基因工程课程小结
第一章绪论
基因工程概念：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性。，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。（又称遗传工程或DNA重组技术）
（一）基因工程研究发展史
现代分子生物领域理论上的三大发现：1.DNA是遗传物质2揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制3遗传密码的破译、遗传信息的传递方式。
现代分子生物领域理论上的三大发明：1.限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割2DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3基因工程的载体的发现研究。
（二）基因工程研究内容
1目的基因的研究获得目的基因的途径很多，主要有通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。
2基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA连接酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA 连接酶。
第二章基因工程基本技术路线
生物材料
RNA
mRNA DNA
cDNA文库基因组文库人工合成
目的基因克隆载体受体细胞重组DNA
克隆子
转基因生物
基因工程基本技术路线图
（一）DNA的组成和结构
生物体内的DNA绝大部分是以B-DNA形式存在的。
当变性的DNA迅速降温时，两条单链DNA不易复性成双链DNA。
几乎所有真核生物的染色体DNA都是线性DNA，部分原核生物的染色体DNA也是
以线形存在。
ocDNA lDNA ccDNA(电泳方向：由上至下)
（二）天然DNA的制备
1天然DNA的来源：1染色体DNA 2病毒和噬菌体DNA 3质粒DNA 4线绿体和叶绿体DNA
2天然DNA的提取：1准备生物材料 2裂解细胞：对于细胞结构简单的原核生物，可用溶菌酶处理，用NaOH和SDS处理，用煮沸处理，用冰冻处理，以及用超声波处理等。
3DNA的纯化：
最常用的是方法是乙醇沉淀
4 DNA浓缩：
5 DNA片段大小的凝胶电泳检测
影响电泳的因素：1带点泳颗粒的物理性状2支持物介质3电场强度4缓冲液离心强度
凝胶电泳：在PH8..0--8.3的缓冲溶液中，核酸分子带负电，向正极移动。在浓度适当的凝胶中，由于分子刷选效应，使大小和构想不同的核酸分子迁移率出现差异，从而把它们分开。
6核酸分子杂交（297-312）
7DNA序列分析
（1）DNA的双脱氧链终止序列（329）
（2）化学降解测序列（327）
（3）PCR测序
（4）DNA自动化测序
（5）DNA杂交测序
（6）DNA片段序列测序的策略随机克隆策略、引物步移策略和定向缺失克隆策略。
大规模基因测序的两种策略：逐步克隆法和全基因组散弹法
第三章基因工程的酶学基础
（一）限制性核酸内切酶和DNA片段化
1限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
2限制性内切酶识别序列：（1）长度，4--8个碱基，最常见的为6个碱基。（2）识别序列的结构：大多数为回文结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置，也有序列埠对称的，或呈间断对称。（3）切割位点：磷酸二酯键断开的位置。
3限制性内切酶内切产生的末端：（1）匹配末端：识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后产生的末端，亦即黏性末端。（2）平末端：在回文对称轴上同时切割DNA的两条链则产生的末端。（3）非对称突出末端：识别序列为非对称性时。
4影响限制性内切酶活性的因素：（1）DNA纯度：存在pro、乙醇、EDTA、SDS 等等会降低活性，可增加酶的用量。（2）DNA样品的甲基化程度。甲基化对酶切得影响：a修饰酶切位点b产生新的酶切位点c对基因组作图的影响。（3）限制性内切酶缓冲液的性质：高盐、中盐和低盐。（4）DNA的分子结构：线形>超螺旋和环状。（5）酶切温度T：37°
5一些限制性核酸内切酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列，这样的限制
性核酸内切酶被称为同裂酶。同裂酶可以是具有不同的切割位点，也可以是具有相同的切割为点。
6 Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。
Star活性出现的频率因采用的限制性核酸内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同。几乎所有的限制性核酸内切酶都具有Star活性。
7 DNA分子片段化：（1）单酶切法（最常用的方法）（2）双酶切法（3）部分酶切
8 DNA分子的限制性图谱：（1）双酶切法（2）部分酶切法（3）Bal 31 逐步切割片段法
（二）DNA连接酶
1 DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
2 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
3 T4噬菌体DNA连接酶更广泛的应用：（1）修复双链DNA上的单链缺口（2）连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度较慢。（3）连接酶完全断开的两个平头双链DNA分子，属于分子间连接，但速度慢，需高浓度的底物和酶。
4 DNA片段的连接：（1）具互补黏性末端片段之间的连接（注意连接前后识别序列的变化）（2）具平末端DNA片段的连接（3）DNA片段末端修饰后再进行连接（4）DNA片段加连杆后连接。
（三）甲基化酶
Dam甲基化酶：修饰GATC序列中的腺嘌呤残基成为5’-甲基腺嘌呤。
Dcm甲基化酶：修饰CC(A/T)GG序列中的胞嘧啶残基成为5’-甲基胞嘧啶。（四）其他酶
1 磷性磷酸酯酶
2 DNA聚合酶（1）大肠杆菌聚合酶（2）T4噬菌体DNA聚合酶（3）Tt噬菌体DNA 聚合酶（4）耐高温DNA聚合酶：主要用于多聚酶链式反应（PCR）（5）反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。（6）末端脱氧核苷酸转移酶
第四章基因工程载体
（一）载体的功能与特征
1 概念：载体是在基因工程中，把外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。
2 功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞
（2）为外源基因提供复制能力或整合能力
（3）为外源基因扩增和表达提供条件
3 载体蓝本：天然存在的质粒，噬菌体，病毒DNA，对其再进行修饰、改造、构建成多种功能的载体DNA分子。
4 载体具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
具有较高的外源DNA装载能力
具有多种单一的限制性内切酶的识别位点、切割位点
具有合适的刷选标记
载体的安全性
载体的本质是DNA与外源基因连接导入的受体细胞并能复制进行表达。
5 载体的分类：
根据来源和性质分类：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体载体。
根据功能和用途分类：克隆载体、表达、测序、转化、穿梭、多功能载体（二）质粒载体
1质粒的基本特征：自主复制、不相容性、可扩增、可转移和不相容性。
质粒载体的三种共同成分：复制起点、刷选标记和克隆位点（一般人工构建的质粒是单复制子）
2质粒载体的改造与构建：
天然质粒的局限性
质粒载体必备条件：具有复制起始位点、抗性基因、多克隆位点和较小的分子量（易于操作）和较高的拷贝数（可以获得大量的克隆基因）
质粒载体改造与构建的指导思想
常见质粒载体类型：克隆质粒载体、表达质粒载体、多功能质粒载体和穿梭质粒载体。
蓝白斑刷选原理
3 质粒DNA的提取
4 质粒载体的稳定性
（三）λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的生物学特性
2 λ噬菌体的构建（1）野生型λ噬菌体的局限性（2）λ噬菌体的构建
3 λ噬菌体的主要类型：插入型取代型
4 λ-DNA的提取
5 λ噬菌体载体的应用：基因文库与cDNA文库的构建
6 λ噬菌体作为载体的优点：刷选方便提取方便
7 基因工程克隆策略：分、切、接、转、刷、增
8 λ噬菌体载体的克隆步骤：（1）通过裂解过程增值载体
（2）载体与外源DNA的酶切（挑选目的基因）
（3）载体与外源DNA的连接
（4）重组噬菌体的体外包装
（5）包装噬菌体颗粒的感染
（6）刷选
（四）粘性载体（柯斯质粒载体，cosmid载体）
1cosmid载体的构建：1978发明了柯斯质粒载体，具有cos位点的质粒
概念：是一类有人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体（复制起点、抗性标记、cos位点）具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆的优点，有31-45kb的装载能力。而且能够被包装成具有感染性能力的噬菌体颗粒。
2cosmid载体的特点：（1）具有λ噬菌体的特征，不形成溶菌周期（以大肠杆菌形式表现而不是噬菌斑）
（2）具有质粒载体的特性
（3）具有高容量的克隆能力
3使用cosmid克隆载体的基本程序
Cosmid载体的缺点：（1）载体片段自我连接（2）外源DNA的自我连接（3）多个本来不在一起的外源DNA连接起来，同时插入与载体上。
（五）单链丝状噬菌体载体
1生物学特性（1）外形呈丝状（2）由外壳蛋白和正DNA组成（3）全长6407个核苷酸（4）至少有10个基因
2 构建：p116
（六）人工染色体载体146-147
（七）噬菌体载体及其他病毒载体
第五章目的基因的获取
1目的基因：需要研究的基因
2目的基因的制备：
（1）直接分离法：限制性核酸内切酶酶切分离法
基因分离的物理化学法
双抗体免疫发分离编码蛋白的基因
利用酶促反转录法直接从特定的mRNA分离基因
（2）构建基因组文库分离法
DNA文库：消减杂交文库、表达库、cDNA文库
基因组文库的概念：某种生物的基因组的全部遗传信息，通过克隆载体贮存在一个受体细胞的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体含贮存某种生物的基因组部分遗传信息，称为部分基因组文库。
建库的基本步骤：
mRNA
基因组DNA cDNA
DNA插入片段载体DNA
转化宿主（如大肠杆菌）
文库扩增、保存
刷选
基因组文库的大小：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长
构建基因组文库：基因组DNA的分离制备基因组DNA的片段化载体制备重组连接噬菌体体外包装转化宿主文库扩增、保存刷选
（3）cDNA文库的构建及目的基因的分离
某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别：
①基因组文库克隆的是任何基因，它包括未知功能的DNA序列
cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因
②基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和启动子
cDNA文库克隆的是不含内含子的基因
③基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空限制
cDNA文库克隆的是不完全编码的DNA序列，受发育和调控因子的影响
④基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的研究表达，但是它们对于真核细胞基因结核的分析。
cDNA便于克隆及大量扩增，构建的文库复杂性低，适于特异基因的分离。
构建cD NA基因文库：细胞总RNA的制备、mRNA分离（DNA第一条链的合成、双链cDNA合成、cDNA与载体连接）、噬菌体质粒的包装、转化或转染受体细胞。（4）利用PCR技术扩增目的基因、基因的化学合成。
PCR的发明：1985年发明了PCR自动循环仪。
PCR工作原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
PCR过程分为三步： 1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
反应特点：特异性强、灵敏度高、简便、快速、可以扩增mRNA(RT-PCR)
影响PCR的因素：①TaqDNA聚合酶②其他耐热的DNA聚合酶③引物④模板DNA
PCR的相关技术：（1）RT-PCR（2）已知DNA序列的PCR扩增。①巢式PCR②多重PCR③不对称PCR④降落PCR（3）已知cDNA一末端序列获得全长cDNA的PCR扩增（4）已知侧翼序列的扩增（5）未知序列的PCR（6）定量PRC（7）原位PCR （8）免疫PCR
基因的化学合成适用于已知核苷酸序列的分子量小的目的基因的制备
（三）目的基因的分离
1目的基因的功能克隆：①根据特异蛋白分离目的基因②功能互补法克隆基因
2序列克隆法
3刷选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术
4利用差示分析法分离目的基因克隆（1）mRNA差别显示技术（2）代表性差别分析技术（3）抑制性减法杂交技术（4）基因组错配刷选
5功能结合法刷选目的基因
6DNA插入诱变法分离目的基因
7应用基因定位克隆技术分离刷选目的基因
8基因的定位候选克隆法
9染色体显微切割与微克隆法
10根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆
获得目的基因方法的选择：
（1）根据获得的目的基因的研究目的选择方法
（2）根据目的基因本身特点选择方法
（3）根据实验室设备条件选择方法
第六章基因的体外重组和转化
1目的基因的体外重组：黏性末端、平末端的连接重组
重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数
2受体细胞：能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞
（1）受体细胞的选择原则：
①便于重组分子的导入
②能使重组DNA分子稳定存在细胞中
③便于重组体的刷选
④遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长
⑤安全性高，无致病性。不会对外界环境造成生物污染
⑥选用内源蛋白水解酶基因缺失或酶蛋白含量低的细胞
⑦具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达
⑧受体细胞在遗传的应用上无明显偏倚性
⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值
（2）各种受体细胞的特征
（3）实验室常用的基因工程受体细胞：大肠杆菌：Tap10、DH5α、 JM101；酵母：毕赤酵母、啤酒酵母；动物：CHO 中国仓鼠卵巢细胞
3重组体的转化
（1）转化法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的工程。
转化子：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。转化后的受体菌，称转化子。Ca离子诱导大肠杆菌转化法：①感受态细胞的制备②DNA分子转化感受态细胞。
感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。
感受态细胞转化的原理：将处于对数生长期的细胞置于CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球处于感受态，同时，转化连接产物混合物中的DNA,Ca离子与DNA结合形成抗DNase的羟基钙复合物，粘附于细胞表面，经42°短时间热冲击处理，细胞吸收DNA复合物，在培养基中生长数小时后，球形细胞复原并增值。
转化处理实验及其对照组：实验组：感受态细胞+质粒DNA
DNA对照组：无菌水+质粒DNA（检测DNA是否污染）
感受态细胞对照处理：感受态细胞+NTE缓冲液（检测感受态细胞是否染菌）
感受态细胞有效性对照处理：感受态细胞+已知容易转化这种感受态细胞的DNA （检测感受态细胞是否有效）
电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。（相对于Ca离子转化法，电穿孔用的感受态细胞更容易制备）
转化率及其影响因素：
转化率：指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。
转化率=（转化子数/用于转化处理的DNA分子数（受体细胞）或质量）*100% 转化率的影响因素：①载体DNA及目标DNA重组②受体细胞：匹配③转化操作方法
（2）转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
（3）转染：采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。转染是转化的一种特殊形式。
重组体转化真核生物细胞：有载体介导：动物，病毒颗粒载体介导的；植物，Ti质粒介导的。
无载体介导的转化方法：①磷酸钙转染技术②电穿孔③基因枪法：主要用于植物细胞的转染④激光微束穿孔转化法⑤显微注射法⑥脂质体介导法⑦多聚物介导法
第七章重组体的筛选
懂得区分转化子和非转化子、重组子和非重组子、目的重组子和非目的重组子的概念。
1、遗传遗传表型直接筛选法
1.1根据载体选择标记初步筛选转化子
（1）抗药性筛选：①几种常用的抗药性选择标记产物类型，如Ap、Cm、Kn、Tc 等，两种遗传表型的表示方法。②为什么观察和确定转化子菌落的培养时间不宜过长，以12~16小时为宜？③实验组和对照组该不该长菌及其原因？
（2）插入失活筛选法：为什么要用双重标记？插入失活的具体做法。
（3）插入表达筛选法：例如pTR262质粒载体。
（4）显色互补筛选法：蓝白斑筛选；假若是麦康锴培养基，就不是蓝白斑，但筛选原理是一样的。
1.2营养缺陷型检测法：转化进来的外源基因产物弥补受体菌的突变型缺陷，使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。如何利用选择性培养基进行筛选？
1.3形成噬菌斑筛选法：将外源基因克隆到β-LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何进行筛选重组噬菌体？
2、依赖于重组子结构特征分析的筛选法
2.1快速裂解菌落鉴定分子大小：利用琼脂糖凝胶电泳时迁移速率的快慢鉴定重组子和非重组子。
2.2限制性核酸内切酶酶解分析法：利用重组质粒电泳条带多一条鉴定重组子和非重组子；并根据酶切图谱分析其插入方向。
2.3利用PCR方法筛选确定重组子：提取质粒DNA进行PCR，再对其产物进行电泳确定是否是重组子菌落。
3、核酸分子杂交检测法：概念及其原理
（1）Southern印记杂交、Northern印记杂交、斑点印记杂交、菌落原位杂交四种方法的比较及其操作过程。
（2）探针的概念及其三种制备方法；作为理性条件的探针需具备什么条件。4、免疫化学杂交（概念）
4.1抗体检测法：一抗、二抗和产物的结合进行检测
4.2酶联免疫吸附测定（ELISA）：概念及其检测的一般步骤。
4.3免疫沉淀检测法
4.4免疫印记法：关键是蛋白质电泳。
5、基因表达产物分析：①对于转录产物，用Northern印记杂交技术进行检测分析。②免疫化学检测基因产物：免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印记杂交、固相放射免疫法。
6、DNA序列分析：（详见第二章）原理、读码
第八章基因表达
1、外源基因在原核细胞中的表达
1.1原核生物基因表达的特点：①表达的调控：转录起始的调控
②利用原核生物进行表达的缺陷；③怎样实现外源基因在原核细胞中的正确有效表达？
1.2原核基因表达的调控序列：启动子、终止子、衰减子、SD序列等。
1.3几种常见的原核表达载体：①外源基因表达系统的概念②常用的大肠杆菌表达系统③融合蛋白和非融合蛋白的概念及其优缺点
1.4外源基因在大肠杆菌的表达部位：①细胞质：包涵体蛋白
②细胞周质③细胞外培养基
1.5提高外源基因表达效率的方法（或其影响因素）
其中①怎样减轻宿主细胞代谢负荷的影响
②提高表达蛋白的稳定性时，如何防止其降解？
1.6基因表达产物的检测：详见第七章①对于转录产物，用Northern印记杂交技术进行检测分析。②免疫化学检测基因产物：免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印记杂交、固相放射免疫法。
1.7重组子诱导表达条件的优化：诱导温度、养菌温度、诱导剂温度
2、外源基因在真核细胞中的表达
2.1酵母菌的载体系统：YIp、YRp、Yep
2.2酵母菌的转化系统：利用酵母的原生质球进行转化；利用Li+盐进行转化
2.3酵母菌的表达系统：有四种，重点是巴斯德毕赤酵母系统利用甲醇进行诱导。