生化试剂的基础知识
生化试剂得基本知识
一、生化试剂得分类 (2)
(一) 按照化学性质分类 (2)
(二)按照临床应用分类2
二、反应速度特性 (2)
(一) 终点法试剂 (2)
(二)动力学法试剂3
三、显色原理 (4)
(一)NAD—NADH与NADP-NADPH系统 (5)
(二) p-NP与p-NA系统 (5)
(三)H2O2偶联得指示系统5
(四) 抗原抗体反应指示系统 (5)
(五) 其它显色反应 (6)
四、性能评价方法 (6)
(一)主要性能指标:6
(二)性能评价方法 (6)
一、生化试剂得分类
(一)按照化学性质分类
1.酶类:包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α—HBDH,LDH,CK,CK—MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE
等。
2.底物/代谢产物类:包括TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,
CO2等.
3.无机离子类:包括Ca,P,Mg,Cl等。
4.特种蛋白类:包括apoAl,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子),IgG,IgA,IgM等。
(二)按照临床应用分类
1.无机离子:包括Ca,P,Mg,Cl等。
2.肝功能:包括ALT,AST,r—GT,ALP,MSO,T-Bil,D—Bil,TBA,TP,Alb等.
3.肾功能:UA,UREA,Cr等。
4.心肌酶谱:CK,CK—MB,LDH,α-HBDH,AST,MSO。
5.糖尿病:GLU等。
6.前列腺疾病:ACP,p-ACP等.
7.胰腺炎:α-AMY.
8.血脂:TC,TG,HDL-C,LDL—C,apoA1,apoB,Lp(a)。
9.痛风:UA.
10.有机磷中毒:ChE。
11.免疫性疾病:C3,C4,PFB(B因子),IgG,IgA,IgM,Kappa链,Lambda链。
二、反应速度特性
按照反应速度,可以分为终点法试剂与动力学试剂。而动力学试剂又可再分为零级动力学法与一级动力学法。
(一)终点法试剂
终点法,指经过一段时间(一般为几分钟)得反应,反应进行到完全,使全部底物(被测物)转变成产物,称终点法,更确切地说应称平衡法,这就是最理想得分析类型。如图(1)。
整个反应达到平衡,由于正向反应得平衡常数很大,可认为所有得被测定物已转变为产物,反应液得吸光度不再增加(或降低),吸光度得增加(或降低)程度与被测定物得浓度成正比.
终点法对反应条件(如酶量、pH、温度)小得改变不敏感,只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可,就是最理想得反应模型。
图(1)
属于终点法得试剂主要有:
TG,TC,HDL-C,LDL—C,UA,Glu,TP,Alb,T-Bil,D—Bil,Cr(氧化酶法),NH4+,CO2 ,Ca,P,Mg,Cl , apoA1,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子),IgG,IgA,IgM等.
(二)动力学法试剂
1.零级动力学法
零级动力学法,指反应过程中反应速度维持不变,达到最大,与底物浓度无关,因此,在整个反应过程中,反应物可以匀速地生成某个产物,导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加,减小或增加得速度(△A/min)与被测物得活性或浓度成正比,主要用于酶活性得测定。如图(2)。
实际上,由于底物浓度不可能足够大,随着反应得进行,底物消耗到一定程度后,反应速度不再维持不变,同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间。因此,零级动力学法就是针对特定时间而言得,各试剂商对这段时间有严格规定。
图(2)
属于零级动力学法得试剂主要有:
ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α—HBDH,LDH,CK,CK—MB,α—AMY,MSO,ADA,ChE ,TBA等. 2.一级动力学法
在一定得反应时间内,反应速度与底物浓度得一次方成正比,由于底物在不断得消耗,因此整个反应得速度在不断得减少,表现为吸光度得增加(或降低)速度越来越小,这类反应达到平衡得时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,必需在特定时间段内进行监测,各试剂商对这段时间有严格规定。如图(3).
在一固定时间间隔中,底物浓度得变化量正比于底物得初浓度,这就是一级反应得同性。该段时间内吸光度得增加或降低与被测物得浓度成正比。
图(3)
属于一级动力学法得试剂主要有:
Cr(苦味酸法),UREA(紫外监测法)
三、显色原理
显色系统主要有以下几种:
?NAD-NADH与NADP-NADPH系统
?p—NP与p—NA系统
?H2O2偶联得指示系统
?抗原抗体反应指示系统
?其它显色反应
(一)NAD—NADH与NADP—NADPH系统
NADH与NADPH在340nm有特征性吸收峰,而NAD与NADP在340nm无特征性吸收峰,利用其偶联得脱氢酶(工具酶)反应,根据340nm吸光度得变化,可以测定物质得浓度或活性。
作为该指示系统常用得工具酶有LDH、MDH、GLDH与G6PDH
目前利用此指示系统进行测定得临床项目有:ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α—HBDH 、Glu、UREA、NH4+ 、CO2等。
(二)p-NP与p—NA系统
p-NP与p—NA在405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度得变化,可以测定物质得浓度或活性.
目前利用此指示系统进行测定得临床项目有ALP、ACP、r-GT、AMY等。
(三)H2O2偶联得指示系统
H2O2在过氧化物酶得作用下,可使单一个或成对得无色得色素原氧化成有色得色素,导致某一波长吸光度得增加,因此可用来测定物质得浓度或活性
用于此指示系统得单一色素原有TMB、ABTS等;成对色素原有酚与4AA、MBTH与DMA 等。
目前利用此指示系统进行测定得临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL—C、Glu、Cr、UA等。
(四)抗原抗体反应指示系统
特异性抗体与抗原(待测物质)在相应得缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物,形成一定得浊度,导致特定波长透光率得改变。在抗体过剩得前提下,改变程度与抗原浓度成正比。
目前利用此指示系统进行测定得临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。
(五)其它显色反应
蛋白质中得肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,在一定浓度范围内颜色反应强度与蛋白质得浓度成正比。用于TP得测定.
溴甲酚绿(BCG)在非离子去污剂Brij-35得存在下,可与白蛋白形成紧密结合得绿色复合物。用于Alb得测定。
重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素。用于总胆红素与直接胆红素得测定。
甲基麝香草酚兰(MTB)在碱性条件下可与Ca、Mg形成有色络合物。用于Ca、Mg得测定。
四、性能评价方法
(一)主要性能指标:
1.稳定性:指在规定条件下经过一段时间得保存,仍能达到相应得性能指标,如试剂空白
吸光度、线性范围、灵敏度等。
2.反应灵敏度:指单位浓度(或活性)得测定物反应所产生得反应度,反应度越高,灵敏度越
大。
3.精密度:结果间相互符合得一致程度
4.准确度:与参考测定程序结果得一致性
5.线性范围:在规定得重复性与线性偏差下,测得得浓度或活性值与设定得浓度或活性值之
间得比例关系得范围。
6.基质效应:基质指得就是样品中被分析物以外得组分.基质常常对分析物得分析过程有显
著得干扰,并影响分析结果得准确性。例如,溶液得离子强度会对分析物活度系数有影响,这些影响与干扰被称为基质效应(matrix effect).
7.抗干扰性:
8.其它:试剂/样本比例、反应时间、价格等。
(二)性能评价方法
1.稳定性:连续观测,每日试验;热加速试验。
2.反应灵敏度:直接计算单位浓度反应物得吸光度变化或变化率.
3.精密度:按照NCCLS EP5—A进行。
4.准确度:按照NCCLS EP9-A2 进行。
5.线性范围:按照NCCLS EP6—A 进行。
6.基质效应:通过回收试验确定
7.抗干扰性:按照NCCLS EP7—A进行。