从基础走向临床的耳聋基因诊断

突发性耳聋临床路径

突发性耳聋临床路径（2011年版）一、突发性耳聋临床路径标准住院流程（一）适用对象。第一诊断为突发性耳聋（ICD-10：H91.2）。（二）诊断依据。根据《临床诊疗指南-耳鼻咽喉科学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社）、《突发性聋的诊断和治疗指南》（中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会；2005年，济南）。 1.突然发生的,可在数分钟、数小时或3天以内。 2.非波动性感音神经性听力损失,可为轻、中或重度,甚至全聋。至少在相连的2个频率听力下降20dB 以上。多为单侧,偶有双侧同时或先后发生。

3.病因不明(未发现明确原因包括全身或局部因素)。 4.可伴耳鸣、耳堵塞感。 5.可伴眩晕、恶心、呕吐,但不反复发作。 6.除第八颅神经外,无其他颅神经受损症状。（三）治疗方案的选择。根据《临床诊疗指南-耳鼻咽喉科学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社）、《突发性聋的诊断和治疗指南》（中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会；2005年，济南）。详细询问病史，积极寻找病因，尽早介入治疗。 1.一般治疗:适当休息并治疗相关疾病,如高血压、糖尿病等。 2.糖皮质激素类药物。 3.改善内耳微循环药物。 4.降低血液黏稠度和抗凝药物。 5.神经营养类药物。

6.其他治疗,如混合氧、高压氧等治疗。（四）标准住院日为15-17天。（五）进入路径标准。 1.第一诊断必须符合ICD-10：H91.2突发性耳聋疾病编码。 2.当患者同时具有其他疾病诊断，但在住院期间不需要特殊处理，也不影响第一诊断的临床路径流程实施时，可以进入路径。（六）住院期间检查项目。 1.必需的检查项目：（1）血常规、尿常规；（2）肝肾功能、电解质、血糖、凝血功能；（3）感染性疾病筛查（乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等）；（4）胸片、心电图；（5）纯音听阈测试。 2.根据患者情况可选择的检查项目: （1）血清病毒学检测;

暴聋中医临床路径

暴聋（突发性聋）中医临床路径路径说明：本路径适合于西医诊断为突发性聋的患者。一、暴聋（突发性聋）中医临床路径标准住院流程（一）适用对象中医诊断:第一诊断为暴聋（TCD 编码：BRE070）。西医诊断: 第一诊断为突发性聋（ICD-10 编码:H91.201）。（二）诊断依据 1．疾病诊断（ 1 ）中医诊断标准：参照中华人民共和国中医药行业标准《中（2）西医诊断标准：参照全国高等医药院校五年制教材《耳鼻咽喉头颈外科学》第七版（田勇泉主编，人民卫生出版社，2008 年）、2005 年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会制订的《突发性聋的诊断和治疗指南》。 2．证候诊断参照“国家中医药管理局‘十一五’重点专科协作组暴聋（突发性聋）诊疗方案”。暴聋（突发性聋）临床常见证候：风邪外犯证肝火上炎证痰火郁结证血瘀耳窍证气血亏虚证（三）治疗方案的选择参照“国家中医药管理局‘十一五’重点专科协作组暴聋（突发性聋）诊疗方案”。 1．诊断明确，第一诊断为暴聋（突发性聋）。 2．患者适合并接受中医治疗。（四）标准住院日为≤14 天。（五）进入路径标准 1．第一诊断必须符合暴聋（TCD 编码:BRE070）和突发性聋（ICD-10 编码:H91.201）。 2．病程4周以内。

3．患者同时具有其他疾病，但在治疗期间不需特殊处理，也不影响第一诊断的临床路径流程实施时，可以进入本路径。（六）中医证候学观察四诊合参，收集该病种不同证候的主症、次症、舌、脉特点。注意证候的动态变化。（七）入院检查项目 1．必需的检查项目（1）血常规、尿常规、便常规、血压（2）肝功能、肾功能、血糖、血脂（3）凝血功能（4）心电图（5）胸部X线片（6）专科常规检查（7）纯音听阈测听检查（8）声导抗检查 2．可选择的检查项目：根据病情需要而定，如听性脑干诱发电位检查、影像学检查（CT/MRI）等。（八）治疗方法 1．辨证选择口服中药汤剂（1）风邪外犯证：宣肺解表，散邪通窍。（2）肝火上炎证：清肝泻热，开郁通窍。（3）痰火郁结证：化痰清热，散结通窍。（4）血瘀耳窍证：活血化瘀，通利耳窍。（5）气血亏虚证: 健脾益气，养血通窍。 2．静脉滴注中药注射液 3．针灸治疗 4．按摩治疗 5．其他疗法：根据病情选择中药沐足等。 6．护理：辨证施护。（九）出院标准 1．听力恢复或提高。 2．没有需要住院治疗的并发症。 3．初步形成具有中医特色的个体化的康复方案。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

耳聋基因检测与诊断的意义

耳聋基因检测与诊断得意义我国科学家19９8年成功克隆了人类遗传性感音神经性聋疾病基因ＧJB3、近年研究证实,先天性颞骨畸形(主要为大前庭水管综合征)与ＳＬＣ2６A4基因突变显著相关。国内耳聋遗传资源收集网络调查研究表明,ＧJB２突变最为常见,其次就是SLＣ2６A4突变,前者突变检出率为21％,明确该基因突变致聋约15%;后者突变检出率约15%,明确该基因突变致聋约１2％。迟发性显性遗传性聋患者虽然出生即携带致病突变,但幼年时听力可完全正常,随年龄增长,而逐渐出现听力减退,进行性加重。?目前已经应用于临床得耳聋基因常规检测项目主要有线粒体DNAＡ１555G基因、GJB2基因、ＰDＳ基因、GＪB3基因等、耳聋基因筛查对先天性或遗传性聋得诊断具有一定参考价值。线粒体DNA A1５５5G基因突变与氨基糖甙类药物引起耳聋有关;GJB2基因被认为我国最常见得致聋基因,患儿ＧJB2基因阳性,应考虑先天性或遗传性聋得可能性;PＤS基因突变可以导致大前庭水管综合征,PＤＳ全序列扫描可作为分析诊断大前庭水管综合征得客观指标;还有比较常见得GJＢ3基因得５３8C＞T为目前已知可诱发耳聋得致病基因、GJB３基因得53８C>T纯合突变,提示目前已经耳聋或以后发生耳聋得机率非常大;而GJB３基因得538C＞T杂合突变,提示以后可能发生耳聋或不发生耳聋得可能性均存在,因此需要长时期听力监测。必须强调指出,目前得耳聋基因检测仍处于非常初级得阶段,影响因素多,临床意义有限,某个项目一次或多次得检测值异常并不一定能得出耳聋病因得肯定性结论。而且,耳聋基因检测只就是提示

在耳聋病因中占很少数得先天性或遗传性聋得可能性,对在耳聋病因中占大多数得后天获得性感音神经性聋诊断仅具有排除性诊断方面得参考意义。?由于耳聋基因在正常人群中也有较高得携带率,如GJB2、SLC２6A4突变在听力正常人群中携带率均为3%,线粒体DＮA15５5与149４突变携带率约为1/３00,听力正常得育龄夫妇携带至少一种基因突变得几率为6。3％。因此我们认为在有生育要求但无耳聋家族遗传史得听力正常育龄夫妇中进行常见耳聋基因筛查,在此基础上对携带耳聋基因突变得夫妇提供遗传咨询,这一前瞻性防治策略将阻止较大比例得先天性隐性遗传性耳聋得出生,其意义远远大于对已生育聋儿得正常夫妇进行耳聋遗传咨询与产前诊断,从根本上为预防遗传性耳聋发生提供了理论依据与方法。因此耳聋基因筛查与产前诊断可以产生巨大得经济效益与社会效益,从而真正达到提高人口质量,优生优育得目得。一、预防避免耳聋发生或通过及时治疗延缓听力下降药物性耳聋密切相关得母系遗传线粒体DNA１2ＳrRNA突变相关性耳聋。突变基因携带者对氨基糖甙类抗生素敏感,这就就是在携带此突变得个体中使用氨基糖甙类抗生素可以导致或者加重耳聋得原因。如果携带该突变得个体通过基因检测预知自己与家族成员携带这种突变,避免接触氨基糖甙类药物则完全可以避免耳聋得发生,这也正就是耳聋基因检测得意义所在。不仅为聋人明确病因,还要为耳聋易感个体提供个体化得遗传咨询与预防措施、另外一种可以通过有效手段延缓听力下降得耳聋类型就是由

突发性耳聋

【概述】突发性耳聋（以下简称突聋）是一种突然发生的原因不明的感觉神经性耳聋，又称暴聋。De Klevn（1944年）首先描述此病，发病率逐年有所增加，1万人中约有10.7人发病，占耳鼻喉科初诊病例的2%。两耳发病占4%，其中一半两耳同时发病，也有报告高达17%者。性别、左右侧发病率无明显差异。随年龄增加发病率亦增加，患病时年龄在40或40岁以上者占3/4。其发病急，进展快，治疗效果直接与就诊时间有关，应视为耳科急诊，就诊时间以一周内为宜，十日后就诊效果不佳。【病因病理病机】突聋病因不明，文献记载引起本病的原因共100多种，其中许多是罕见的。据Mattox(1977年)的意见，本病的原因顺序为病毒感染、血管疾病、内淋巴水肿、迷路膜破裂及上述诸因素的联合。（一）病毒感染病毒感染是引起本病的最常见的原因。病毒感染循下述主要途径。 1．血行感染病毒颗粒由血循环直接进入内耳血循环内，引起耳蜗循环障碍或内淋巴迷路炎。 2．经脑膜途径病毒由蛛网膜下腔经内听道底的筛板或经蜗小管侵入外淋巴间隙引起外淋巴迷路炎，故耳蜗症状出现于脑膜炎之后。带状疱疹病毒是引起外淋巴迷路炎的主要病原。 3．经圆窗途径病毒引起的非化脓性中耳炎，感染可经圆窗侵入内耳。（二）血管病变血管病变在突聋发病机制中有重要意义。Wilson指出由于部分或全部耳蜗血管堵塞引起的突聋的发病率还不清楚，但少于病毒性迷路炎。也有人认为血管病变在突聋致病原因中占3/4。由于血管痉挛、栓塞、血栓形成、血管受压、血管内狭窄、出血、血液凝固性增高、动脉血压波动以及其他血管障碍，因缺氧而使螺旋器感觉结构发生变性。其中除血管痉挛者外，其他预后均差，常致永久性聋。耳蜗耐氧力很弱，缺氧60s后耳蜗微音电位和神经动作电位就消失，如血流被阻30min，虽血流恢复，但耳蜗电位却不能恢复。大崎胜一郎借助放大55倍的皮肤粘膜显微镜观察到突聋病例中存在血管内“淤塞”现象，认为这种现象可能造成内耳微循环障碍而导致突聋。其病理生理机制是病理性血管内红细胞凝聚→血液粘度增加→血流速度下降→缺氧→渗透性增加、组织水肿、血液浓缩、小血栓形成→组织损伤。（三）迷路膜破裂迷路膜破裂系指内耳的圆窗或卵圆窗膜破裂合并蜗管膜破裂。由于膜破裂，引起突发性感觉神经性耳聋、眩晕和耳鸣等症状。因突然用力活动或经历气压剧变引起中耳气压骤变及颅压骤变。此压力的改变引起迷路膜破裂的机制可从两方面理解。 1．外爆途径

基因诊断试题

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(一）选择题 A型题１．判定基因结构异常最直接的方法是 A．PCR法 B．核酸分子杂交 C．DNＡ序列测定Ｄ．RFLP分析 E．ＳSCP分析 2．不符合基因诊断特点的是 A.特异性强 B．灵敏度高 C.易于做出早期诊断Ｄ．样品获取便利 E．检测对象仅为自体基因３．遗传病基因诊断的最重要的前提是 A.了解患者的家族史 B.疾病表型与基因型关系已被阐明 C.了解相关基因的染色体定位Ｄ．了解相关的基因克隆和功能分析等知识 E.进行个体的基因分型４.若要采用Soutｈern或Ｎｏrthern印迹方法分析某特定基因及其表达产物,需要 A．制备固定在支持物上的组织或细胞

B.收集组织或细胞样品，然后从中提取总DNA或ＲNＡＣ．利用PCＲ技术直接从标本中扩增出待分析的片段Ｄ．收集组织或细胞样品,然后从中提取蛋白质Ｅ.收集培养细胞的上清液 5．目前基因诊断常用的分子杂交技术不包括哪一项A．Sｏuthern印迹 B.Wｅsterｎ印迹Ｃ.Noｒthern印迹 D．ＤＮA芯片技术 E．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 6.SNP的实质是Ａ．碱基缺失 B.碱基插入 C.碱基替换 D．移码突变 E．转录异常７.DNＡ指纹的遗传学基础是Ａ.连锁不平衡 B.DNA的多态性Ｃ.串联重复序列 D．MHC的限制性 E．ＭHC的多样性

8．在对临床病例进行基因诊断时，若遇到不能检测出已知类型突变的情况，如果表型明确指向某种疾病,适用下列哪一类筛查技术 A．PCR法 B．AＳO分子杂交Ｃ.反向点杂交 D．变性高效液相色谱(DＨPLC） E．ＳTR拷贝异常的诊断 9.生殖细胞若发生基因结构突变可引起哪种疾病 A.肿瘤Ｂ．高血压Ｃ．糖尿病 D．遗传病Ｅ．传染病 10.PCR技术容易出现Ａ.假阴性结果 B．假阳性结果 C.灵敏度不高 D．适用不广Ｅ．操作繁冗 1１．目前检测血清中乙肝病毒最敏感的方法是 A.斑点杂交试验 B.等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 C．Sｏutｈern印迹

暴聋(突发性耳聋)中医临床路径

暴聋（突发性耳聋）中医临床路径路径说明：本路径适合于西医诊断为突发性聋的患者。一、暴聋中医临床路径标准住院流程（一）适用对象中医诊断:第一诊断为暴聋(ICD10:BRE070) 西医诊断:第一诊断为突发性耳聋(SD)(ICD10:H91.201) （二）诊断依据(参照国家十一五重点专科暴聋诊疗方案诊断依据) 1.疾病诊断根据西医突发性耳聋诊断标准(参照2005年中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会制订的突发性聋的诊断和治疗指南)、中医证候诊断标准(参照1994年6月国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》)。（1）突然发生的听力损失，可在数分钟、数小时或3天以内; （2）非波动性感音神经性听力损失，可为轻、中或重度，甚至全聋。至少在相连的2个频率听力下降20 dB HL以上。多为单侧，偶有双侧同时或先后发生; （3）病因不明(未发现明确原因包括全身或局部因素); （4）伴耳鸣、耳堵塞感; （5）可伴眩晕、恶心、呕吐，但不反复发作; （6）除第八颅神经外，无其他颅神经受损症状。 2. 证候诊断参照“国家中医药管理局‘十一五’重点专科协作组暴聋（突发性聋）诊疗方案”。

暴聋（突发性聋）临床常见证候：（1）风邪外犯证：多因感冒或受寒之后，突发耳聋，伴鼻塞、流涕，或有头痛、耳胀闷，或有恶寒、发热、身痛。检查:耳膜多无明显变化，或有轻度潮红，听力检查呈单侧或双侧感音神经性聋。舌质红，苔薄白，脉浮。（2）肝火上扰证：多由情绪刺激诱发，突发耳聋，耳鸣如闻风雷声，头痛眩晕，夜寐不宁，口苦咽干，面红目赤，烦躁郁怒，胸胁胀痛，便秘尿黄，舌红，苔黄，脉弦数有力。（3）痰火郁结证：突发耳聋，耳鸣耳闷，头重目眩，胸闷失眠，咳嗽痰涎，口淡无味，二便不爽，舌红，苔黄腻，脉滑数。（4）血瘀耳窍证：突发耳聋，耳鸣嘈杂，或伴眩晕，可有外伤、爆震史，舌质暗红或有瘀点，脉细涩。（三）治疗方案的选择参照“国家中医药管理局‘十一五’重点专科协作组暴聋（突发性聋）诊疗方案”。 1．诊断明确，第一诊断为暴聋（突发性聋）。 2．患者适合并接受中医治疗。（四）标准住院日期:≤14 天。（五）进入路径标准 1、按标准确诊为突发性耳聋，能配合研究治疗者。 2、年龄18～75岁，病程4周以内。（六）中医证候学观察四诊合参，收集该病种不同证候的主症、次症、舌、脉特点。注意证候

耳聋基因检测

耳聋基因检测中国耳聋现状 2006年中国第二次残疾人抽样调查显示，全国残疾人总数高达8000多万，听力语言残疾者达2780万人，其中单纯听力残疾2004万，占残疾人总数的24.16%，听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。３月３日是我国“爱耳日”。2011年（第12次）“爱耳日”的主题是“康复从发现开始—大力推广新生儿听力筛查”。中国新生儿耳聋现状先天性耳聋是导致语言交流障碍的常见致残性疾病之一，已成为全球关注的重大公共卫生问题。新生儿中双侧先天性耳聋发生率约在1-3‰，在目前可筛查的出生缺陷中发病率最高，以我国每年出生１９００万人口计算，平均每年大约要新增２万至６万名。目前已在西方发达国家及我国部分城市实施的新生儿听力筛查证明，早期发现、诊断和早期干预康复，９０％以上的先天性听力障碍患儿可以获得正常交流的能力和健康人一样生活。中央政府门户网站https://www.360docs.net/doc/a64450288.html, 2010年10月25日来源：新华社耳聋分类按发病原因分为：遗传性耳聋(占50-60%)和非遗传性耳聋根据病变部位分3类：传导性、感音神经性、混合型耳聋根据发病时间分:先天性和迟发性耳聋

根据有无伴发疾病:综合症(占1/3)和非综合征性(占2/3)耳聋以语言功能发育程度分为：语前聋和语后聋耳聋遗传方式常染色体隐性遗传：占80% 常染色体显性遗传：10%-20% 性连锁遗传：1%-2% 线粒体基因突变：主要是母系遗传耳聋致病基因目前已鉴定的相关基因至少44个最常见的致病基因是GJB2(connexin 26)，碱基缺失与先天性中至重度耳聋有关，位于13q11-12 SLC26A4(PDS),突变与大前庭水管综合征有关,位于7q22-31.1 12SrRNA，突变与药物性耳聋有关,位于mtDNA 干预措施 GJB2耳聋：电子耳蜗移植(重度耳聋)，进行早期听力恢复大前庭水管综合征患儿：不适合剧烈体育活动，一旦头部受伤，就可能引起听力突然下降线粒体基因突变者：用药警示，避免氨基糖苷类药物

突发性耳聋临床表现

突发性耳聋临床表现突发性耳聋（以下简称突聋）是一种突然发生的原因不明的感觉神经性耳聋，又称暴聋。De Klevn（1944年）首先描述此病，发病率逐年有所增加，1万人中约有10.7人发病，占耳鼻喉科初诊病例的2%。两耳发病占4%，其中一半两耳同时发病，也有报告高达17%者。性别、左右侧发病率无明显差异。随年龄增加发病率亦增加，患病时年龄在40或40岁以上者占3/4。其发病急，进展快，治疗效果直接与就诊时间有关，应视为耳科急诊，就诊时间以一周内为宜，十日后就诊效果不佳。病因耳朵内部构造突聋病因不明，文献记载引起本病的原因共100多种，其中许多是罕见的。据Mattox(1977年)的意见，本病的原因顺序为病毒感染、血管疾病、内淋巴水肿、迷路膜破裂及上述诸因素的联合。病毒感染病毒感染是引起本病的最常见的原因。病毒感染循下述主要途径。 1．血行感染病毒颗粒由血循环直接进入内耳血循环内，引起耳蜗循环障碍或内淋巴迷路炎。 2．经脑膜途径病毒由蛛网膜下腔经内听道底的筛板或经蜗小管侵入外淋巴间隙引起外淋巴迷路炎，故耳蜗症状出现于脑膜炎之后。带状疱疹病毒是引起外淋巴迷路炎的主要病原。 3．经圆窗途径病毒引起的非化脓性中耳炎，感染可经圆窗侵入内耳。血管病变血管病变在突聋发病机制中有重要意义。W ilson指出由于部分或全部耳蜗血管堵塞引起的突聋的发病率还不清楚，但少于病毒性迷路炎。也有人认为血管病变在突聋致病原因中占3/4。由于血管痉挛、栓塞、血栓形成、血管受压、血管内狭窄、出血、血液凝固性增高、动脉血压波动以及其他血管障碍，因缺氧而使螺旋器感觉结构发生变性。其中除血管痉挛者外，其他预后均差，常致永久性聋。耳蜗耐氧力很弱，缺氧60s后耳蜗微音电位和神经动作电位就消失，如血流被阻30min，虽血流恢复，但耳蜗电位却不能恢复。大崎胜一郎借助放大55倍的皮肤粘膜显微镜观察到突聋病例中存在血管内“淤塞”现象，认为这种现象可能造成内耳微循环障碍而导致突聋。其病理生理机制是病理性血管内红细胞凝聚→

基因表达的检测的几种方法

基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的应用。8 f3 f- |2 L) K) b7 ]- ~- | RT-PCR检测基因表达的问题讨论

关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。 7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, { 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。

耳聋基因检测与诊断的意义修订稿

耳聋基因检测与诊断的意义 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

耳聋基因检测与诊断的意义我国科学家1998年成功克隆了人类遗传性感音神经性聋疾病基因GJB3。近年研究证实，先天性颞骨畸形（主要为大前庭水管综合征）与SLC26A4基因突变显着相关。国内耳聋遗传资源收集网络调查研究表明，GJB2突变最为常见，其次是SLC26A4突变，前者突变检出率为21%，明确该基因突变致聋约15%；后者突变检出率约15%，明确该基因突变致聋约12%。迟发性显性遗传性聋患者虽然出生即携带致病突变，但幼年时听力可完全正常，随年龄增长，而逐渐出现听力减退，进行性加重。目前已经应用于临床的耳聋基因常规检测项目主要有线粒体DNAA1555G基因、GJB2基因、PDS基因、GJB3基因等。耳聋基因筛查对先天性或遗传性聋的诊断具有一定参考价值。线粒体DNA A1555G基因突变与氨基糖甙类药物引起耳聋有关；GJB2基因被认为我国最常见的致聋基因，患儿GJB2基因阳性，应考虑先天性或遗传性聋的可能性；PDS基因突变可以导致大前庭水管综合征，PDS全序列扫描可作为分析诊断大前庭水管综合征的客观指标；还有比较常见的GJB3基因的538C>T为目前已知可诱发耳聋的致病基因。GJB3基因的538C>T纯合突变，提示目前已经耳聋或以后发生耳聋的机率非常大；而GJB3基因的538C>T杂合突变，提示以后可能发生耳聋或不发生耳聋的可能性均存在，因此需要长时期听力监测。必须强调指出，目前的耳聋基因检测仍处于非常初级的阶段，影响因素多，临床意义有限，某个项目一次或多次的检测值异常并不一定能

突发性耳聋指南(2015)

突发性耳聋诊断治疗指南（2015）急性特发性感音神经性听力损失，也称突发性聋或特发性突聋，为了规范名称，避免混淆，本指南统一命名为突发性聋(简称突聋)。1997年中华医学会耳鼻咽喉科学分会和中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会组织制定了《突发性聋诊断依据和疗效分级》，2006年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会和中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会修订并刊出了《突发性聋诊断和治疗指南》。既往国内虽然有很多突发性聋临床研究，但多为回顾性分析，指南的制订缺乏强有力的循证医学数据支持。2007年启动的中国突发性聋多中心临床研究提供了大量随机、对照的研究数据，我们在此基础上参考德国和美国新版突发性聋诊疗指南及最新研究进展，对我国2006版突发性聋诊疗指南进行了再次修订。注：目前约90％的突发性聋病因不明，因此治疗上缺乏针对性。由于缺少高质量的临床研究和循证医学证据，文献报告的各种突聋治疗方法及疗效常有很大争议。截至2014年，国际上只有16项设有未治疗或安慰剂治疗组的前瞻性、随机、双盲研究；较高质量的前瞻性随机研究只有30余项，其中部分为双盲对照研究，采用单一或联合治疗方案进行对照；还有3项前瞻性对照研究，但未采用随机方案；而其他研究，包括自愈率研究都未设立对照组或仅为回顾性分析，属于低质量证据。即使是上述少数几个前瞻性对照研究也未得出统一结论。基于上述原因，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会和中华耳鼻

咽喉头颈外科杂志编辑委员会联合组织了全国突发性聋多中心前瞻性随机临床研究，共收集病例1024例，根据不同的听力曲线进行分型，并比较了不同分型以及不同治疗方案的疗效，获得了大量有意义的数据和结果。尽管美国和德国的突发性聋诊疗指南都很强调循证医学证据，但在很多问题上仍存在较大分歧，其中主要原因与各国不同的医疗模式、保险机制以及临床经验等有关。我们应从中借鉴好的经验，但不盲从，根据我国多中心研究结果，结合实际国情，重新修订2006版突发性聋诊疗指南，规范国内突聋的诊治。定义 72h内突然发生的、原因不明的感音神经性听力损失，至少在相邻的两个频率听力下降≥20dBHL。注：原因不明是指还未查明原因，一旦查明原因，就不再诊断为突发性聋，此时突发性聋只是疾病的一个症状。分型突发性聋根据听力损失累及的频率和程度，建议分为：高频下降型、低频下降型、平坦下降型和全聋型(含极重度聋)。 1. 低频下降型：1000Hz(含)以下频率听力下降，至少250、500Hz 处听力损失≥20dBHL。 2. 高频下降型：2000Hz(含)以上频率听力下降，至少4000、8000Hz处听力损失≥20dBHL。 3. 平坦下降型：所有频率听力均下降，250-8000Hz(250、500、1000、2 000、3000、4000、8000Hz)平均听阈≤80dBHL。

基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。第一节基因诊断一. 基因诊断的含义传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。二. 基因诊断的原理及方法

（一）基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。（二）基因诊断的方法基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。 1.DNA诊断常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 ⑴斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 ⑵等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，

基因诊断和治疗的医学应用

基因诊断和治疗的医学应用郭龙飞（保山学院资源环境学院云南保山678000）摘要：各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一，且死亡率很高，现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是，基因治疗为众多患者提供了希望，成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果，以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。关键词：基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及（或）功能缺陷，或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入，激活机体抗瘤免疫，增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性，这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种：①基因矫正或置换：即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因的导人，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现，但机制还不清楚，可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法，临床主要是对症治疗，如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗，呼吸困难逐渐缓解，双肺痰鸣音减少，但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。最近，在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用，而且对细胞几乎没有毒性作用，但研究工作还处于动物实验阶段，没有正式应用于临床，该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20万人，占全部恶性肿瘤发病的2％。其发病匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80％-90％的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15％，年生存率为1％-5％。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100％，5年生存率可达70％- 100％。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径

暴聋(突发性耳聋)中医临床路径(2017年版)5

暴聋（突发性耳聋）中医临床路径（2017年版）路径说明：本路径适用于西医诊断为突发性耳聋的住院患者。一、暴聋（突发性耳聋）中医临床路径标准住院流程（一）适用对象中医诊断：第一诊断为暴聋 (TCD编码：BRE070)。西医诊断：第一诊断为突发性耳聋(ICD-10编码:H91.201)。（二）诊断依据 1.疾病诊断（1）中医诊断标准：参考中华中医药学会发布《中医耳鼻咽喉科常见病诊疗指南》（ZYYXH/T307-321-2012）。（2）西医诊断标准：参考 2015年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会制订的《突发性聋的诊断和治疗指南》。 2.证候诊断参考国家中医药管理局印发的“暴聋（突发性耳聋）中医诊疗方案（2017年版）”。暴聋（突发性耳聋）临床常见证候：风邪外犯证肝火上炎证痰火郁结证血瘀耳窍证气血亏虚证（三）治疗方案的选择参考国家中医药管理局印发的“暴聋（突发性耳聋）中医诊疗方案（2017年版）”。 1.诊断明确，第一诊断为暴聋（突发性耳聋）。 2.患者适合并接受中医治疗。（四）标准住院日为≤14天（五）进入路径标准 1.第一诊断必须符合暴聋(突发性耳聋)的患者。 2.病程4周以内。 3.患者同时具有其他疾病，但在治疗期间不需特殊处理，也不影响第一诊断的临床路径流程实施时，可以进入本路径。

（六）中医证候学观察四诊合参，收集该病种不同证候的主症、次症、舌、脉特点。注意证候的动态变化。（七）入院检查项目 1.必需的检查项目纯音听阈测听检查、声导抗检查；血常规、尿常规、便常规、血压、肝功能、肾功能、血糖、血脂、凝血功能、心电图、胸部X线片。 2.可选择的检查项目：根据病情需要而定，如听性脑干诱发电位检查、影像学检查(CT/MRI)等。（八）治疗方法 1.辨证选择口服中药汤剂、中成药（1）风邪外犯证：宣肺解表，散邪通窍。（2）肝火上炎证：清肝泻热，开郁通窍。（3）痰火郁结证：化痰清热，散结通窍。（4）血瘀耳窍证：活血化瘀，通利耳窍。（5）气血亏虚证：益气养血，通利耳窍。 2.辨证选择静脉滴注中药注射液 3.其他中医特色治疗（1）针灸治疗（2）耳压治疗（耳穴埋籽）（3）按摩治疗（4）中药泡洗技术 4.饮食疗法 5.西医治疗 6.护理调摄要点（九）出院标准 1.听力恢复或提高。 2.无需继续住院治疗的并发症。（十）变异及原因分析 1.病情加重，需要延长住院时间，增加住院费用。 2.合并有心血管疾病、内分泌疾病等其他系统疾病者，住院期间病情加重，需要特殊处理，导致住院时间延长、费用增加。 3.治疗过程中发生了病情变化，出现严重并发症，退出本路径。 4.因患者及其家属意愿而影响本路径的执行时，退出该路径。

什么是耳聋基因检测

什么是耳聋基因检测我国有两千多万聋哑人，其中遗传性耳聋占50%以上。遗传性耳聋多为隐性遗传病，即夫妻双方均为携带者时，自身听力正常，但子女有25%的机会为聋儿；而仅当夫妻中一方为携带者时，子女听力不受影响。目前正常人群中携带遗传性耳聋突变基因的比例是5-6%，因此听力正常的夫妻生出聋儿的现象时有发生，新生儿中耳聋发病率已达1-3‰。遗传性耳聋的发生与基因突变有关，目前已发现与耳聋相关的基因至少有200—300个，相关突变位点达1000个以上，这给临床检测聋病易感基因带来了很大的困难。而对中国人而言，80%的先天性耳聋患者其致病基因为：GJB2基因235delC、SLC26A4基因919-2 A>G、线粒体12Sr RNA基因1555A>G和1494C>T。进行这四种基因的检测，可以明确大部分遗传性耳聋的原因。进行耳聋基因检测，对于个人、家庭及下一代都十分重要。（1）避免“一针聋”：原本听力正常的人，在使用抗生素药物后，出现听力下降或者耳聋俗称“一针聋”。既往人们不知道是什么原因引起，现已经明确是由携带线粒体基因被氨基糖甙类药物损伤所致。抗生素用于预防感染和抗炎治疗，氨基糖甙类抗生素如庆大霉素、链霉素、丁胺卡拉霉素等，因其价格便宜和疗效好的原因，在临床被广泛应用，用药途径包括静脉、肌肉和局部，抗生素都均有一定的副作用，氨基糖甙类抗生素可导致耳聋，其中一部分患者（线粒体DNA A1555G基因突变）对上述药物极其敏感，少剂量短时应用此类抗生素后也有可能发生耳聋，所谓“一针致聋”。在用药前进行耳聋基因检测是非常必要的。除了明确耳聋的病因，尚可指导携带线粒体DNA A1555G基因突变但未发病母亲家族中的亲属用药，避免他们因使用氨基糖甙类药物也发生耳聋的悲剧。（2）减缓耳聋的发展。 PDS基因突变导致大前庭水管综合征，此类患者应尽量避免头部外伤等原因引起颅压增高，损伤内耳，从而可减缓耳聋的发展；GJB2、GJB3基因突变可导致双侧感音神经性耳聋，部分婴儿出生就会耳聋，还有部分在幼儿或青少年时期发生耳聋。 ????