细胞计数实验步骤

細胞計數

目的：利用血球計數器，測量培養中的活細胞數目。

原理：Trypan Blue是一種常被使用於細胞染色的染劑。Trypan Blue無法穿透活細胞的細胞膜，但是當細胞受傷或死亡，細胞膜破損時，Trypan Blue則可以通透細胞膜進入細胞內，使細胞染成藍黑色。利用此一特點，配合血球計數器的使

用，則可以在顯微鏡底下，分辨出細胞樣本中的活細胞與死細胞，以方便細胞計數。

材料：

1.欲計數的細胞懸浮液

2.染劑Trypan Blue (0.4%)

3.pipetman & tips

4.血球計數器(hemocytometer)

5.單鍵計數器(counter)

6.蓋玻片(coverglass, 22mm×22mm)

7.拭鏡紙(soft lint-free gauze)

8.封口膜(parafilm)

方法：

一、前置工作

1.剪一小片石蠟（parafilm），約1.5cm×5cm。

2.用水清洗蓋玻片以及血球計數器的counting chamber表面，並分別以拭鏡紙

擦拭；再噴70%的酒精於蓋玻片和counting chamber表面之上，等兩者完全

乾燥後，將蓋玻片置於血球計數器之上，使覆蓋住兩個counting chambers。

*注意！不可以用衛生紙擦拭chamber表面，否則會刮壞chamber。

3.以pipetman吸取兩滴各5μL細胞懸浮液，與兩滴各5μL 0.4 % trypan blue，

並分別滴於parafilm上面(見Fig.1)。

4.以pipetman(旋至10μL)將步驟3的一滴細胞懸浮液與一滴trypan blue均勻

混合，再自血球計數器的一端注入chamber內。同樣地，將剩餘兩滴也均勻

混合，自血球計數器的另一端注入。(見Fig.2)

*注意！ a. 不可使細胞停留在染劑中太久，否則細胞容易死亡或受傷。

b. Trypan blue為致癌物質且易揮發，取用完畢，須立即關緊瓶

蓋；若皮膚不小心接觸到染劑，應立即以清水沖洗。

c. 細胞樣本須均勻填滿於chamber內，勿使樣本滿出chamber之外

(不可以超過Fig.2的黑色區域)，但也不能過少。

d. 填入樣本液後，勿使蓋玻片發生滑動，否則易導致兩個chamber

內的樣本液混合。

0.4 % Trypan Blue

圖一、兩滴細胞懸浮液與兩滴trypan blue。

由此處注入

由此處注入

圖二、 Hemocytometer

二、數細胞

1. 將血球計數器置於顯微鏡底下，以10×物鏡觀察，並利用counter 計算活細胞的數目。(活細胞為透明的、無染色；死細胞則為藍黑色)

a.一個血球計數器含有兩個chamber 。每一chamber 中有九個1mm 2的大方格 (Fig. 3)，且chamber 高度為0.1mm ，所以每一個大方格的體積為0.1mm 3。

b.以10×的物鏡先觀察其中一個chamber 的四個角落大方格 (Fig. 3中的N)，並計算此四個大方格中活細胞的總數。再計算另一個chamber 的四大方格內活細胞總數。

* 每一大方格裡，位於邊線上的活細胞數目計算方式，請見Fig. 4。 c.若兩個chamber 的活細胞數目差異大於兩者平均值的20%，則須重新清洗血球計數器、重新注入細胞樣本、重新計算。

d.移除蓋玻片，水洗血球計數器與蓋玻片，並以95%酒精乾燥。

2. 計算原始細胞懸浮液中細胞密度：

81010008

N cell Dilution mL ???= a.N 為每一大方格所得的活細胞數，將8個大方格中的活細胞數目加總起來，除於8，可得每一大方格內的平均活細胞數目。

b. 由於每一個大方格的體積為0.1mm 3，所以將ａ所得的平均數，乘以10，可得每１mm 3內的活細胞數目。

c. 再將ｂ所得的值乘於1000可得每1mL 的活細胞數目。

d. 最後，為了得知原始細胞懸浮液所含的細胞密度(cells/mL)，所以乘上懸浮液被染劑稀釋的倍數。

例如：懸浮液5μL ，染劑5μL ，總共樣本液為10μL ，稀釋倍數為

1025L L

==樣本液μ懸浮液μ，故Dilution 應乘於2。

圖三、 於10×物鏡下，血球計數器的一個chamber 可分為九大方格。

圖四、 每一大方格的周圍皆有三條邊線，計算單一大方格的細胞數時，位於邊線上的細胞計算方式為：以第二條邊線(簡稱中線)為界，接觸到左側中線與上端中線的細胞要算，接觸到右側與下端中線的細胞則不列入計算。如上圖，若每一個圓圈皆代表活細胞，空心的要算，而實心的不算。