布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程
布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化
刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立*
（南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061）
摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。
关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养
Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production
LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli*
(College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment.
Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323
中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式：
刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,
LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,
收稿日期：2018-04-24
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021）
第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。
E-mail: liukaifang126@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,
*通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。
E-mail: hui?@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,
微生物发酵培养基的优化方法
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
发酵工业中常用常见的酵母菌
发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。 目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。 底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
菌株MY02发酵培养基的优化设计
菌株MY 02发酵培养基的优化设计 Ξ 刘 秋,闫建芳,艾 勇,于基成,杨宝灵,范圣第 (大连民族学院生物工程研究中心,大连116600) 摘 要:以龟裂链霉菌MY 02菌株为试材,采用单因子试验与均匀试验相结合的方法,通过二次多项式回归分析,筛选出活性组分S N06最佳发酵培养基配方,并建立了多元二次回归数学模型。菌株MY 02优化发酵培养基的最佳配方:淀粉质量分数为2169%,花生饼粉质量分数为1139%,(NH 4)2S O 4质量分数为0118%,CaC O 3质量分数为0114%,NaCl 质量分数为0116%。根据回归模型计算出S N06理论效价与实测效价相比较,二者非常接近,拟合误差小。 关键词:龟裂链霉菌;农用抗生素;均匀设计试验;发酵条件 中图分类号:Q932335 文献标识码:A 文章编号:100025684(2006)0420361204 Optimization of Fermentation Culture Medium of Isolate MY02 LI U Qiu ,Y AN Jian 2fang ,AI Y ong ,Y U Ji 2cheng ,Y ANG Bao 2ling ,FAN Sheng 2di (Research Center o f Biotechnology ,Dalian Nationalities Univer sity ,Dalian 116600,China ) Abstract :Active com ponents S N06in fermentation of Streptomyces rimosus MY 02show antag onism a 2gainst pathogen 1It is a basic im plementation for production of S N06that screens medium ingredients and corresponding dosage 1In this study ,the optimum medium ingredients and dosage of Streptomyces rimosus MY 02were determined using uniform design combined with regression analysis 1A regression m odel was developed 1The optimum medium was starch 2169%,peanut steep powder 1139%,(NH 4)2S O 40118%,CaC O 30114%and NaCl 0116%1The regression m odel was tested with titre of S N06.The tested result fitted well with those calculated with the m odel 1The results confirmed the applicability of uniform design for screening the best medium ingredients for S N061 K ey words :Streptomgces rimosus ;agricultural antibiotic ;uniform design experiment ;fermentation con 2 dition 新型农用抗生素S N06是由龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株产生的一种多烯大环内酯类抗生素[1]。该抗生素对多种蔬菜真菌病害(如番茄叶霉病、灰霉病、黄瓜枯萎病、茄子黄萎病等)都有较好的防治效果[2]。目前对龟裂链霉菌报道较多的是其能够产生抑制各种细菌生长的重要抗生素———土霉素,但土霉素对真菌的生长没有抑制作用。目前关于龟裂链霉菌能够产生抑制植物病原真菌生长的代谢产物的报道较少[3]。筛选龟裂链霉菌产生的抗真菌活性组分S N06的优化发酵培养基是高效、大量生产S N06 的基础。本试验拟通过单因子及均匀试验对S N06的摇瓶发酵条件进行优化,为进一步的中试 放大及大规模生产提供必要的前提。 1 材料与方法 111 菌种 试验用菌株为大连民族学院微生物工程实验 室自番茄保护地分离的1株链霉菌菌株,经鉴定为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株。活性检测指示菌为番茄叶霉病菌(Fulvia f ulva )。 Ξ基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(20022085),辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2004F079) 作者简介:刘 秋(19692),女,博士,副教授,主要从事植物病原微生物研究。收稿日期:2005207207 修回日期:2005212210 第28卷第4期吉 林 农 业 大 学 学 报V ol 128N o 14 2006年8月Journal of Jilin Agricultural University August 2006
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵 及酶学性质分析 姓名：李善军 学号：2015304120225 院系：华中农业大学生科院
摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。 关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析
本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。 毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。 1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵 1.1种子液培养 1.1.1种子培养基 YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%） YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2% 1.1.2培养温度与菌龄 挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。 1.2发酵罐培养 1.2.1菌体培养 清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏2 1.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039； 2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071； 3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000 ［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78 ［文献标识码］A ［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04 Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer?mentation XIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2* 1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850; 3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China *Corresponding author,E-mail:liuzhm@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html, ［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently. High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ?est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ?um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questions existing in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentation course 综述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026 20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类 疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母 大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模 的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L [4]，破伤风片段C 产量高达12g/L [5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L [6]等，而最低的报道只有1mg/L ，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation ）也成为一个关键技术环节。 1 毕赤酵母工程菌的选择和改良 1.1 工程菌的选择 目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut +和mut s ，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制 性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow ， mut s 或mut -），它们只能利用弱的aox2基因启动合成 收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail ）liuzhm@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,
高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化进展[文献综述]
毕业论文文献综述 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化进展 1 前言 淀粉酶( amylase，EC 3. 2. 1. 1)以淀粉或糖原为底物,是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它能从分子内部水解α- 1, 4- 糖苷键, 广泛存在于动物、植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约25％的比例，应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织、石油开采等行业。由于该酶是一种有内切活性的淀粉酶, 可在中性pH 条件下将淀粉水解为糊精、寡糖、麦芽糖和葡萄糖等, 从而使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化, 碘的呈色反应很快消失, 故又称为淀粉液化酶[1，2]。此外它也可作为促消化剂运用于食品[3]、医药工业．淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高．因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要。 2 淀粉酶生产菌株的筛选 2.1 初筛 将在土壤中收集得到的菌株划线接种在淀粉培养基平皿上培养2～4 d，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈产生证明为产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小初步确定酶活性的高低。[4] 但应保存所有产淀粉酶的菌株以用来复筛，因为同一菌株在不同的培养基以及不同的培养条件下产酶的情况可能不同。在平皿上生长和在发酵液中培养也可能会有很大的差别。 2.1 复筛 在淀粉酶生产菌株筛选的过程中，最关键的是其产物，也就是淀粉酶的酶活的检测。由于测定原理和底物性质的不同，淀粉酶的测定方法已经超过200种以上。[5]这些方法可以归纳为两类：天然淀粉底物方法和（分子组成）确定的底物方法。以天然淀粉底物为底物的测定方法，如淀粉分解法、糖化法和色素淀粉法等。由于天然淀粉分子结构的不确定，故不同植物来源的淀粉和不同批号的淀粉，其分子结构和化学性质不尽相同，因此难以达到方法学标准化，测定误差较大。[6]目前除碘·淀粉法和DNS外，这类方法已被淘汰。使用（分子组成）确定的淀粉酶底物和辅助酶与指示酶组成的淀粉酶测定系统，可以改进酶反应的化学计
培养基优化设计
课程设计说明书 课程名称：新编生物工艺学 设计题目: 培养基优化设计 院系：生物与食品工程学院 学生姓名： 学号：200806040035 专业班级：08生物技术 指导教师：关现军 2011 年6月3 日
课程设计任务书
目录 1.摘要··页码 2.关键字··页码 3.设计背景·页码 3.1培养基简介··页码 3.2培养基优化设计的重用意义··页码 4 设计方案·页码 4.1原材料制备··页码 4.2菌种的选择··页码 4.3营养因子的比例设··页码 4.4理化条件控制··页码 4.5总工艺流程列叙··页码 5 预期结果··页码 6 方案实施时可能出现的问题与对策·页码 7 设计感受··页码 7.1 关于本方案··页码 7.2 关于自我··页码 8参考文献··页码 .
1 摘要 以改良ＭＲＳ发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等７个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。利用Ｌ8（２的7次方）正交实验，优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的ＭＲＳ培养基发酵液中，３７℃培养２０ｈ，菌落数均高于原ＭＲＳ培养基发酵液的菌落数，达到１护ｃｕｍＬ以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约４0％，同时使菌种数量达到最大。 2 关键字 乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌 3. 设计背景 3.1乳酸菌培养基简介 乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义。设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值。 乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂,影响生长的因素多,在实际工作中还应做其他条件的优化,如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等,因工作量大而时间有限,只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本,在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物,在发酵罐内完成乳酸
酵母菌
酵母菌 子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。是遗传工程和细胞周期研究的模式生物。 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。 生理 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 在有氧气的环境中，酵母菌将葡萄糖转化为水和二氧化碳.无氧的条件下，将葡萄糖分解为二氧化碳和酒精. 在温度适合时，氧气和养料充足的条件下，以出芽方式迅速增殖。 化学元素组分 酵母的化学组成与培养基、培养条件和酵母本身所处的生理状态有关。 一般情况下： 酵母细胞的平均元素组成(%)如下：碳-47 氢-6.5 氧-31 氮-7.5~10 磷-1.6~3.5 其他元素的含量很少（%） 钙-0.3~0.8 钾-1.5-2.5 镁--0.1~0.4 钠-0.06-0.2 硫-0.2 在酵母中发现的微量元素（mg/kg) 铁--90-350 铜：20-135 锌：100-160 钴：15-65 特征 各种酵母菌的菌落 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米或5~20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的
培养基优化方法
方法一： LB培养基、平板保存的工程菌HB101/pJJ－rhIFNα2B、Amp、酵母提取物、蛋白胨、 10×SAE、100×MgCl2、100×TES、Tris、HCl 10×SAE配方(1L)： KH2PO410g、K2HPO4·3H2O52.4g、NH4Cl10g、K2SO426g 100L 【步骤】 种子制备： 1、取100mLLB培养基加入到一无菌的500ml三角形中，同时加入100μl100mg/ml的Amp。 2、接种甘油管保存的工程菌HB101/pJJ/rhIFNα-2b100μl，使工程菌分散于培养液中。 3、盖好试管，在摇床上以220rpm的速度，于37℃培养至对数中期（约5小时） 上罐准备： 1、配置500ml10×SAE 2、配置发酵培养基(3L)
称取胰蛋白胨30g，酵母提取物90g，加入2.64L去离子水，搅拌溶解后加入300ml 10×SAE、30ml100×MgCl2、30ml100×TES。 3、将培养基加入到5L发酵罐，插入pH、溶氧电极和温度探头，装上空气过滤膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入一瓶250ml30%磷酸（调pH用），于1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌30min。 4、待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好冷凝水、空气线路。 5、控制pH=7.4，在转速650r/m、通气量3L/min 定D.O.为100％于自动控制发酵罐上37℃发酵22小时。 6、当培养基温度冷却到37℃后，接入制备好的种子 7、从接种完时刻起，每两小时取适当量样品，其中取1ml用于测菌体浓度（A600nm）；另取1ml加入到一称过重ep管中，12000rpm离心，小心取出900μl上清用作测菌体浓度的空白，甩干后再次称重，计算菌体湿重，按每8.3mg菌体湿重加入300μL水重悬菌体，冻于-20℃备用。并记录发酵罐上溶氧、pH、温度等参数以了解工程菌的生长状态。 8、SDS－PAGE检测不同时间rhIFNα2B的表达情况。 9、发酵终了，收集发酵液，8000rpm离心10min，回收菌体。 10、用1.2L去离子水重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清 11、再用600mlTE重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清,得到菌体-20℃保存 方法二： 2.1种子培养基的配制 LBA：（Tryptone蛋白胨10g ＋Yeast Extr+acts酵母粉5g ＋NaCl 5g ＋双蒸水1L）∕L （NaOH调节PH至7.0）高压蒸气灭菌，压力：0.14Mpa 温度121℃时间：20min，用前加卡那霉素至50μg/ml。 LBA平板：加入2%琼脂粉，其余同上。 2.2生产菌种的制备 2.2.1琼脂培养基菌种的制备 从－80℃的冰箱中取出甘油种子管，在超净工作台中划LBA平板，37℃培养箱中培养过夜。2.2.2一级种子液制备 从LBA平板中挑取单菌落，在超净工作台上接种于约60ml LBA培养液中，与摇床上37℃，180rpm，生长16h，OD600值约为3.0。 2.2.3二级种子液制备 将60ml一级种子液接种于3L LBA 培养液中，于摇床上37℃，180rpm，生长12h，OD600值约为3.0。 3.发酵
酵母菌的高密度发酵
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：酵母菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：吴亚非 学号：201006040051 专业班级：10 生物技术 指导教师：马瑞霞 2013年5月26日
课程设计任务书设计题目酵母菌的高密度发酵 学生姓名吴亚非所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10级生物技术 设计要求： 1、设计题目选择要求紧扣发酵工程相关教学内容和生产实际。 2、要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题。 3、设计说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、实验方案要切合实际，严密合理 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的指导下确定设计题目。 2、学生查阅相关文献和资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可操作性。 3、学生在实验室完成既定方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，经过指导老师的帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术[M]，化学工业出版社，2006-10-01，230-280 [2]陈思如，萧熙佩酵母生物化学[M]，济南：山东科学技术出版社，1990年 [ 3 ] ( 日) 山根恒夫( 周斌译) , 生化反应工程( 第二版)[M] , 西安: 西安大学出版社, 1992: 243 [4]Craig. T.B. and Trotter S G Intern. Symp. SCP. A lgiers A lgoria, O ct, 1983:17-20 [5]陈洪章，李佐虎，酵母菌的高密度发酵[J]，工业微生物，1998-28-1 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2013年5月13日 任务完成日期：2013年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：
发酵工程
一、绪论 1、发酵工程（Fermentation Engineering）：指在最适发酵条件下，在发酵罐中大大量培养细胞和生产代谢产物的技术。 2、发酵工程研究内容：发酵工艺主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件，如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。 3、发酵工程的特点：一个完整的发酵工程包括： （1）材料的预处理（即培养基的制备过程）； （2）生物催化剂的制备（要选高产、稳定、高效、容易培养的菌株作种子或利用固定化酶或固定化细胞）; （3）生化反应器及发酵条件的选择和监控（生物反应器是进行生物反应的核心设备）； 4、细胞融合技术：基因操作技术能定向的制造出新的有用的微生物。 5、发酵工程的最基本的问题是过程优化与放大。 二、菌种的选育 1、代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 3、自然界中有目的微生物分离的一般过程： 土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 采样时要注意的问题：气候、水分、空气，来源要广结合产品的特点，标签：地点、时间、气候等 3、目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 富集的三种方案： （1）定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养； （2）当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑； （3）不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法；定向培养的方法：物理方法：加热、膜过滤等，但主要是通过培养的方法 4、菌落的选出 （1）从产物角度出发：在培养时以产物的形成有目的的设计培养基，利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素； （2）从形态的角度：菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别； 5、菌种选育分子改造 目的：（1）防止菌种退化；（2）解决生产实际问题；（3）提高生产能力；（4）提高产品质量；（5）开发新产品； 方法：（1）基因突变：自然选育、诱变育种； （2）基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程； （3）基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法shuffling;
布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化 刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立* （南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061） 摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。 关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养 Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli* (College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment. Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323 中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式： 刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/a617776125.html, LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/a617776125.html, 收稿日期：2018-04-24 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021） 第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。 E-mail: liukaifang126@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html, *通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。 E-mail: hui?@https://www.360docs.net/doc/a617776125.html,