉默，不带有启动子的GFP基因在植物体中不能转录出RNA，却能引起沉默，可见沉默并不一定都是外源基因的过量表达、转录产物的过量积累造成的。

2.2.2 异位配对和异常RNA模型

该模型认为PTGS现象是生物在长期进化过程中形成的对病毒侵染的一种反应，与基因的表达产物是否过量无关. 当病毒或转入的外源基因内部有同源序列，或外源基因与内源基因之间有同源序列时，往往会导致异位配对( Ectopic paining)，其结果是转录产生异常RNA (Aberrant RNA，aRNA)，由于aRNA内部的重复序列，它可能是双链的。

另外，除异位配对外，aRNA产生的原因还可能是外源基因中存在异常结构，如隐秘的旁侧启动子(Cryptic flanking promoter)或提前终止末端(Premature termination)。aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚

合酶( RNA-depended RNA polymerase，RdRps) 的活性，RdRps再以aRNA为模板合成大量约20～25bp互补RNA (complementary RNA，cRNA)。这些cRNA 如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分dsRNA，而后被双链特异性RNase识别、降解。在这一过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA 结合，并被同时降解。外源基因的导入最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，这种现象就是植物中的共抑制。由于PGTS信号在细胞间传递在转录产物未被降解前就能检测到，所以也有人认为aRNA一方面激活RdRps，另一方面则开始在细胞之中传递。然而在生物中也发现，PTGS现象不能传递，Palauqui和Balzergue认为，PTGS信号能否传递依赖于转入基因的量。如果转入基因越大，信号就能传递到生物中更多的地方，这些信号分子又能启动新的沉默，产生新的信号分子，于是能使整个生物产生免疫反应。

最近，许多实验为这一模型提供了证据[18]。Hamilton等在4种发生PTGS 现象的植物中分别分离到了一种25bp左右的反义RNA，这些RNA很可能就是cRNA，而且由于25bp的大小足以传递一定的信息，又可能通过胞间连丝在细胞之间传递，所以认为它很可能是细胞间传递信号的一部分。

另外，与PTGS有关的蛋白质的发现为异常RNA模型提供了部分证据，然而，也有实验表明如果将单拷贝的外源基因转入同源基因的单倍体植物中以后，也会导致PTGS现象。这表明，同源序列之间的异位配对，也不是导致PTGS现象的唯一原因。

2.2.3 dsRNA模型

关于PTGS 的启动，Waterhouse (1998)提出了dsRNA模型[19]。他们将正义RNA和反义RNA导入生物体后，发现正义RNA与反义RNA共转录比二者单独作用更容易引起沉默。于是他们认为异位配对并不是导致PTGS的根本原因，根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同，这导致正义RNA和反义RNA的合成。这些转录产物将形成dsRNA，进而导致基因沉默，具体可分为3个阶段：

①dsRNA的形成阶段：外源DNA，RNA序列均可引起细胞产生相应的dsRNA，但产生的方式不同，即RNA病毒在RdRPs合成其互补链并且与之形成dsRNA；DNA病毒重组基因转基因等DNA序列在细胞转录出RNA后经RdRPs

形成dsRNA转座子由于其本身具有反向重复序列，细胞可以通过它直接产生dsRNA。正义和反义RNA的同时转录也可以产生。

②siRNA的形成阶段：细胞中的dsRNA扩增到一定量时会被一种特异的核酶Dicer (一种具有RNase Ⅲ样活性的核酶，它含有解旋酶活性及dsRNA结合结构域和PAZ结构域)识别并与之形成酶复合体，在其作用下单链靶RNA会与dsRNA的正义链发生链交换，mRNA处在原先正义链的位置。在ATP的参与下，RNA诱导复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)利用结合在其上的核酸内切酶切割靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域形成了21-23 nt的siRNA，其切割位点是特异性的一般为尿嘧啶处。每个siRNA分子包括21-23 bp 的互补双链及两侧3’末端的2 nt突出端，其5’磷酸基团会被一种特殊的激酶所保护起来而其3’端的羟基是参与RdRPd反应所必需的。

③RNAi的形成阶段：细胞中RNA在RdRPd酶的催化下以siRNA为引物，以目的mRNA为模板合成大量的dsRNA。这些新合成的dsRNA又作为RISC的底物被降解为新的siRNA，其可以进入上述循环使得信号放大（这种模式在蠕虫中得以证实，被称为“随机降解RNA的扩增模式”）。dsRNA还可自身为模板合成新的dsRNA，但这种dsRNA很快就被降解掉了。除此以外siRNA可以在RdRPs 酶的催化下进行自我复制，所以很少的dsRNA就可产生很大的效应。因此新的dsRNA反复合成和降解不断产生新的siRNA可以最终导致目的基因沉默实现RNAi效应。

2.2非配对DNA介导的减数分裂沉默

1996年Aramayo等[27]在研究粗糙脉孢菌Asm-1基因的减数分裂转位时发现脉孢菌中存在另一种基因沉默机制—非配对DNA介导的减数分裂沉默(meiotic silencing by unpaired DNA, MSUD)。MSUD发生在脉孢菌二个交配型不同的单核体融合形成的受精卵中，受精卵在减数分裂时先进行同源染色体的配对，那些来自一个亲本的染色体上的基因由于来自另一亲本的同源染色体相同位置的等位基因缺失而不能配对，其在减数分裂后产生的个体中就不能表达。这种现象同样会发生在转入的外源成对基因中。MSUD 的分子机制与RNAi相似，同样有与QDE-1相似的RDRPS和一反式作用信号参与，另外还涉及两个基因：减数分裂沉默抑制因子-2 (suppressor of meiotic silencing-2，Sms-2)和减数分裂抑制因子

-3(suppressor of meiotic silencing-3，Sms-3)，Sms-2和Sms-3分别编码另一套与压制过程类似的酶QDE-2和DCL-1 (Dicer)。

2.3 其它

在许多子囊菌、担子菌和接合菌中转入dsRNA 表达质粒或相关系统，也能和卵菌一样产生基因表达抑制[28]。在构巢曲霉、稻瘟病菌、裂殖酵母和粗糙脉孢菌中同样发现有siRNA[29]。另外，在粟酒裂殖酵母中发现了由染色质重塑引起的转录沉默，而粗糙脉孢菌中也存在染色质重塑且独立于其他RNA沉默机制。

3.沉默基因的激活

基因沉默是整个生命界在进化上的一种保守的自我保护机制，有人称之为“基因组的免疫系统”，它可以保护生物体的基因组免受外源基因分子的袭击，比如对抗病毒基因的感染等；同时，它还负责细胞内异常RNA的清除及参与发育调控等生命过程。但在人类生命科学的发展过程中，为满足实际需求，需要使得沉默基因能够表达，就需要激活沉默基因，如抗生素生产、抗肿瘤药物生产等。自1929年Fleming发现第一个抗生素青霉素以来，抗生素类一直是人们最渴求的微生物代谢物，在抗感染，尤其是抗严重感染的治疗中发挥了卓越的作用。至今，各国学者仍不断致力于筛选新抗生素。绝大多数抗生素，如链霉素、卡那霉素与妥布霉素等氨基糖苷类，四环素类，红霉素与吉它霉素等大环内酯类, 均由土壤筛选途径得到。时至今日，这仍然还是筛选新抗生素或新活性物质( 如酶抑制剂和免疫抑制剂)的主要途径，但随机筛选发现新药的几率愈来愈低，通常需筛选一万株菌以上，因而人们不断地改进和建立新的筛选模型和方法。Hopwood[30]于20世纪80年代初提出通过基因克隆、诱变处理、菌株或种间自然接合、原生质体融合等方法可以激活沉默基因，从而有了一条获取新抗生素和新活性产物的新途径。

3.1 DNA去甲基化

DNA甲基化在维持细胞分化的高度稳定性及在调控基因转录中具有重要的作用。可以说，DNA甲基化是生物生长发育和肿瘤发生的主要过程之一，它提供了一种阻止生物对外源DNA表达的防御机制，通过去甲基化可以有效激活沉默基因。

DNA去甲基化(demethylation)是指5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)被胞嘧啶代替的过程。一般认为，DNA去甲基化有两种方式：一种是主动去甲基化(active demethylation)，这一过程不依赖于DNA复制，受酶的催化，使5mC 转化为未甲基化的胞嘧啶；另外一种是与复制相关的DNA去甲基化(replication-coupled demethylation)[31]，即在DNA复制时，DNA甲基化模式的维持受到干扰，没有保留原有甲基化模式，随着复制的进行，甲基化的CpG岛被稀释，导致DNA去甲基化。

3.1.1主动去甲基化

DNA直接去甲基化需要C-C键的断裂。有研究表明在白血病细胞的去甲基化过程中，5-甲基胞嘧啶由经标记的胞嘧啶代替，提示整个核苷仅为碱基被替换，其机制可能是通过5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶作用，将DNA中的甲基化胞嘧啶去除，留下完整的脱氧核苷。DNA去甲基化酶首先在鸡胚细胞核抽提物中发现，其特异性的作用底物是CpG岛甲基化的胞嘧啶，因此称为5-甲基胞嘧啶糖苷酶，其作用依赖于RNA，局部DNA去甲基化的修复最终是将嘧啶以核苷的形式加至原处。甲基CpG结合结构域(methyl CpG-binging domain, MBD) 也具有类似5-甲基胞嘧啶糖苷酶活性和G/T错配的修复功能，其对于基因组尤其是着丝粒两侧的微卫星DNA序列的去甲基化具有重要的作用。

关于主动去甲基化的潜在机制仍存在很多争论[32]，但目前主流观点认为是由5mC的修饰开始，主要以脱氨基作用、氧化作用、甲基团脱氢过程实现，如图1所示，可能涉及到的方式有5个，即碱基切除修复(base excision repair，BER) 方式、5mC脱氨基偶联BER方式、氧化去甲基化偶联BER方式、水解去甲基化方式、核苷切除修复( nucleosideresectionrepair，NER) 通路。

图1 DNA主动去甲基化原理图

Fig. 1 Schematic diagram of DNA active demethylation

①BER方式：BER机制的第一步是利用DNA糖苷酶将一个碱基切除，然后利用AP裂解酶裂解脱碱基位点。研究发现，所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。一类DNA糖苷水解酶一般只对应于某一特定的类型的损伤，如尿嘧啶糖苷水解酶就特异性识别DNA中胞嘧啶自发脱氨形成的尿嘧啶，而不会水解RNA分子中尿嘧啶上的N-β-糖苷键。DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA 聚合酶Ⅰ合成合成新的片断，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA 链，从而完成去甲基化。

②5mC脱氨基偶联BER方式：这种方式需要3个步骤，5mC先经过TET 羟化酶(ten-eleven translocation)氧化转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC )，然后经过脱氨酶(activation-induced deaminase, AID)脱氨基转变为5hmU，5hmU可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase, TDG)识别并切除，再通过BER最终将该位点转化为胞嘧啶，实现DNA去甲基化。

③氧化去甲基化偶联BER方式：5 mC先经过TET羟化酶氧化转化为5 hmC，然后继续在TET作用下氧化成5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5fC)，进一步又氧化成5-胞嘧啶羧基(5-Carboxylcytosine, 5caC)，生成的5caC可被TDG识别并切除，在BER机制下也可实现该位点C的生成，如图2所示。

图2 氧化去甲基化

Fig. 2 Oxidative demethylation

④水解去甲基化方式：通过酶促反应直接移除5mC上的甲基基团，MBD2酶( Methylated DNA binding domain-containing protein 2)能过通过酶促反应直接

移除5mC上的甲基基团来实现去甲基化过程。完成DNA去甲基化最简单的方式就是通过酶促反应直接移除5mC上的甲基基团，而这需要有强烈的催化活性才能使牢同的C-C键断裂。MBD2是第1个被报道能实现该过程的酶，不需要其他任何特定的因素而通过催化水解反应直接从 5 mC上去除甲基团后释放甲醇，但这种不利于热力学的机制一直备受争议。

⑤NER方式：针对由紫外线和致癌物质诱导产生的DNA螺旋扭曲损伤，NER核酸酶XPF和XPG酶切损伤附近的DNA片段，接着在DNA聚合酶的作用下C取代5mC，导致DNA甲基基团的丢失，从而实现DNA去甲基化。

3.2.2与复制相关的去甲基化

除了前述通过DNA去甲基化酶和DNA修复途径的主动去甲基化外，DNA 的复制过程也可能有去除DNA上的5-甲基胞嘧啶的作用。DNMT1甲基转移酶靶向复制叉可快速维持CpG二核苷酸的甲基化。而染色质结构及与转录活性相关的核蛋白复合物可能干扰DNMT1维持甲基化酶的特性，因此随着细胞分裂事件的进行，DNA的甲基化程度逐渐减低。例如脉胞菌在一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A生长后DNA甲基化会选择性丢失。在DNA复制过程中，来自亲代染色体的含对称甲基CpG二核苷酸的两条DNA链将分成子代的染色单体，因而子代的染色单体中含半甲基化的DNA。在正常情况下，NMT1维持甲基化酶的作用是恢复对称的甲基化。当序列特异的转录因子结合到DNA甲基化位点时，可能阻止甲基化转移酶与这些位点的接近，因而导致DNA渐进地去甲基化。至于更普遍的基因组去甲基化，则为特殊的组蛋白修饰(如乙酰化)可能产生的聚四氟乙烯效应(teflon effect)，从而有效抑制甲基转移酶的接近,出现DNA复制过程中的去甲基化。

3.2 其他

转录后基因沉默与转录基因沉默不同，它具有逆转性，即受抑基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂的不可遗传性，可以通过基因克隆、诱变处理、菌株或种间自然接合、原生质体融合等方法可以激活沉默基因。

4. 结语

基因沉默无论在基因表达调控方面，还是基因调控方面都起着相当重要的作

用。真菌基因沉默与激活的深入研究不仅有利于有助于阐明真菌的系统进化关系，也有利于分析工程菌的转基因沉默现象并将其应用于生物学医学的各个领域。然而目前还存在一系列问题，例如如何把有去甲基化功能的序列加到载体上防止甲基化，开发甲基化酶药物阻断剂，如何把理论上可行的治疗模型用于人体以及评价其作用效果等都有待于进一步研究。总之真菌的基因沉默与激活在各方面的应用研究还有很长的路要走。

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对本课程的建议：

科学的殿堂幽深谧远，没有人会在其中一无所获，也没有人能走遍它的每个角落。对于学生而言，无法对每个科学方向或课题都有一个很透彻的理解，尤其是那些有很多繁复的概念的，但他山之石，可以攻玉，来自其他方向的理论、方法常常能够给人以启迪，所以建议在以后的课程学习中，选题能够更加宽泛，但当涉猎，不求甚解！