最新原创蛋白质的定量测定实验报告

蛋白质的定量测定（BCA试剂盒法）

实验报告

一、实验目的：掌握BCA法测定蛋白质浓度的方法及原理。

二、实验原理：在碱性的环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA法与Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

三、实验材料：

实验药品和试剂：BCA Reagent 100 ml （普利莱基因技术有限公司）Cu Reagent 2.5ml （普利莱基因技术有限公司）BSA standard 4mg/ml 1 ml 待测溶液。

仪器：96孔板酶标分析仪（DNM-9602 北京普朗新技术有限公司）移液枪试管EP管恒温水浴箱。

四、实验方法与步骤：

（1）工作溶液配置：将5ml的BCA Reagent与100μl的Cu Reagent混合为WR工作试剂。

（2）标准蛋白溶液的配置：用上节课已配置好的0.1M的PBS缓冲液进行配比稀释：40μl 4000μg/ml BSA+60μl 0.1M的PBS=100μl（BSA=1600μg/ml）。

（3）倍比稀释：为减小误差，将标准蛋白和待测样本分为三个相同组，每个孔加25μl，浓度从上到下依次增加，H行为待测溶液。从配置好的100μl标准蛋白溶液中取出75μl（浓度为1600μg/ml），再将75μl标准蛋白溶液取出一半到EP管中，将37.5μl的PBS缓冲液加入取出的蛋白溶液中（浓度为800μg/ml），在EP管上做好浓度标记，依次倍比稀释，得到BSA标准溶液1600，800，400，200，100，50，25μg/ml，各75μl。省略1600μg/ml标准管直接从800μg/ml开始。

（4）标准测定：在每孔25μl标准品或待测样品中，各加入200μl WR 工作液轻摇混合。

表1 微板测定方案的加样量和比例

（5）反应：将配好溶液的96孔板37℃恒温水浴箱放置30min。

（6）测定：30min后将96孔板放进酶标分析仪中进行结果的检测，以A1做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值。

（7）绘制标准曲线图：根据记录的数据，以浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。

五、实验结果：

表2 各孔测得的OD值

表3 浓度及平均值

图1 标准曲线图

将待测溶液吸光度带入公式y = 0.0006x - 0.0219可得待测溶液的浓度为1088μg/ml。

六、结论与讨论：

经过试验最终测得待测溶液的浓度1088μg/ml，本次实验所用BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，经济实用，试剂及形成的颜色复合物稳定性好。本次试验中出现的问题主要有：前三组数据吸光度结果都为0，考虑因浓度太低或者与工作液混合不均匀所导致。

七、注意事项：

（1）加入标本时需充分摇匀。

（2）要得到更为精确的蛋白浓度的结果，每个蛋白样品均需做复孔，每次均应做标准曲线。

（3）实用水浴箱时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

（4）在562nm处测得的光密度值与蛋白质的浓度成正比，所以所做的标准曲线的图形应该为直线图，并且成正比的关系。