壳聚糖酶的制备及应用

大连理工大学专业学位硕士学位论文题目

摘要............................................................................................................................. I Abstract ............................................................................................................................. II 第一章绪论. (1)

1.1壳寡糖概述 (1)

1.1.1壳聚糖 (1)

1.1.2壳寡糖 (2)

1.2壳寡糖的应用 (2)

1.3壳寡糖的制备工艺 (3)

1.3.1化学法 (3)

1.3.2物理法 (4)

1.3.3酶解法 (4)

1.4壳聚糖酶 (5)

1.4.1壳聚糖酶的发现 (5)

1.4.2壳聚糖酶的来源 (5)

1.4.3壳聚糖酶的酶学性质 (5)

1.4.4壳聚糖酶的分离纯化 (6)

1.5 本研究的目的和意义 (6)

1.6 本研究的主要技术路线 (7)

第二章产壳聚糖酶菌株的筛选及鉴定 (9)

2.1 引言 (9)

2.2 材料 (9)

2.2.1 主要药品 (9)

2.2.2 主要仪器和设备 (10)

2.2.3 菌种及培养基 (10)

2.2.4 主要试剂 (11)

2.3酶活测定方法 (11)

2.3.1 氨基葡萄糖标准曲线绘制 (11)

2.3.2 酶活检测方法 (13)

2.3.3 酶解产物检测方法 (13)

2.4 菌种筛选及鉴定 (13)

2.4.1 壳聚糖酶产生菌的初筛 (13)

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壳聚糖酶的制备及应用

2.4.2 酶解产物鉴定 (13)

2.4.3 壳聚糖酶产生菌的复筛 (14)

2.4.4 菌种鉴定 (14)

2.5 结果与分析 (14)

2.5.1 壳聚糖酶产生菌的筛选及酶活测定 (14)

2.5.2 菌落及形态特征 (15)

2.5.3 生理生化特征 (16)

2.5.4 16sRNA鉴定结果 (17)

2.6 本章小结 (18)

第三章壳聚糖酶基因工程菌的构建及高密度发酵 (19)

3.1 引言 (19)

3.2 材料 (19)

3.2.1 主要药品 (19)

3.2.2 主要仪器 (20)

3.2.3 主要培养基及诱导剂 (21)

3.2.4 主要试剂 (21)

3.2.5 酶活测定方法 (22)

3.3 基因工程菌构建 (23)

3.3.1 壳聚糖酶编码基因的获得 (23)

3.3.2 异源表达载体的构建 (24)

3.3.3 重组工程菌的表达及验证 (26)

3.4 高密度发酵条件优化 (27)

3.4.1 菌株培养方法 (27)

3.4.2 培养基单因子实验 (27)

3.4.3 培养条件优化 (28)

3.4.4 10L发酵罐放大实验 (28)

3.5 实验结果 (28)

3.5.1 蜡样芽孢杆菌基因组提取 (28)

3.5.2 基因重组工程菌的获得及验证 (31)

3.5.3 培养基单因素对发酵影响 (33)

3.5.4 发酵条件对发酵酶活的影响 (36)

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大连理工大学专业学位硕士学位论文题目

3.5.5 10L发酵罐验证试验 (38)

3.6 本章小结 (39)

第四章基因重组壳聚糖酶粗品在壳寡糖生产中的应用 (40)

4.1 引言 (40)

4.2 材料 (40)

4.2.1 试剂及设备 (40)

4.3 方法 (41)

4.3.1 测定方法 (41)

4.3.2 壳聚糖酶的初级纯化 (42)

4.3.3 壳聚糖酶催化条件研究 (42)

4.3.4 壳聚糖酶酶解的影响因素 (43)

4.3.5 浓缩废水套用实验 (44)

4.3.6 中试放大验证实验结果 (44)

4.3.7 壳寡糖的浓缩干燥 (44)

4.4 实验结果 (45)

4.4.1 壳聚糖酶催化条件研究 (45)

4.4.2 壳聚糖酶酶解的影响因素 (47)

4.4.3 浓缩废水回收利用实验 (49)

4.4.4 中试放大结果 (51)

4.4.5 固体壳寡糖指标 (52)

4.5 本章小结 (52)

结论 (53)

参考文献 (54)

致谢 (57)

大连理工大学学位论文版权使用授权书 (58)

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第一章绪论

1.1壳寡糖概述

1.1.1壳聚糖

壳聚糖(简称CTS ）是壳寡糖的生产原料，是由甲壳质脱乙酰化，即脱去C 2上的乙酰基而得到，一般来说，甲壳素上的N-乙酰基脱去55%以上就可以称之为壳聚糖，结构式如图1.1。壳聚糖呈灰白色或白色，略有珍珠光泽，是无定形半透明的固体，大约在185℃分解[1]，不溶于稀碱溶液和水，可溶于稀的有机酸和部分无机酸(如盐酸)，但不溶于稀硫酸、稀磷酸、稀硝酸和草酸等[2]。

图1.1 壳聚糖结构式

Fig. 1.1 Structural formμLa of Chitosan

壳聚糖是目前唯一商品化的碱性多糖。被誉为是除蛋白质、脂肪、糖类、纤维素和矿物质之外人体所需的第六大生命要素[3]。因其具有的独特的物化性质及生理功能，在食品，医药，环保等行业有广泛的用途，如在食品上可用作降血压、降血脂、降胆固醇食品的添加剂；在环保上可用作增粘性、金属鳌合性等。近年来随着研究的不断深入，壳聚糖在医药、食品、环保上的应用范围越来越广泛，在化妆品、农业等诸多方面也展现出广泛而独特的应用价值 [3] [4] [5]。

但是壳聚糖的分子量相对较大，并且有很严密的晶体结构，因此水溶性较差，而且在普通的溶剂中溶解性也很差，只能在某些酸中溶解，这使得壳聚糖很难被利用，其应用价值受到了极大限制[6]。另外，研究表明分子量对壳聚糖的性质也有很大影响，甚至不同分子量的壳聚糖能表现出截然相反的性质，而壳聚糖的许多独特的功能只有在分子量降低到一定程度时才能表现出来[7]，如抗肿瘤，抑菌杀菌功能。这些是大分子壳聚糖所不具备的，因此近几年来对壳聚糖的降解产物壳寡糖的研究逐渐成为热点。