蛋白质工程的主要研究方法和进展

蛋白质工程的主要研究方法和进展

李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐

(福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108)

摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。

关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化

中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02

Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering

L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na)

Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed

K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on

20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。

1 理性进化

理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。

2 非理性进化

非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。

易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3 -5 校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp-art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。

D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase 酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重

47

安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5)

作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15

新组装成全长的基因,由于存在不同的模板,使得到的全长基因具有不同谱系之间的重组,再进行最后一轮PCR,加入全长引物,扩增得到改造过的全长基因。利用D NA 改组已成功进化了编码 -内酰胺酶、 -葡萄糖苷酶、脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉津降解酶的整个操纵子[8]。

在DNA改组技术的基础上又发展出外显子改组(e x-on shu ffli ng)和家族改组(fa m il y shuffli ng)。外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动,而使D NA改组不受任何限制,发生在整个基因片段上,更适用于真核生物,并可获得各种大小的随机文库。交错延伸重组(stagger ed e xtens i on p r ocess,S t EP)是一种简化的DNA shu ffli ng方法,是在PCR反应中,将含不同点突变的模板混合,随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应,在每一轮中,那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,由于模板转换而实现不同模板间的重组,如此重复直至获得全长基因片段[9]。RPR法(Rando m-P rm i ing R e-co m b i nati on DNA Shu ffli ng)是以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点的短D NA片段,由于碱基的错配和错误引发,这些短D NA片段中也会有少量的点突变,在随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整的基因长度[10]。过渡模板随机嵌合(r ando m c h m i era ge nes i s on tran-sie n t te m p l ates,AC H I TT)技术是改进的基因改组技术,不包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接,其中的悬垂切割步骤可使短片段得以重组,提高重组的频率和密度[11]。

发酵过程常常由于微生物对温度、p H、溶液的影响而导致产量低,微生物的自身调控系统十分复杂和精细,致使单个基因的突变很难对其产生某种产物的能力造成影响,因此,对微生物的进化要在整个基因组的水平上进行才能起到有效的作用,于是出现了一种叫全基因组改组(W hole-Geno m e Shu ffli ng)的技术,它结合了D NA shuf-f li ng和传统的育种技术的优点,传统的育种技术耗时较长,经常由于亲本的相容性不好而影响育种效果,而且实验过程完全可以用随机突变和筛选文库来完成,Zhang等从能产泰乐菌素的Str epto m yces fradiae的改造过程中证明了这种方法可以快速改善泰乐菌素的产量[12],R anjan Pa-t nai k比较了传统育种方法和基因组改组技术之后,发现乳酸菌Lact obacillus能在p H4 0的条件下产出比野生菌株多三倍的乳酸,而传统育种方法明显没有基因组改组取得的效果好[13]。

体外异源杂交和体内修复,这种方法首先在体外进行异源杂交DNA双链,转化细菌,在胞内完成修复,同时产生出一种新的以亲本D NA为模板的杂交DNA文库,这是对DNA Shuffli ng等已存在的基因重组方法的补充,特别适用于大片段DNA和整个操作子的重组[14],但是这种方法需要亲本基因具有极高的同源性,而且每次重组只能进行两个亲本,这也在一定程度上限制了它的应用。

通过同源重组或随机突变产生的蛋白突变体一定程度上都是依照模板蛋白进行的,它们与模板蛋白的相似程度较大,而非同源重组(N onho m ol ogous Reco m b i nati on)能够产生完全不同于模板的新的蛋白质,新的蛋白可能在自然界中并不存在,为研究进化蛋白提供了潜在的可能性,很多种方法可以进行非同源重组,如杂交酶递增切断技术(Incre m ental truncati on for the cr eati on of hybri d enzy m es, I TCHY)[15]可以产生由基因氨基端和羧基端杂交形成的嵌合体基因库。该法首先用核酸外切酶 代替DN ase 分别消化两种基因建立I TCHY库(I TL s),对靶序列末端基因完全删除,并通过降低切断温度、改变消化缓冲液浓度和加入酶抑制剂等方法改变外切酶在37 消化过快的问题。最后将两种I TLs混合后进行DNA改组建立SCRATC HY库(shu ffled I TC HY li b r aries)。这项技术降低了家族改组对同源性的要求,使家族D NA改组的概念和应用得到了进一步深化和延伸,并在其他领域得到有效的运用。G ris w ol d等将序列同源性仅54 3%、且对底物的专一性不同的人类和大白鼠 类GS T酶进行家族改组,利用I TCHY技术对两者的同源编码基因进行融合重组,获得的重组表达蛋白SCR23活性是人类 类GST酶的300倍,同时突变体酶还获得了催化谷胱甘肽和利尿酸结合的合成酶活性[16]。

3 展望

蛋白质工程作为分子生物学水平上对蛋白质结构和功能进行改造的手段已经受到越来越多的研究人员的关注,并且其应用广泛,目前已经在蛋白质药物、工业酶制剂、农业生物技术、生物代谢途径等等研究领域取得了很大进步。在分子生物学手段日益发展的今天,新的蛋白质工程手段逐渐面世,对于蛋白质分子改造起到了极其重要的作用,通过这种手段提高蛋白质的特性如热稳定性、耐酸性、耐碱性等仍然是目前的重要研究方向。

参考文献

[1]Rot h,M and A J eltsch,Ch angi ng t he target bas e s pecifici ty of t h e

E coRV DNA m ethyltrans f erase by rati onal de novo protei n-design

2001:3137-3144

[2]Cahoon,E B ,et al ,Redes i gn of sol ub le fatt y aci d des aturases

fro m p l ants for altered substrate specifi cit y and doub le bond position 1997:4872-4877

[3]Van den Burg,B ,et al ,Engi n eeri ng an en z y m e to res i st boili ng

1998:2056-2060

[4]H er m es,J D ,S C B l ack l o w,and J R Know les,Search i ng se-

qu ence s pace by defi nab l y rando m mu tagenes is:i m provi ng the cata-l ytic pot en cy of an enzy m e 1990:696-700

[5]Bev i s,B J and B S G lic k,Rap i d l y m at uring vari an t s of t h eD isco-

so m a red fluorescen t p rotei n(D s Red) N at B iot ech,2002 20(1): 83-87

[6]Ca m pbel,l R E ,et al ,A m ono m eri c red fl uorescent protei n

2002:7877-7882(下转51页)

48安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5)

use for m i m un i zati on M ethods,2004,32:21-24

[8]Cheng E N,Qu t ob S,Pav li vM,et al H SP27i s bett er ass oci at ed

w it h the express i on of i nduci b l e ther m ot oleran ce i n hu m an pancreati c tumor cell li nes t han HSP70,p53or p21/w af1/ci p1 Ther m B i o,l 2002,27(1):47-54

[9]Carver J A ,L i ndn er R A ,Lyon C,et al The i nteracti on of t he mo-

l ec u lar chaperone -crystalli n w i th unfol d i ng -lact al bum i n:a s tr u c-tural and k i neti c s pectroscop i c st udy J M ol B i ol 2002,318:815–827

[10]B i s was A and Das K P Role ofATP on t he i nteracti on of -crys-

talli n w it h it s s ubstrates and its m i p li cati ons f or t hem olecu l ar chaperone

f uncti on J B iol Che m 2004,279:42648–42657

[11]Derha m B K ,E ll ory J C ,B ron A J,et al The molecu l ar chaper-

one --cryst alli n i ncorporated i n t o red cellghosts protect s m e mb rane Na/K-ATPase agai nst g l ycati on and ox i dati ve stres s Eur J B i o-che m 2003,270:2605–2611

[12]Per ngM D ,Cai rn s L,PrescottA,et al I n ter m ed i at e fil a m ent i nter-

actions can be alt ered by HSP27and B-crystalli n J Cell S ci 1999,112:2099–2112

[13]Fu jit a Y,Ohto E,Kataya ma E,et al B-crystalli n-coated MAP

m icrot ubu l e resist s nocodazol e and cal ci um i nduced d i sass e m bly J

C ellS ci 2004,117:1719–1726

[14]Narberhau s F -crystalli n-t ype heat shock p rot ei n s:s oci alizi ng

m i n ic haperon es i n the con te xt of a mu ltic h aperon e n et work M icrob i ol M ol B i ol Rev 2002,66:64–93

[15]BorrelliM J,Bernock L J,Landry J,et al S tress protecti on by a fl u-

orescen tH s p27chm i era t hat is i ndependen t of nu clear tran sl ocati on or mu ltm i eric d iss oci ati on C ellS tress Chaperones 2002,7:281–296 [16]deW itN JW ,V ersc huure P,Kapp G,et al Testis-specific hu-

man s m all heat s hock protei n H SPB9i s a cancer/testi s antigen,and pot en ti ally i n teracts w it h the dyn ei n s ubun itTCTEL1 Eu r J Cell B-i ol 2004,83:337–345

[17]Q i u Z J,B oss i er P,W ang X M,et al D i versit y,stru ct u re,and ex-

pressi on of t he ge n e f or p26,a s mall heat s hock protei n fro m Arte m i a Geno m i cs 2006,88(2):230-240

[18]Adhi k ariA S,RaoK S,RangarajN,et al H eat stress-i nduced l o-

calizati on of s m all heat shock p rot ei n s i n m ousem yob l asts:i ntranucl ear l a m i n A/C s peckles as t arget f or B-crystalli n and H sp25 Exp Cell Res 2004,299:393–403

[19]M ac Rae T H Struct u re and f uncti on of s mall heat s hock/al ph a-

crystalli n protei ns:establi s h ed concepts and e m ergi ng i deas Cell

M ol L if e Sci 2000,57:899–913

[20]Farns w ort h P,K a m alendra S S truct ure f uncti on relati onsh i p a m ong a

-crystalli n related s m all heat shock protei n s Experm i ental Eye Re-s earc h 2004,79:787–794

[21]K le men z R,Froh liE,Stei ger R H,et al B-crystalli n i s a s mall

heat s hock protei n ProcN atlAcad SciUSA,1991,88:3652-3656 [22]M arti n H,At h anas i os I,H elen S,et al A Do mai n i n t he N-ter m-i

nal Part ofH s p26is E ss en ti al f or Chaperone Functi on and O li go m eri za-ti on J M ol Biol 2004,343,445–455

[23]S tro m er T,F i scher E,Richter K,et al Anal ysis of the regu lati on of

t he mo l ecu l ar chaperoneH s p26by te mperat u re-i nduced d i ssociati on: t he N-t er m i nal do m ail is m i portant f or oli go m er asse mb l y and t h e

b i nd i ng of un f oldi ng protei ns J B iol Ch e m 2004,279,11222–

11228

[24]Da i s uke S,L iB,Xia Q Y,et al Gene En cod i n g Sm allH eat Shock

Protei n s of t he S il kw or m,Bo m byx m ori B i oci B i otechnol B i oche m, 2006,70(10):2443-2450

[25]K oteic h eH A and M chaourab H S M echan i s m of chaperone fun ction

i n s m all heat-shock protei ns Phosphory l ati on-i ndu ced acti vati on of

t w o-m ode b i ndi ng i n B-cryst alli n J B i ol Che m 2003,278: 10361–10367

[26]Crack J A ,M ansou rM,Sun Y,et al Functi onal anal ysis ofa s mall

heat s hock/ -crystalli n protei n fro m A rte m i a fran ci scana O li go m eri za-ti on and ther m ot oleran ce Eur J B i oche m 2002,269,933-942 [27]Guo Z And Cooper L F An N-t er m i nal33-a m i no-aci d-del etion

variant of hsp25ret a i ns oli go m eri zati on and f uncti onal properti es B i o-

c h e m B i ophys Res Co mm 2000,270,183-189

[28]Aqu ili na J A,Benesc h J L,D i ng L L,et al Subun it exc h ange of

pol ydis perse protei ns M ass s pectro m etry reveal s consequences of A-cryst alli n trun cati on J B i ol Che m 2005,280:14485–14491 [29]BovaM P,M chaourab H S,H an Y,et al Subun it exc hange of s mall

heat s hock prot ei n s Analys i s of oli go m er for m ati on of A-crystalli n and H sp27by fl uores cence res onan ce energy trans f er and site-directed trun cati ons J Biol Che m 2000,275:1035–1042

[30]Cho w dary T K,Ra m an B,Ra m ak ri s hna T,et al M a mm alian H s p22

is a heat-i nduci b l e s m all heats hock protei n w it h c haperon e-li ke ac-ti v i ty B i oche m J 2004,381:379–387

[31]H asl bec k M,W al ke S,S tro m er T,et al H s p26:a t e m perature-

regu l ated c h aperon e E M BO J 1999,18:6744–6751

(责编:张琪琪)

(上接48页)[7]M oore,J C and F H Arnold,D i rected evol uti on of a para-n itrob enzyl esterase f or aqueous-organ ic sol vents Nat B i o-tech,1996 14(4):458-467

[8]Fari nas,E T ,T Bu lter,and F H A rnol d,D i rected enz ym e evo-

l u tion Cu rren tOp i n i on i n B i otec hno l ogy,2001 12(6):545-551 [9]Zhao,H ,et al ,M ol ecu l ar evol u ti on by st aggered exten si on process

(S t EP)i n vitro reco m b i nati on Nat B iot ech,1998 16(3):258-261

[10]Shao,Z ,et al ,Rando m-pri m i ng i n vitro recomb i nati on:an e-f

fective t ool f or d i rected evo l uti on 1998:681-683

[11]Pelleti er,J N ,A RACH I TT for our tool b ox N at B i otech,2001

19(4):314-315[12]Y i ngX i n,Z ,et al ,Geno m e shuffli ng l eads t o rap i d phenotyp ic

i m p rove m ent i n bacteria Nat u re,2002 415(6872):644-646

[13]Patnai k,R ,et al ,Geno m e shu ffli ng ofLactobacill us f or i m p roved

aci d tol eran ce Nat B i otech,2002 20(7):707-712

[14]Vol kov,A A ,Z Shao,and F H Arno l d,Reco m b i nati on and

ch i m eragenesis by i n vitro heteroduplex for m ation and i n vi vo repair 1999

[15]Oster m ei er,M ,J H Sh i m,and S J Benkovi c,A co m b i nat ori al

approach to hybrid en z ym es i ndependent ofDNA ho m ology N at B io-tech,1999 17(12):p 1205-1209

[16]Gris w old,K E ,et al ,Evol u ti on of h i gh l y active en z ym es by ho-

mology-i ndep endent reco m b i nation 2005:10082-10087

(责编:张琪琪)

51

安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5)