免疫荧光抗的选择
免疫荧光抗的选择
免疫组化/western blot/免病荧光如何进行二抗的选择
2010-05-26 17:20:12| 分类：默认分类|字号订阅
在讲二抗的选择之前，我们有必要对抗体（也就是免疫球蛋白）的基本结构等基本知识进行必要的了解。
免疫球蛋白，包括IgA, IgD, IgE, IgG 和IgM五种，其各自来源及特点如下：
Name
Types
Description
IgA
2
Found in mucosal areas, such as the gut, respiratory tract and urogenital tract, and prevents colonization by pathogens. Also found in saliva, tears, and breast milk.
IgD
1
Functions mainly as an antigen receptor on B cells that have not been exposed to antigens. It has been shown to activate basophils and mast cells to produce antimicrobial factors.
IgE
1
Binds to allergens and triggers histamine release from mast cells and basophils, and is involved in allergy. Also protects against parasitic worms.
IgG
4
In its four forms, provides the majority of antibody-based immunity against invading pathogens. The only antibody capable of crossing the placenta to give passive immunity to fetus.
IgM
1
Expressed on the surface of B cells and in a secreted form with very high avidity. Eliminates pathogens in the early stages of B cell mediated (humoral) immunity before there is sufficient IgG.
其中，IgD, IgE, IgG是单体结构，IgA是二聚体结构，IgM是五聚体结构
各种抗体共同的基本结构都包括2条轻链和2条重链，Fab和Fc段如图所示
Schematic diagram of the basic unit of immunoglobulin (antibody)
Fab
Fc
heavy chain (consist of VH, CH1, hinge, CH2 and CH3 regions: from N-term)
light chain (consist of VL and CL regions: from N-term)
antigen binding site
hinge regions
(*) -S-S- mean disulfide bonds.
通过以上的阅读，我们已对抗体的基本结构了解了，接下来我们便来谈谈如何选择二抗了。
1. 确定你一抗的种属来源，此处要与种属反应性相区别。种属来源在英文中也即host Species，就是抗体从什么动物体内获得的；种属反应性即reactivity species, 比如我们的实验标本是小鼠，我们买的一抗必然是抗小鼠的，那么小鼠便是抗体的种属反应性；但该抗体有可能是兔抗小鼠或者羊抗小鼠，那么这里的兔或羊便是一抗的种属来源。以兔抗小鼠为例
2. 确定你一抗的类型，一般是IgG, 但也有IgM等类型，以IgG为例
3. 根据以上两点,我们便可以判定本例中我们要买的二抗便是抗兔的IgG
4. 二抗的标记物：这要根据你的应用了，一般有HRP，AP，BIOTIN，各种荧光素如FITC等等。
5. 拉下来，出现了更复杂的问题，我们查试剂公司的目录，发现即使是同一种标记物如HRP，二抗的种类也太多了，有Anti-IgG（H+L）Anti-IgG (Fc chain)，Anti-IgG-F（ab’）2，Anti-IgG（Fab）等。具体有以下几种，我们在此详细讲一下：
先看一下
图，以IgG为例，IgG经木瓜蛋白酶消化后，形成了Fc片段和2个独立的Fab片段，
再看一下幅图，以IgG为例，IgG经胃蛋白酶消化后，形成了Fc片段和F（ab’）2片段，从图中可以看出F（ab’）2是指两个Fab片段连在一起。
l Anti-IgG，Fc fragment specific 此种抗体只和IgG重链的Fc片段反应，每一种抗体均经过抗F（ab*）的吸收。有些抗体还另外进行了去除IgM和IgA的吸收处理，这种抗体的标记为“Anti-IgG（Fc）”
l Anti-IgG, F（ab’）2 fragment specific 此种抗体只和F（ab’）2/Fab反应，因为F（ab’）2包含免疫球蛋白的轻链，所以此抗体会和含有相同轻链的其它抗体反应。
l Anti-IgG（H+L）此种抗体可以和IgG分子的重链和轻链同时反应，即与F（ab’）和Fc 均可反应，同时因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链（k或l），所以也可识别同一种属的其他类的免疫球蛋白，如IgM、IgA等。
都明白以上的意思了吧，那么，我们还需再回过头来，看看我们的一抗抗体是整个IgG抗体分子”还是抗体分子的F（ab’）片段或Fab片断，这样便要根据不同的情况来选择我们的二抗了，具体如下：
Anti-IgG（H+L）Anti-IgG (Fc chain)，Anti-IgG-F（ab’）2，Anti-IgG（Fab）这四种二抗，后两者由于去除了抗体的Fc段，可以避免与细胞表面的Fc受体结合而干扰检测结果。可采用二抗来源的动物血清进行封闭，也可封闭Fc受体。但需要注意的是千万不要用一抗来源的动物血清作为封闭液。
另外，针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG，因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分，会增加背景染色和降低抗体的效价。上句话有点难明白哈，简单点说就是，如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不要用
牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景染色增加和抗体效价降低。
6，等会，还没完事呢，还有一些复杂的，那就是IgG的亚型了，比如说我们想买一支HRP标记的羊抗大鼠的二抗，搜索出来一看，这么多，如下：
Goat anti-Rat IgG1 Antibody HRP Conjugated
Goat anti-Rat IgG2b Antibody HRP Conjugated
Goat anti-Rat IgG2c Antibody HRP Conjugated
……
这就又提醒我们，还一定要注意一抗抗体的IgG亚型。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
时间分辨技术的原理
时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术： 1、时间分辨原理： 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 2、时间分辨原子标记物的特点： ●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 原子标记与大分子标记物的对比 3、波长分辨： ●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱， 有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 ●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的 干扰，增强测量的特异性。
4、时间分辨： ●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧 光物质对检测结果的影响。 ●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值， 有利于提高检测的准确性。 时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！ RIA（放免） ●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消， 如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。 ●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。 ●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准 曲线无法保存备用。 ELESA（酶免） ●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 ●酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的 TRF技术与电化学发光的比较
酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg
酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg 陈桂花1a，谭玉华2，罗颖照1b（1.广州经济技术开发区红十字会医院，a检验科,b体检中心，广东广州 510530 ；2.广州市丰华生物工程有限公司，广东广州 510730） 摘要：目的比较2种方法4种试剂乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的检测性能，并探讨HBsAg阳性HBV血清标志物（HBV M）模式组间及其与HBsAg阴性模式组间的HBsAg 浓度差异。方法酶联免疫法（ELISA）对1205例标本HBV M进行定性检测。其中定性检测的153例标本再用3个厂家的时间分辨荧光免疫法（TrFIA）定量测试试剂进行HBsAg比对检测，其余经定性检测的1052例标本均再用TrFIA定量测试试剂进行HBsAg定量检测，对HBsAg结果进行统计分析。结果 2种方法4种试剂间HBsAg阳性检出率差异均无统计学(P>0.05)，3个厂家的TrFIA法试剂HBsAg定量检测结果相关性良好，r>0.95。TrFIA法能对0.2ng/ml—1.0ng/ml的低浓度HBsAg标本进行有效检测。研究发现TrFIA法定量检测未经稀释的HBV感染者血标本HBsAg浓度在0.2ng/ml—650ng/ml间。“HBsAg、e抗原（HBeAg）、核心抗体（抗-HBc）”阳性模式组HBsAg浓度与“HBsAg、抗-HBc”阳性、“HBsAg、e抗体（抗-HBe）、抗-HBc”阳性、“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组和“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组间HBsAg浓度差异无统计学意义(P>0.05)，“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组、“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组HBsAg 浓度与“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg”单阳性模式组和“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg阳性模式”组HBsAg浓度与“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HBsAg 出现的早晚和它被清除的早晚与感染剂量、感染方式以及病情轻重有关。HBeAg或抗-HBe 的出现与HBsAg的浓度呈一定的关系，HBsAg浓度与病毒的复制存在一定的关系。ELISA法HBV M定性检测结合TrFIA法HBsAg定量检测对HBV感染诊断和防治具有重要意义。 关键词：酶联免疫法；时间分辨荧光免疫法；乙型肝炎病毒，表面抗原 HBsAg是HBV感染后血清中首先出现的标志物HBV M，可作为乙肝的早期诊断和普查项目。HBsAg的检测受到许多研究者的关注[1-6]，随着标记免疫方法学的飞跃发展，HBsAg检测的灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为临床诊断提供了更多的信息。作者采用了1个厂家的ELISA法定性诊断试剂与3个厂家的TrFIA定量测试试剂对HBsAg 进行了比对检测，结果与分析如下。 一材料与方法 1. 标本标本采自广州市经济技术开发区红十字会医院门诊病人、住院病人和体检人员标本1205例，及时分离血清，-20℃保存备用。 2. 仪器与试剂 ST-360 型酶标仪（上海科华公司），酶联免疫法乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（国药准字S1*******，上海荣盛公司）；Victor2-D1420时间分辨荧光免疫仪（美国PE公司）；时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒表面抗原定量测试试剂盒[国药准字S2*******，广州丰华公司；国药准字S2*******，苏州新波公司；国食药监械（准）字2007第3401095号，中山大学达安公司]；DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机和FWZ-Ⅱ型恒温微量振荡仪（广州丰华公司）。 3. 方法 ELISA法与TrFIA法均严格按试剂盒和仪器说明书操作。ELISA法对以上1205例标本进行定性检测，按说明书结果判断方法判读阴阳性，对弱阳性的HBV M、“HBsAg、抗-HBs”或“e抗原、e抗体”双阳模式的HBVM均须2孔复查，仍为阳性者判为阳性。其中定性检测 作者简介：陈桂花，女，1974年9月生，本科，检验技师，主要从事免疫学检验工作。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
免疫荧光方法
（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠
血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测 量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 化学发光免疫分析技术（CLIA） 各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛 1.多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。 2.病原体抗原/抗体 3.病毒性肝炎标志物 4.肿瘤相关抗原 5.药物 6.核酸 优缺点
时间分辨荧光免疫技术和酶联免疫吸附试验检测抗-HCV结果分析
时间分辨荧光免疫技术和酶联免疫吸附试验检测抗-HCV结果分析 发表时间：2015-10-09T16:57:53.750Z 来源：《医药前沿》2015年第21期供稿作者：陈华根刘小花宋强 [导读] 成都市新都区人民医院四川成都 HCV-RNA检测对于判断急慢性感染、复制水平、明确诊断和疗效观察具有重要意义，但受实验条件限制，难以常规应用。 陈华根刘小花宋强 （成都市新都区人民医院四川成都 610500） 【关键词】时间分辨；荧光免疫技术；酶联免疫吸附试验；抗-HCV 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0081-02 丙型肝炎的病原体是HCV,主要经血液传播[1]。HCV有6种基因型，感染人体后，血液中出现抗-HCV,而HCV-RNA浓度相对较低，所以临床实验室常通过检测抗-HCV来判断HCV感染，诊断丙型肝炎[2-3]。可用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光、凝集试验、金免疫层析试验等检测，应用广泛的ELISA检测抗-HCV灵敏度，准确度能满足临床诊断丙型肝炎需要，但缺乏全自动酶免疫分析仪的实验室却显繁琐。近年来，时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)逐步在临床实验室用于抗-HCV检测，我们利用TRFIA检测，同时与ELISA方法比较，评价其检测效果，报道如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 收集本院2013年至2014年经ELISA检测抗-HCV阳性标本299例，其中男163例，女136例，年龄18至89岁。 1.2 方法 1.2.1试剂、仪器和质控品抗-HCV ELISA试剂分别购于厦门新创公司，MK3酶标仪和Well Wash Plus型洗板机系上海热电产品。TRFIA试剂、前处理仪和荧光测定仪购于苏州新波公司。质控品购于北京康彻思坦公司。仪器皆经过维护校准且通过技监局年度强检，质控品和试剂在效期内使用。 1.2.2方法采集患者静脉血3～5ml,自然收缩或37℃温育30分钟后，3000转/分离心15分钟，立即检测或置冰箱2℃～8℃保存2日。严格按照标准作业指导书操作。厦门新创公司ELISA检测阳性者，再用TRFIA检测。 2.结果 ELISA检测抗-HCV阳性299例，经TRFIA检测阳性299例，符合率100%。 3.讨论 丙型肝炎是由丙肝病毒所致的流行广泛，危害严重的传染性疾病。病原体检测是疾病诊断必不可少的手段，病原体诊断标志是抗-HCV 和HCV-RNA。HCV-RNA检测对于判断急慢性感染、复制水平、明确诊断和疗效观察具有重要意义，但受实验条件限制，难以常规应用。抗-HCV ELISA检测，仅需洗板机、酶标仪等一般实验设施，并且现在所用第三代试剂，所选抗原包括C区、NS3区、NS4区和NS5区，提高了检测的灵敏度和特异性，缩短了“窗口期”，反应性样本可不用重组免疫印迹试验（RIBA）验证，因此ELISA检测抗-HCV是各级实验室运用最多的丙型肝炎病原标志检测项目。但实验类型多采用间接二步法，检测周期较长。虽然选用抗原，试剂工艺有所改进，但酶免疫检测结果，受类风湿因子、补体、异嗜性抗体、用鼠抗诊疗诱导产生的抗鼠抗Ig、自身抗体、溶菌酶等内源性影响因素和溶血、细菌污染、标本收缩不充分、存贮过久、反复融冻等外源性影响因素干扰难以完全避免[4]。通过利用TRFIA法检测299例ELISA法检测抗-HCV阳性结果完全一致，说明利用TRFIA检测抗-HCV准确可靠，且智能化程度较高，值得推广应用。 【参考文献】 [1] 李梦东主编.实用传染病学[M].第2版.北京：人民卫生出版社.2000年，127-134. [2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝脏病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，16(8)：324-329. [3] 李金明主编.临床酶免测定技术[M].北京:人民军医出版社，2008：87-90. [4] 黄学斌,陈华根,刘冰.金免疫层析试验检测丙型肝炎抗体应用评价[J].检验医学与临床，2009,6（18）：1531-1532.
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
免疫荧光双标法
免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈
免疫荧光技术的实验方法及其分类模板
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮, 检测产物发出的荧光, 荧光强度与Mb浓度呈正比, 可在 8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好, 线性范围宽, 具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例, 首先将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。除去未结合抗体, 然后加受检标本, 使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物, 接着加入荧光标记的抗体, 使之与抗原特异性结合, 形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度, 即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大, 时间分辨荧光免 疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕, 作为标记物, 加入正常液后激发测定, 能有效去除短寿命本底荧光的干扰。 2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原, 竞争性地与抗体结合, 形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物, 并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后经过离心沉淀等方法, 将抗原—抗体复合物与游离抗原分离, 分别测定其放射性强度与标准曲线比较, 即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强, 可准确定量到 ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦, 耗时长, 且有放射性污染。近年来, 随着单克隆抗体的应用, RIA的灵敏度又有了较大提高, 且操作大为简化, 并已有商品试剂盒供应, 使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立, 该法的最低检测限为10μg/L, 线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高, 特异性强, 精密度好, 操作简单, 适用于多份标本的检测, 不需特殊仪器设备等优点, 易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版
新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版 IBMT standardization office【IBMT5AB-IBMT08-IBMT2C-ZZT18】
新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制 谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情 （广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ） 摘要：目的利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。方法采用了一株TSH单克隆抗体用于固相包被，另一株TSH单克隆抗体用于标记铕（Eu3+），固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测Neonatal TSH。结果自建的Neonatal hTSH TrFIA法灵敏度高可达2.28μU/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。与hLH、hFSH、HCG无明显交叉反应。分析内或分析间质控结果在靶值±25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数(CV)分别为7.12%和6.09%，7.82%和7.03%。与DELFIA ? Neonatal TSH试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为1.05。与DELFIA ? Neonatal TSH试剂比对试验符合率一致，相关性系数r可达0.9822。试剂盒室间质评能力比对成绩100%。结论自建的Neonatal TSH TrFIA法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。 ?基金项目：科技型中小企业技术创新基金（08C26114411281），广州市科技计划项目（2006V42C0051）。 作者简介：谭玉华，1980年10月，男，医学学士，检验技师，主要从事标记免疫试剂的研发、应用和医学检验工作。 Email:tanywhy@https://www.360docs.net/doc/a711680503.html,
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 Newly compiled on November 23, 2020
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,),是将具有高灵敏度的测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、和之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺 (1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinimester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 （CLIA）
时间分辨荧光CRP-poct试纸条的设计
时间分辨荧光CRP-POCT 试纸条的设计 本试剂条内部采用侧向流免疫层析的三明治方法，装置包括一个样品垫、一个结合物释放垫、一个反应膜和一个吸收垫（图1）。其中样品垫用于加样（血清或全血）；结合物释放垫中含过量的CRP 抗体A 和Eu 的复合物(α-CRPA-Eu)；反应膜上有两道线：检测线，又称T 线:，含过量的CRP 抗体B(α-CRPB)；对照线，又称C 线，含定量的CRP 抗体A 的抗体（α-α-CRPA ）。 在测试中，血清样品在试纸条的毛细管 作用带动下流经结合物释放垫，血清中的 CRP 在此与CRP 抗体A-Eu 复合物结合，形 成CRP-抗体A-Eu 复合物（图2-A ），并在 流经反应膜上的捕获线时被捕获分子（CRP 抗体B ）结合，形成抗体B-CRP-抗体A-Eu 的三明治复合物，产生T 线信号（图2-B ）。 而结合物释放垫中过量的CRP 抗体A-Eu 复合物在流经反应膜上的捕获线时不能被捕获分子捕获，越过捕获线继续前行。当到达对照线（C 线）时，被其抗体捕获，产生C 线信号（图2-C ）。将T 、C 线进行整合，去除信噪比后，即可判定血清中CRP 的含量（图3）。 图1 ：CRP-POCT 试纸条的结构 1=样品垫，2=结合物释放垫，3=检测线，4=反应膜， 5=对照线，6=吸收垫 图2：铕标记的CRP 抗体与CRP 及本身抗体的结合 A. CRP 抗体A 与CRP 在结合物释放垫上结合； B. CRP 抗体A 与CRP 的结合物在T 线处与CRP 的另一抗体B 结合，被捕获于T 线； C. CRP 抗体A 与其本身的抗体被捕获于C 线 图3：时间分辨荧光CRP-POCT 试纸 条的检测结果
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点概念 优缺点
优点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?单个样本检测速度快，适合做急诊； ?灵敏度较高； ?自动化程度高； 时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） ?发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ?长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ?半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 ?荧光寿命长，易于自动化 ?重复性好 ?标准曲线范围宽 ?结果可靠 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的缺点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?发光过程短 ?本底较高 ?仪器故障率较高 ?试剂稳定性差 ?检测精度不高 试剂价格高 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA） ?测量方式复杂 ?仪器成本及维护费用高 ?环境及样品中同元素可导致本底干扰等 类型原理及试剂发光类型 化学发光免疫分析（CLIA）用化学发光物质直接标 记抗原或抗体组成 吖啶酯 （acrydinum esters） 时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）* 是用三价稀土离子及其 螯合剂作为示踪物 铕（ Eu3+ ）、铽（ Te3+ ） 及钐（ Sm3+ ）、镝 （ De3+ ） 化学发光与时间分辨荧光方法学比较 化学发光时间分辨荧光发光效率1% 95%
重复检测不可重复可无数次重复 本底噪声干扰大零本底 灵敏级数10 -15 10 -18 标记物大分子化合物原子 标记位点1个/抗体可达20个/抗体 标准曲线稳定2~4周稳定达一年以上 多标记无有，最多可达四个标记科研开发无有 化学发光免疫技术原理图 时间分辨免疫技术原理图
不用爬片的免疫荧光实验方法-雷萌生物
【ibidi--focus on cells】通道载玻片--新的免疫荧光方法 细胞的免疫荧光实验是一个基础的细胞实验，传统的方法是在培养板中放入预先处理好的盖玻片，待细胞贴壁后，使用镊子将盖玻片拿出再开始进行固定，染色等系列工作。 现在分享一种简便的免疫荧光方法，无需爬片，培养-操作-镜检，在一个培养皿/载玻片上完成所有工作！一气呵成！ 使用如图的培养皿和载玻片，免疫荧光步骤将简化为： 1.直接细胞培养 2.冲洗玻片/培养皿 3.固定细胞 4.冲洗玻片/培养皿 5.染色 6.冲洗玻片/培养皿 7.冻存液处理细胞 8.直接镜检观察 免去了指甲油封片的传统免疫荧光方法中的冗长步骤： 1.无需对盖玻片和载玻片消毒灭菌 2.无需对盖玻片进行包被 3.无需等细胞爬片 4.无需指甲油封片 之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于高端显微镜比如共聚焦显微镜。 成像效果：
下面再分享一种极致的免疫荧光方法，不仅更加简化实验步骤，而且可以节约试剂和细胞，同时还能得到更出色的成像效果。 如图的ibidi通道载玻片，简单快速完成免疫荧光实验。 步骤：培养-固定-染色-镜检，只需在这个载玻片上进行4个步骤，免疫荧光实验轻松完成~ 优点总结： 1、节约细胞和试剂 ibidi通道载玻片里的通道只有400μm高，以μ-slide VI为例，通道的容积只有30μl，而普通8well的腔式载玻片一个孔的容积有300μl。这意味着通道需要的试剂和细胞量仅需约十分之一！对于非常珍贵的细胞和试剂来说，这可是非常重要的。 2、成像效果好 使用通道载玻片时，能在相差显微镜下获得更好的成像效果。因为通道上下都是平坦的，不会因为凹液面的折射现象影响到相差显微镜成像。而well式的开放小室的相差成像会受到培养皿盖和液面的折射现象影响。