临床免疫学检验(理论)核心考点整理

【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外

长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选

和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤

细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。

（一）小鼠骨髓瘤细胞

理想骨髓瘤细胞的条件：①细胞株稳定，易于传代培养；②细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；③该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；⑤融合率高。

目前最常用的是NS-1和SP2/0细胞株

（二）免疫脾细胞

多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全

弗氏佐剂。

（三）细胞融合

是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作细胞融合剂，

浓度30~50 %之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，

诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养

肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK ,禾U用核苷酸前体物合成核

苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H ）、氨基蝶呤（A ）和胸腺嘧

啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期

生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。

免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的

微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。

【原理】可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂的作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应也出现浊度。

优点：稳定性好、敏感度/精确度高、简便快速、易于自动化

【影响因素】

1、抗原抗体的比例

钩状效应（high dose hook effect）:免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。

2、抗体的质量：特异性强、效价高、亲和力强、R型抗体

3、抗原抗体反应的环境：反应液最适pH 6.5~8.5，离子强度大（常用磷酸盐缓冲液PBS最

4、增浊剂：如聚乙二醇PEG、吐温-20

【分类】

速率比浊法和终点比浊法；透射免疫浊法和散射免疫比浊法；免疫胶乳比浊法

凝集反应与沉淀反应有何异同

一、相同点：

①都是抗原抗体的特异性反应；②都分为两个阶段，抗原抗体特异性结合和出现可见复合物阶段；③有相同的反应机制和影响因素。

时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。它具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿

命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等优点，已在临床检测中广泛使用。

【基本原理】

1时间分辨：通常各种组织、蛋白或其他化合物，在激发光照射下都能发出一定波长的自

发荧光，这些荧光是非特异性的，会干扰荧光免疫测定，影响其特异性和灵敏度，但它们的

荧光寿命常较短（1~10 ns），最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10~1000 卩s）,因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。这是本技术具有高灵敏度的原因之一。

2、 stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（通常为273nm）, 激发/发射光谱不重叠，用简单的滤光片就能把激发光和发射光分开，可消除激发光散射引

3、发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm 土10nm ,利用615nm 土5nm 的滤光片只允许此波段的发射光通过，可排除其余波长的荧光。生物样品的本底荧光波长通

常在350~600 nm,故在615nm 土5nm波段内，来自生物样品的荧光干扰极少，可有效降低

本底荧光。

镧系元素的激发光谱则较宽，通常为300~350 nm，非常有利于增加激发能，提高检测的灵

敏度。

4、荧光标记物的相对比活性：测定Eu3+螯合物发射荧光采用的激发光源为脉冲氙灯，其工作频率为1000次/秒，由光导纤维闪光管的控制系统。

比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。在测量时间内，Eu3+可被反复

激发，每次激发后，他可很快由激发态回到基态，发射荧光；然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，这就大大提高了荧光标记物的比活性。

5、信号增强：免疫反应完成后，形成Eu3+标记的抗原抗体复合物，其在弱碱性溶液中的激

发荧光信号较弱，加入酸性增强液可使Eu3+标记的抗原抗体复合物的pH降至2~3，Eu3+

从复合物上完全解离，游离的Eu3+可被增强液中的螯合剂所螯合，在协同剂等成分的作用

下，与增强液中的B -二酮体生成以Eu3+为核心的保护性胶态分子团，它是具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。

（二）标记物和标记方法

1、标记物：用于本技术测定的标记物是镧系元素，其中铕（Eu3+）和铽（Tb3+ ）的荧光寿

命特别长且荧光强度高，多用这两元素作为标记物，其中Eu3+最为常用。

镧系元素在游离状态下的荧光相对较弱，与螯合剂如B -萘甲酰三氟丙酮（B -NTA ）等形成

螯合物后，可使荧光强度增强。螯合物的荧光寿命与配体有关。

2、标记方法：需利用具有双功能基团的螯合剂，一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原

或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。常用的

双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA ）等，此法可允许每个蛋白质分子上标记多个Eu3+而不影响其生

物学活性和稳定性。

螯合剂可先螯合Eu3+,再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合Eu3+ （两步法）。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子蛋白载体（牛血清白蛋白，多聚赖氨酸等）连

接，再标记Eu3+。

（三）方法类型

1双抗体夹心法：将待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体-

待测抗原-Eu3+标记抗体复合物，在酸性增强液的作用下，复合物中的Eu3+从免疫复合

物上解离并形成螯合物，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原的含量。

2、固相抗体竞争法：将待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所得荧光强度与待检抗原含量负相关。

3、固相抗原竞争法：与固相抗体竞争法类似，只是第一步改成将待检抗原和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体。

（四）方法评价

1、优点：灵敏度高，检出下限为10A-18mol/L （普通荧光免疫计数仅为10A-8mol/L ）。分析范围宽，可达4~5个数量级。标记结合物稳定，有效使用期长。测量快速，易于自动化。

本法在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面均可与RIA相媲美，是超微量物质分析方

法中最有发展前途的一项技术。

2、缺点：易受环境、试剂和容器中镧系元素离子的污染，使检测本底增高。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

A I . 抗体酶标抗休痒吕抗涼

【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或

抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体

表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物

后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应

的深浅进行定性或定量分析。

（一）ELISA检测抗原的方法主要有：

1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD ）的Ag。

先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中的抗原与

固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗

体并温育，使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗

体复合物，为“双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。

临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目的检

测。

2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇，分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别与不同的抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）

3、竞争法：适用于小分子Ag 或半抗原（只有一个AD ）。先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原，待测样本中的抗原与酶标记抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。

（二）ELISA 检测抗体的方法主要有：

1、间接法：检测Ab 最常用的方法。常用酶标记羊抗人IgG 。

2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb 的测定常用此法。

3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质，不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb 和HBeAb 。原理见下：

（1）HBcAb 的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，，然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，此时待测标本中的HBcAb 与酶标记HBcAb 竞争性地与固相载体上的核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBcAb 的含量负相关。

（2）HBeAb 的竞争法：先将HBeAb 包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg ，此时待测标本中的HBeAb 和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg ，温育后洗涤，加入酶标记的HBeAb ，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温育后洗

涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中HBeAb 的含量呈负相关。

4、捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig 类别的测定，最常用于病原体急性感

染诊断中IgM 型抗体检测。

原理：首先将针对IgM 的第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有的IgM （特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其与固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原的酶标记抗体，形成固相抗人卩

链IgM-抗原-酶标记抗体复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM 进行定性或定量测定。

此法临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM 抗体，急

性乙型肝炎时可检测抗HBc-IgM 抗体。

电化学发光免疫分析（ECLIA ）

【原理】是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA ）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应（它包括电化学和化学发光两个过程）。在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，复合物进入流动室，同时注入TPA 缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在点击下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本缓冲液被冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA 在电极表面进行电子转移，产

生电化学发光。光信号由安装在流动室上方的光信号检测器检测，光的强度与待测抗原的浓度成正比。

【特点】：①三联吡啶钉在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始的发光，持续时间长，信号强度高，容易测定、控制；②三联吡啶钉直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性；③试剂灵敏度高，稳定性好。

生物素-亲合素系统

【特点】：高特异性、高敏感性、稳定强、实用性强【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节，也可用于固相包被（或分离）环节

一、应用于固相载体的包被环节链霉亲合素（亲合素）为弱酸性蛋白，可以吸附在固相载体（聚苯乙烯微孔板或纳米微球）

表面，形成链霉亲合素包被固相载体；利用生物素标记抗原（或抗体），使待包被的抗原（抗

体）通过生物素与固相材料表面的链霉亲合素结合，实现间接包被。

此种包被模式不但可增加抗原（或抗体）包被数量，也可减少空间位阻效应，提高抗原（或抗体）的利用效率。

此外，若固相材料不与生物素化抗原（或抗体）结合，待生物素化抗原（或抗体）与待检抗体（或抗原）反应后，再加入链霉亲合素预包被磁性纳米微球，含有生物素的免疫复合物可结合在固相载体表面，达到同样的分离效果。

二、应用于检测系统的信号放大

生物素-亲合素系统用于检测信号放大，可提高标记免疫分析的敏感性。基本方式有生物素

-亲合素-生物素模式（BAB ）和生物素-亲合素模式（BA ）或标记亲合素模式。如将生物素标记在第一抗体上称为直接法，如生物素标记在第二抗体上称为间接法。

①生物素-亲合素-生物素模式的特点是生物素标记分子（如生物素标记抗体/酶蛋白），以游

离亲合素为桥，连接抗原-抗体和信号检测系统；由于一个亲合素分子能同时结合4 个生物素，且一个生物素大分子可标记多个生物素而产生级联放大效应，提升检测敏感性。

②实际应用中的ABC 法：预先按一定比例将亲合素与生物素标记示踪物质（如生物素标记