酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
引论及原理
酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）实验目的
学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器
1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱
2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯
3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂
1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）
＋ H 2O 蔗糖酶
O H
H O
2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）
3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）
4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液
（四）操作步骤
1. 提取
（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
（2）将研钵稳妥放入冰浴中。
（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。
（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。
（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。
（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
2. 热处理
（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。
（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
3. 乙醇沉淀
（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。
（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。
（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm 离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。
（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）
（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项
二、DEAE-纤维素层析纯化蔗糖酶
（一）实验目的
学会离子交换柱层析法纯化蛋白的方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1.核酸蛋白检测仪、自动部分收集器、蠕动泵、层析柱、梯度混合器
2.滴管、真空泵或抽滤瓶、烧杯等。
材料及试剂
1. 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.3）
2. 0.5mol/L NaOH
3.0.5mol/L HCl
4.含100mmol/L NaCl 的0.05mol/L Tris-HCl（pH7.3）液
5. DEAE-纤维素
6. 2%蔗糖溶液
7．Benedict试剂：称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3?H20）100g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释850mL。另称取17.3g硫酸铜溶解于100mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。
（四）操作步骤
1. 离子交换剂的处理
（1）称取6克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加水浸24小时抽干（真空泵或抽滤瓶）后放入小烧杯中；
（2）加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，抽干后放入小烧杯中；
（3）加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，放入小烧杯中；
（4）用0.5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。
本实验可直接用0.5mol/L NaOH浸泡1小时，抽干水洗至中性。
因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收。按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH溶液处理，然后水洗至中性备用。
2．装柱与平衡
（1）先将层析柱垂直装好，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱（装量为柱长2/3或离柱顶端3~ 4cm，柱内纤维素要均匀，不要出气泡）；
（2）用0.05 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 起始缓冲液平衡（约100ml流出液即可），以流出液pH与缓冲液一致为准。
3.上样与洗脱
（1）将剩余小烧杯中的醇级分Ⅲ用滴管取1.5ml小心地沿柱壁加到层析柱中，不要扰动柱床。（注意上样量：分析用量一般为床体积的1%~2%，制备用量一般为床体积的20%~30%）（2）用滴管小心地沿柱壁加入起始缓冲液约5ml；
（3）用0.05mol /L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液进行NaCl（0~100mmol/L）线性梯度洗脱。
层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05ml/L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液和50ml 0.05mol/L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液，其中含100mmol/L NaCl。
洗脱流速为0.5 ml /分~1ml/分，使用部分收集器连续收集洗脱液，每管接收4ml。记录每管A280。至混合器中液体流完为止。
（4）每隔4管（或取A280值高的几个峰值）做酶活力的定性测定，确定活性最高的几管合并（约20ml即可），转入量，量出体积，并记录。
（5）取出2ml放入2ml离心管中（标记为柱级分IV，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分用于下一步实验。（标记为柱级分IV）。
蔗糖酶活力的定性测定方法：取1干净试管加入2%蔗糖溶液1.5ml，蔗糖酶溶液0.5 ml, 37℃恒温水浴保温15分钟后，加入Benedict试剂1ml，沸水浴2~3分钟。观察桔红色沉淀多少。
（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项
三、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定
（一）实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理
本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：25~200μg。
本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1. 722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱
2. 量筒、容量瓶、移液器、试管。
材料及试剂
1. 考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1000ml。
2. 0.9% NaCl溶液
3. 牛血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9% NaCl溶液溶解并稀释至1000ml。
4. 4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。
5. 0.2mol/L乙酸缓冲溶液(pH4.5)：
（1）0.2mol/L NaAC：称取27.616g NaAC溶解并定容至1000ml。
（2）0.2mol/L HAC：100ml乙酸(分析纯)定容至500ml。
（3）将两者分别取315ml、185ml混合，用强碱调pH到4.5。
6. Nelson试剂：
A试剂：100ml溶剂中含Na2CO3 2.5g，NaHCO3 2.0g ，酒石酸钾钠（酒石酸钠）2.5g，Na2SO4 20g。
B试剂：100ml溶剂中含CuSO4?5H2O 15g，浓H2SO4 2滴。
以A：B=50：2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。
7. 砷钼酸试剂：100ml中含钼酸铵5g ，浓H2SO44.2ml，砷酸钠0.6g。（砷酸钠有毒，实验中注意）
（四）操作步骤
1．各级分蛋白质浓度测定
（1）蛋白质浓度测定――标准曲线的制备
取7支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀。以吸光度平均值为纵坐标，各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）
（2）各级分蛋白浓度的测定
取9支干净试管，每级分做两管，按表2编号并加入试剂混匀。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜。
2．各级分蔗糖酶活性的测定
（1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线的制作
取9支试管，按表3加样。以吸光度值（O.D）为纵坐标，以还原糖（葡萄糖含量，μmol）作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）
（2）各级分蔗糖酶活性测定
取9支干净试管，分两组，按表4编号并加入试剂混匀。各级分酶液应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即还原糖含量应在0.08~1.2μmol的稀释度为宜。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。
表3Nelson法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制
表4 各级分蔗糖酶活性测定
（3）活力和比活力的计算
活力单位（U）：酶在室温，pH=4.5条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。
根据测得结果，计算出各步数据填入下表
（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项
四、蔗糖酶纯度测定
（一）实验目的
学会操作步骤，掌握实验原理，能够分析实验结果。
（二）实验原理
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1．电泳仪、电泳槽
2．微量取样器、染脱色装置
材料及试剂
1．凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸馏水至100 ml，外包锡纸，4℃冰箱保存30天内使用
2. 凝胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）：18.15gTris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml蒸馏水，用1mol/L HCl调pH到8.8，用蒸馏水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存．
3．电极缓冲液（5*TBE）：使用1*TBE。
4．质量浓度为10％过硫酸铵：此溶液需临用前配制
5．溴酚蓝溶液：5ml 50%甘油+5ml电极液+数滴溴酚蓝
6．染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml 50％加甲醇，9 ml冰醋酸。
7．脱色液：50 ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml蒸馏水混合。
（四）操作步骤
1．8%凝胶的配制、灌胶、上样
（1）8%PAGE凝胶
（2）用滴管吸取凝胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注后插入梳子，待凝胶聚合后，将梳子取出。（3）将各步留液（I、II、III、IV）稀释成1~2mg/ ml蛋白，上样量20μl（蛋白稀释液与溴酚蓝溶
液1：1混合上样）。每级分酶液样占一个泳道。（注：若酶液蛋白浓度低，可增加上样量） 3．电泳
接上电泳仪，上样端接电源的负极，打开电泳仪电源开关，调电压80V ，30分钟后加大到120 V ，待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm 时，停止电泳。 4．剥胶、染色与脱色：
小心将胶取出，置于染脱色装置中，染色30min ，脱色30min 后更换一次脱色液，直至背景清晰。
（五）实验结果与分析
绘出凝胶电泳图谱，分析各步纯化后酶的纯度情况。 （六）注意事项
五、蔗糖酶Km 值测定及脲素的抑制作用
（一） 实验目的
了解米氏常数的意义，学会测定蔗糖酶米氏常数的方法；了解底物浓度和抑制剂对反应速度的影响，掌握确定抑制类型的方法。 （二） 实验原理
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km 值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km 值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km 值也不同。Km 反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km 值0.01~100mmol/L 之间。
酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制，非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km ，纵轴交点为1/Vmax ，横轴交点为-1/Km 。
本实验以米氏公式
利用双倒数法作图，（1/V 对1/[S]）,实验推导得出Km ，并推导出抑制类型，Vmax 等，通过
1/[S]
-1/Km
ν＝
Vmax[S] Km+[S]
实验的方法，可以确定出抑制类型。
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1. 722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱
2. 量筒、容量瓶、移液器、试管。
材料及试剂
1．0.2mol/L乙酸缓冲液
2．0.5mol/L蔗糖溶液
3．8mol/L脲
4．Nelson试剂：(每组30ml)
5．砷钼酸试剂：(每组30ml)
（四）操作步骤
1. Km值的测定
（1）时间作用曲线
取11支试管，按表5加样操作。以时间为横坐标，以产物量为纵坐标，制作时间作用曲线。
酶液的稀释倍数以测定酶活力时得出的稀释倍数为准。
表5 时间作用曲线的制做
（2）底物浓度的影响
取9支试管编号，按表6加样操作。以1/[s]对1/v作图，求Km值。
表6 酵母蔗糖酶Km值的测定
2．脲的抑制
取9支试管，按表7加样操作（做两组，求平均）。以1/[s]对1/v作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。
表7 脲对蔗糖酶的抑制类型测定
（五）实验结果与分析
确定酵母蔗糖酶Km值；确定脲的抑制类型。
（六）注意事项
六、pH对酶活性的影响和最适pH的测定
（一）实验目的
掌握实验原理，学会测定酶最适pH值的方法，确定出在此实验条件下的酵母蔗糖酶的最适pH。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
同酶活力和测定
材料及试剂
1．乙酸缓冲液：配制成pH为3.5；4.0；4.5；5.0；5.5；6.0
2．0.5mol/L蔗糖溶液、Nelson试剂、砷钼酸试剂
（四）操作步骤
1．取6支试管，按表8加样操作。（每个pH均作一个空白，不加酶液）
2．以pH对v作图，画出pH曲线，找出最适pH。
（五）实验结果与分析
确定在此条件下的最适pH
（六）注意事项
表8 蔗糖酶最适pH的测定
七、温度对酶活性的影响和最适温度的测定
（一）实验目的
掌握实验原理，学会测定酶最适温度的方法，确定出在此实验条件下的酵母蔗糖酶的最适温度。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
恒温水浴器，其它仪器、试剂均同于酶活力的测定
（四）操作步骤
1．取6支试管，按表7加样操作。在0℃—70℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出酵母蔗糖
酶在此条件下的最适温度。（每个温度均作一个空白，不加酶液）
2．以温度对v作图，画出温度曲线，找出最适温度。
（五）实验结果与分析
确定在此条件下的最适温度。
（六）注意事项
八、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测蔗糖酶相对分子质量（略，参看生化实验）
酵母蔗糖酶的提取工艺
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
实验3 酵母蔗糖酶的制备
实验3 酵母蔗糖酶的制备 一、实验目的 1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶 2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量 二、实验原理 酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。 三、实验器材 1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。 2、材料：啤酒酵母、 3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。 四、实验步骤 1 研磨水提取 (1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 (2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。 (3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。 (4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。 (5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。 (6) 将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2 热处理和乙醇沉淀 (1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
酵母蔗糖酶提取方法的研究
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
土壤蔗糖酶、纤维素酶的测定方法
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及 土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生 成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度 与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠 （11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。 三、操作步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新 沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色， 以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
蔗糖酶测定方法
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
碱性磷酸酶米氏常数的测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
酵母蔗糖酶的固定化
酵母蔗糖酶的固定化 实验三酵母蔗糖酶的固定化 一、实验原理 1.固定化酶 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。 2.酶活测定 蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。二、实验材料、仪器和试剂 1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液 2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等 3.试剂
(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 (2)10%蔗糖溶液 (3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至 100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液 三、实验步骤 1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联 (1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。 (2)称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。 1 (3)将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。 注意:为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。 (4)壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。 2.固定化酶的制备 (1)将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。
蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定 摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。 第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。 第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。 第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。 最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。 关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD 正文： 1，蔗糖酶的提取及提纯 1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体 内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要 破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系 将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界
关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验
对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究 兰德新（同组：李建鑫） 浙江工业大学海洋学院食工1201 摘要： 目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。 关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE 文献综述: 蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。 而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性
大实验 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 一．实验原理及相关知识 （1）蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定
综合性实验 2 酵母蔗糖酶浓度及酶活力测 定
（一）实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用 3.5－二硝基水杨酸法测定酶活力。掌握 各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理
本实验采用 Bradford 法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定
蛋白浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具
有高敏感性。考马斯亮蓝有 G250 和 R250 两种。其中考马斯亮蓝 G250 由于与蛋白质的结
合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝 R250 与蛋白质反应虽然比较缓慢，
但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在 OD465nm。当它与蛋白质结合形 成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为 OD595nm，其光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G250 结合在 2min 左右的
时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法试剂配制简单，
操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法高近 4 倍，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合
物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在 10~100μg/mL 蛋白质浓度范围内成
正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围
内。
本实验采用 DNS 法[11]测定，属于染料结合法的一种。还原糖的测定是糖定量测定的基
本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还
原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的 1,2-糖苷键裂解，释放出等量的 D-葡萄糖和 D-果糖[12]。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5
－二硝基水杨酸被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸（图 1）。在一定范围内，还原糖的
量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，可利用分光光度计进行比色测定，查对标准曲线，
求得样品中的含糖量。
O2N
COOH OH
+ 还原糖
NO2
加热 碱性
COOH OH
O2N
NH2
酵母蔗糖酶的制备与活力测定
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定 一、目的要求 1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。 2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。 3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。 二、实验原理 蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。 三、仪器与试剂 1. 仪器 研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul） 2. 试剂 市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液，pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。 四、实验方法 1. 蔗糖酶制备 称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。沉淀真空干燥后称重。再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。 2. 蔗糖酶活力测定 （1）制作葡萄糖标准曲线 取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。按表1操作。
酵母蔗糖酶的分离提取 (修复的)
酵母蔗糖酶的分离提取 摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。 关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化 Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl alcohol and dialyzing。The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees. Key words:yeast;invertase;extraction;purification 蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）,又称转化酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5. 1.材料与方法 1.1试剂 1)酵母粉（实验室提供） 2)醋酸钠(0.5g) 3)乙酸乙酯（8ml） 4)10%醋酸 5)无水乙醇 6)蒸馏水 7)3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS） 8)考马斯亮蓝G-520 9)5%蔗糖 10)NaOH溶液 11)系列标准蛋白液 12)9%生理盐水 13)蛋白质染色液 14)磷酸缓冲液buffer（0.005mol/L PH6.0） 注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35℃） 1.2器材 1)量筒25ml 2)烧杯100ml、500ml 3)大小试管若干
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 袁某某 （西北农林科技大学陕西杨凌） ［摘要］采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。 [关键词]蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量 1 引言 自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 2 材料与方法 2.1 实验材料 高活性干酵母粉、DEAE纤维束DE-23、0.2mol/L Tris-HCL缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、水杨酸、0.4mol/L NaOH溶液 2.2 实验方法 2.2.1 蔗糖酶的提取与部分纯化 将15g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30min。抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，8000r/min离心10min，弃沉淀及脂层，的粗级分Ⅰ。 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗体级分Ⅰ的离心管稳妥地放入水浴中，不断轻摇离心管保存30min。取出离心管，于并于中迅速冷却，4℃，10000r/min, 离心10min。取上清液，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分Ⅱ）。 将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰盐浴，逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌30min，再冰盐浴10min，以沉淀完全。4℃，10000r/min, 离心10min，弃去上清液，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存，即醇级分Ⅲ。 2.2.2 酶活性及酶活力影响因素的研究 采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。 （1）标准曲线的制作 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20mmol/L葡萄糖/ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 葡萄糖/μmol 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 H O 2/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 水杨酸试剂/ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml
啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定
啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定 1、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。 我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。 2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理 （1）DNS试剂+ D-葡萄糖氨基化合物 （还原糖）（棕红色） （2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。 （3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。 试剂与器材 恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液、乙酸乙酯。 操作方法 ①细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力峰→制冻干粉 ②制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力。 ③测定三种酶样品的蛋白浓度 ④计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率 ⑤用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值 关键步骤与注意事项 ①乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样 ②装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直 ③分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向 ④在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。 ⑤酶活力测定及作图一定要准确。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法 摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。 1材料与方法 1．1材料 酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。 1．2主要化学试剂和仪器 十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。 1．3酶活性测定 适当稀释的酶液0．5mL，加入0．3mL pH 4．6、0。1mol／L的NaAc—HAc缓冲液，0．2mL0．1mol／L的蔗糖，37℃准确反应15min，后加0．125mL 1mol／L的NaOH中止反应。 用DNS法叩在540nm波长下测定形成的还原糖量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖，经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。 1．4蛋白质含量的测定 按Lowry氏法_1叩测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准，绘制标准曲线。 l-5 SDS-PAGE 分离胶质量分数为12，浓缩胶质量分数为5。 1．6等电聚焦 用PhastSystem全自动快速水平电泳仪进行等电聚焦电泳。电泳程序的设置参照Amersham 公司使用手册。 1．7粗酶制备 1．7．1甲苯自溶法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水使其溶解，加入2．4gNaAc和4．5mL 甲苯，摇床振荡10min，37℃恒温水浴69h。再加入4．8mL4mol／L的HAc和15mL双蒸水，调pH至4．5，于4℃、3000r／min离心30min，离心后将