实验一 微生物培养基的制备与灭菌
实验一微生物培养基得制备与灭菌(８课时）
一、目得要求
1、学习配制微生物培养基得一般方法与步骤。
2、掌握高压蒸汽灭菌得原理与操作方法。
二、基本原理
正确掌握培养基得配制方法就是从事微生物学实验工作得重要基础。由于微生物种类及代谢类型得多样性，因而用于培养微生物得培养基得种类也很多，它们得配方及配制方法虽各有差异,但一般培养基得配制程序却大致相同,例如器皿得准备，培养基得配制与分装,棉塞得制作，培养基得灭菌,斜面与平板得制作以及培养基得无菌检查等基本环节大致相同.
三、实验材料
1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、１ｍｏl/Ｌ得NaＯH与１moｌ/L HCl溶液。
２、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿与玻璃棒等.
３、其她物品:药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳与注射器等。
四、操作步骤
(一）玻璃器皿得洗涤
玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净,然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。
（二）牛肉膏蛋白胨培养基得配制
1、培养基配制
（１)称量：按培养基配方计算出各成分得用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中.
注意:称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。称药品用得药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
（2）溶解:用量筒称量所需体积得水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，倒入烧杯中,用玻璃棒搅动溶解即可。
(3）调ｐH：一般用pＨ试纸测定培养基得pH，可用1mｏl/Ｌ NａOH或1mol/L H Ｃl溶液进行调节。调节ｐH时,应逐滴加入NaOH或HＣI溶液,防止局部过酸或过碱,破坏培养基中成分.边加边搅拌,并不时用PH试纸测试,直至达到所需ｐH 为止。
注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子得浓度。
2、制备液体培养基
（1)用量筒准确量取2０mｌ培养基，倒入100ｍl三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。
注意:倒溶液时不要把瓶口沾湿。包扎时不要把瓶子弄倒而把棉塞弄湿。3、制备固体培养基
（1)平板培养基
Ａ、用量筒准确量取100ml培养基，倒入２５0ml三角瓶中，加入２g琼脂粉,塞好棉塞,用报纸包好瓶口并用棉线包扎好,灭菌.
Ｂ、将洗净烘干得培养皿用报纸包扎好，灭菌。
C、在超净工作台中,将装在三角瓶中已灭菌得琼脂培养基冷至５０℃左右倾入无菌培养皿中.温度过高时,皿盖上得冷凝水太多；温度低于50℃,培养基易于凝固而无法制作平板。平板得制作应在火旁进行,左手拿培养皿，右手拿三角瓶得底部,左手同时用小指与手掌将棉塞打开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开，倾入1０—1５ml培养基,迅速盖好皿盖,置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中,冷凝后即成平板。
(2)斜面培养基
Ａ、用量筒量取１０0mｌ培养基,倒入一个烧杯中，加入２g琼脂粉，置于石棉网上加热，用玻璃棒搅动溶解至琼脂粉溶解。
B、将洗净烘干得试管放置在试管架上，用注射器将融化琼脂粉得培养基倒入试管至试管高度得1／4处。
注意:不要将试管口弄脏。
C、待培养基冷却凝固后，塞上棉塞,以2支或4支为一组,用报纸将试管口包扎好,灭菌。
D、灭菌后,趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面得长度不超
过试管总长得1/２。
１０。无菌检查将灭菌得培养基放入３7℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁得橱内,备用。
(三)培养基得灭菌
培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定得灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。
（四)培养基得灭菌检查
灭菌后得培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1－2管（瓶）,置于37℃温箱中培养1—２天，确定无菌后方可使用。
五、实验内容
1、根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行烘干与包扎。
2、根据要求配制微生物培养基.
3、掌握用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌.
4、掌握液体培养基、平板培养基与斜面培养基得制备。
六、实验报告
１、记录本实验配制培养基得名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
2、记录所做培养基得无菌检查结果.
七、实验思考题
１、为什么微生物实验室所用得三角瓶口或试管口都要塞上棉塞才能使用？能否用木塞或棉皮塞代替?
2、配制培养基时为什么要调节pH?
３、高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短?
4、高压蒸汽灭菌得原理就是什么？就是否只要压力表上得指针指到所需得压力时就能达到所需灭菌温度？为什么?
５、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌得培养基如何进行无菌检查?
6、请设计实验对饮料进行无菌检查。
附录高压蒸汽灭菌技术
一、目得要求
了解消毒与灭菌得原理，并掌握各种灭菌方法得操作步骤。
二、实验材料
上述配制得培养基,包扎得培养皿、试管,高压蒸汽灭菌锅，注射器,镊子，玻璃涂棒。
三、基本原理
在微生物实验中,需要进行纯培养,不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养基与工作场所进行灭菌与消毒。灭菌就是指杀死一定环境中得所有微生物,包括微生物得营养体、芽孢与孢子。实验室常用得灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法得基本原理就是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌得目得。
四、操作步骤
高压蒸汽灭菌就是将物品放在密闭得高压蒸汽灭菌锅内,在一定得压力下保持15—３0分钟进行灭菌.此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品得灭菌,也可用于玻璃器皿得灭菌.
将待灭菌得物品放在一个密闭得加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅夹套间得水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内得冷空气从排气阀中排尽,然后关闭排气阀,继续加热，此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌锅内得压力，从而使沸点增高,获得高于1００℃得温度,导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌得目得。
在相同得温度下,湿热灭菌得效果好于干热灭菌。有三点原因:1、在湿热灭菌中菌体吸收水分,蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量得增加,所需凝固温度降低；2、湿热灭菌中蒸汽得穿透力比干燥空气大;3、蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量得汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面得温度，从而增加灭菌效力.
实验室常用得灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅与自控式灭菌锅，其结构与工作原理就是相同得。本实验介绍得就是半自控高压蒸汽灭菌锅,自控式灭菌锅得使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下:
1、加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量得水,使水面没过加热蛇管,与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位,加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起
炸裂事故。
2、装料:放回内层锅，并装入待灭菌得物品。注意不要装得太挤,以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基得容器放置时要防止液体溢出,三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎得纸而透入棉塞。
3、加盖:将盖上与排气孔相连得排气软管插入内层锅得排气槽内，摆正锅盖,对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对得两个螺栓,使螺栓松紧一致，勿使漏气,并打开排气阀。
４、排气：打开电源加热灭菌锅,将水煮沸,使锅内得冷空气与水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出得气流很强并有嘘声时，表明锅内得空气已排尽,沸腾后约需３分钟.
５、升压：冷空气完全排尽后,关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。6、保压:当压力表指针达到所需压力时,控制电源,开始计时并维持压力至所需得时间。如本实验中采用０、１Ｍpａ,１２1、5℃,20分钟灭菌。注意：灭菌得主要因素就是温度而不就是压力，因此锅内得冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。
７、降压:达到灭菌所需得时间后,切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表得压力降至“0"后，方可打开排气阀，排尽余下得蒸汽，旋松螺栓,打开锅盖,取出灭菌物品。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内得培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染,甚至灼伤操作者。
8、无菌检查：将已灭菌得培养基放入３７℃恒温培养箱培养２４ｈ，无杂菌生长后即可使用.