westernblot原理及步骤

Westernblot原理及步骤

原理：

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

操作步骤：

蛋白质样品获得：

1、所需试剂：

(1)蛋白酶抑制剂mix：

hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度

*PMSF（溶于乙醇）100mM25ul50uM

*Trypsin Inhibitor1mg/ml250ul50ug/ml

*EGTA（pH8.0）0.5M80ul8mM

*EDTA（pH8.0）0.5M10ul1mM

Aprotinin1mg/ml25ul5ug/ml

Pepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml50ul10ug/ml

Leupeptin5mg/ml100ul0.1mg/ml

Benzamidine100mM250ul5mM

NaF5M250ul250mM

NaVO4（FW183.8）0.2M25ul1mM

注意：*代表必须加的试剂

(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。

配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。

（3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入）

也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)； 100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)

2、细胞裂解步骤：

将所有的样品放在冰上

（1）4℃离心5min沉淀细胞

（2）去掉上清

（3）将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中

（4）转到离心管中

（5）4℃离心5min，

（6）（除去样中微量血清）

（7）除去上清

（8）置细胞沉淀于冰上

（9）每107cells加裂解工作液100ul

（10）轻轻重悬细胞沉淀

（11）置冰上20min

（12）13000rpm离心15min

（13）4℃

（14）将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）

（15）取出1ul

（16）用于Bradford测定

（17）液氮速冻样品

（18）-20℃保存

3、组织裂解：

（1）3ml冰冷的RIPA缓冲液匀浆1g组织,每克组织加30ul 10mg/ml PMSF

（2）所有步骤均在4℃下进行,匀完浆后冰上放置30min.，4℃10000×g离心10min，取上清（如果无法沉淀，请加大离心力，操作40min 之后需要再加PMSF，加量同1，如信号转导、转录因子类蛋白易降解，可添加Aprotinin、Benzamidine、NaVO4等蛋白酶抑制剂）；有些蛋白可能存在于沉淀中（Triton不可溶的蛋白多数是SDS加热可溶的），因此要保留沉淀，沉淀用RIPA清洗几次后，保存，电泳

前变性处理时要额外加入 SDS，因为沉淀蛋白多数是SDS加热可溶蛋白。）加热100°5分钟直到变性，－20°冰箱保存。

4、培养细菌：

细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g 离心15min。取上清液作为样品。