利用不同的方法筛选和鉴定转化子

利用不同的方法筛选和鉴定转化子

摘要:通过使用不同的方法，从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子，之后用菌落PCR对其中的重组子进行进一步鉴定，最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出来的菌株并没有表达出GFP，需要挑选其他菌落继续实验。

关键词:蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测

前言

我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组，作为载体的质粒，我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒，前者有利于基因顺利导入到受体细胞，后者方便我们对转化产物进行筛选；对于受体细胞，我们所选择使用的大肠杆菌，具有遗传背景清楚，结构简单，表达效率高，容易获取等优点，已经建立起一套完善成熟的表达系统，是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。

GFP自从发现以来，已经获得了广泛充足的应用，是生物领域的重要材料绿。绿色荧光蛋白本身无毒，且不需要其他辅酶或者反应底物，在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光，而且有较好的稳定性，当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时，该蛋白质既能保持原有活性，发光能力也不受影响，这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一起，将GFP作为荧光标签，对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和观察，因为这种特性，绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点，已经在生物研究中获得广泛的应用。

我们已经通过一系列的实验操作，获取GFP基因，用PCR技术将其扩增并连接到载体质粒pMD19-T Vector上，用CaCl2法将其转入到大肠杆菌中，经过本次实验的筛选和鉴定，构成了完整的转基因操作流程，将我们的课堂学习和实际操作结合起来，从而对转基因技术有一个最直接的认识。尽管在当下中国，转基因技术备受争议，但是每一名生物专业的学生，都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就，并看到其广泛的应用前景和巨大的市场潜力，同时将所学习到的关于转基因知识科普出去，让每一个公民都能科学、正确地认识转基因，理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去，推进我国生物科学技术的发展。

一、材料、试剂和器具

1.材料

转化菌液：经过转化操作的E. coli DH5α菌株(R-，M-，Amp-或者含pMD19-T Vector) 2.试剂

含氨苄青霉素(Amp, 100mg/L)的LB固体培养基、LB液体培养基、X-gal（200mg/ml）储存液、IPTG储存液（20mg/ml）、10×PCR buffer 、rTaq 酶、dNTP mixtures（dATP，dTTP，dGTP，dCTP）、无菌蒸馏水、1.5% 琼脂糖凝胶、矿物油、DNA maker、1×10 Loading Buffer 引物溶液(P1、P2各10μM)

P1:GFP-F: 5'-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'(Tm=65.5℃)(Sal I)

P2:GFP-R: 5'-GCGTCTAGA TTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'(Tm=61.5℃) (XbaI)

3.器具

超净工作台、涂布器、无菌牙签、PCR管、移液枪、移液管、离心机、PCR仪、天秤；灭菌锅；琼脂凝胶电泳系统；紫外照射摄像系统；恒温振荡培养箱；蓝光手电筒

二、实验步骤

1.蓝白斑筛选

1.1筛选培养基的准备

在制备好的含100 mg/L Amp的LB平板表面中央位置分别加入40μl X-gal储存液和4μl IPTG储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。

1.2菌落筛选培养

取500 μl复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，37℃培养过夜。

1.3结果观察

观察平板，是否有蓝色和白色菌落，分别计数，白色菌落即为重组子。

2.菌落PCR

2.1挑菌

选择大小合适，最好周围有蓝斑的白色菌落5个，编好号码之后，小心地刮取一半，

分别涂抹于对应的1.5mLPCR管底部。

2.2配制PCR反应体系

先按下列试剂于PCR管中配制50μL的PCR反应体系总液

10 × PCR buffer 5μL

dNTP mixture 4μL

前向引物(P1) 2μL

反向引物(P2) 2μL

rTaq酶0.5μL

灭菌蒸馏水36.5μL

所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，然后取10μL分别分装到涂抹有菌落的PCR管中，稍离心后，加入10μL矿物油，

2.3 PCR反应

PCR仪设置参数如下：

94℃2 min

94 ℃30sec

61 ℃30sec40 cycles

72 ℃45sec

72 ℃ 5 min

2.4琼脂糖凝胶电泳检测

反应结束后，取10μL的PCR产品，加入1μL的1×10 Loading Buffer，混匀后点样，121V电泳15min，紫外照射摄像观察结果，在750bp-1000bp区间有条带产生即为阳性结果。

3.产物表达观察

选择在凝胶电泳中为阳性结果的菌落，将其在蓝白筛选培养基上的剩余部分刮取到LB 液体培养基中，37℃，180 r/min恒温振荡培养过夜，在蓝光照射下观察，培养液有绿色荧光的即为阳性结果。

三、实验注意事项

1、注意无菌操作，接菌的时候应该在超净工作台中进行，培养基需要高压蒸汽灭菌后方可使用，防止杂菌污染；

2、X-gal和IPEG应分别涂抹于LB固体培养基上，由于IPEG存储于有机溶液中，挥发快，应当快速操作，保证分布均匀；

3、配制PCR反应体系时，rTaq酶应该最后加入，减少引物二聚体的形成；

4、加入矿物油是为了防止PCR反应液的挥发，点样时只需抽取下层的PCR反应液，不要吸取到油层。

四、结果和分析

1、蓝白斑筛选结果

图一蓝白斑抗性筛选结果

结果：如图一所示，培养基上有21个白色菌落，2个蓝色菌落

结果分析：使用的E. coli DH5α菌株（Amp-）在含有氨苄青霉素（Amp）的培养基上无法生长，而我们使用的载体pMD19-T Vector上含有氨苄青霉素抗性（Ampr）基因，当载体成功导入到DH5α菌株上形成转化子后，DH5α就能在培养基上正常生长，即长出的菌落的就是含有载体的转化子。

pMD19-T Vector上有具备一个多克隆位点的lacZ基因，能与大肠杆菌发生α-互补，在IPEG诱导下，产生β-半乳糖苷酶，将X-gal分解成蓝色物质，在培养基上生成蓝色菌落；而当我们的GFP基因插入到多克隆位点上时，lacZ基因会被破坏，无法形成α-互补，在培养基上生成正常的白色菌落；即白色菌落就是带有GFP基因的重组子。

X-gal涂抹不均、两个载体连接、lacZ基因的丢失、破坏或者突变都可能导致假阳性结果的产生，因而需要更进一步的鉴定。从中挑选5个白色菌落进行标号，进行菌落PCR。

2、菌落PCR结果

图二菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果

结果：1号泳道在750bp-1000bp之前有清晰的条带，2-4号泳道均无条带产生，但有较严重的拖尾。

结果分析：标号1-5的泳道是我的PCR结果，根据资料，GFP基因大致在800-1000个碱基对左右，可以看到，1号泳道在750bp-1000bp之前出现清晰的条带，同其他组大多数结果一致，说明确实含有GFP基因，对应的1号菌落确实是含有GFP基因的重组子。

其他泳道没有出现条带，说明其对应菌落在蓝白斑筛选上是假阳性，但是同时不排除是PCR反应体系的配制或者操作等的失误导致没有条带出现，因此除了1号菌落外，再任意挑选一个菌落进行摇瓶培养。

拖尾说明存在杂质或者PCR体系存在问题导致DNA降解或者非特异性配对。

3、产物表达的观察

图三GFP表达产物观察

结果：培养基在蓝光照射下无绿色荧光。

结果分析：因为我们使用的TA克隆是不定向克隆，GFP基因可能反向插入，或者基因、启动子被破坏等等其他种种因素导致基因无法正常表达，因此我们需要对最终产物的进行检测，验证基因确实正常、完整地转入到受体细胞，并能正常表达。

导入的GFP基因表达产物是绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein )，在紫外光（395nm）或者蓝光（470nm）的激发下，能产生绿色的荧光（509nm）。两个摇瓶在蓝光照射下均无绿色荧光产生，说明1号菌落中GFP基因是反向插入，或者其他因素导致基因无法正常表达。

四、讨论/小结

由于实验条件、时间等各方面的限制，我并没有从转化子中筛选到能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌，最大可能是菌落PCR得到的结果是一个反向插入的基因，这是一个随机事，并不意味着实验的失败，在实际应用中，我们通常是需要更多的重复实验操作来验证结果。由于我们的目的产物GFP有明显可见的特征，所以可以直接地从产物表达来检测，但是并非所有产物都有这样显而易见的特征，对于重组质粒，实际应用中最常用的是用酶切法和进一步PCR的双重鉴定来确保转入的是我们需要的重组质粒。

参考文献

[1]田长恩主编.生物工程上游技术实验手册[Z].北京：科学出版社，2010.

[2]孙明主编.基因工程(第2版)[Z].北京：高等教育出版社，2013.

[3]李志勇主编.细胞工程学[Z].北京：高等教育出版设，2008.