第二章 可见分光光度法汇总
第二章紫外-可见分光光度法
物质是有颜色的,利用比较溶液本身或加入试剂后呈现出的颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量的方法为比色分析法。以人的眼睛来检测颜色的深浅的方法为目视比色法。以光电转化器件(如光电池)为检测器来区别颜色深浅的方法为光电比色法。
分光光度法是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用,对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。紫外光谱(UV)能够提供分子中的共轭体系的结构信息,可用于判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。红外光谱(IR)在未知结构化合物的鉴定中,主要用于功能基的确认,芳环取代类型的判断等。由于UV和IR只能给出分子中部分结构的信息,而不能给出整个分子的结构信息,能提供化合物的结构信息较少,所以单独以UV和IR不能确定分子结构,必须与NMR谱、MS谱以及其他理化方法结合才能得到可靠的结论。
紫外-可见分光光度法即是利用物质本身(或生成的有色化合物即“显色”后测定)对紫外及可见光的吸收进行测定,其特点:
①灵敏度高。可用于测定试样中1%-0.001%的微量成分,甚至可测低至10-6-10-7的痕量成分。
②准确度高。测定的相对误差为2%-5%,采用精密分光光度计时,可减少至1%-2%。特别适用于低含量和微量含量组分的测定,不适于中和高含量组分的测定。但如果采取适当的技术措施,比如示差法,也可测定高含量组分。
③适用范围广。
④操作简单,快速,仪器价格不昂贵。
⑤目前,分析仪器制造技术和计算机技术的结合使光度分析获得了新的活力。
2.1基本原理
2.1.1光的基本原理
2.1电磁表谱表
光谱名称波长范围跃迁类型分析方法
X射线0.1-10nm K和L层电子X射线光谱法
紫外10-380nm 10-20中层电子,200-380价电子紫外光度法
可见380-780nm 380-780价电子比色及可见光度法
红外0.78-1000μm 分子振动红外光谱法
微波0.1-100cm 微波光谱法
无线电波1-1000m 核磁共振光谱法
2.1.2溶液颜色与光吸收的关系
物质呈现的颜色与光有密切的关系,不同波长的可见光可使眼睛感觉到不同颜色。
具有同一种波长的光,称为单色光。含有多种波长的光为复合光。当将某两种颜色的光按适当强度比例混合时,可以形成白光,这两种色光就称为互补色。
2.2光的吸收定律
2.2.1透光度和吸光度
设入射光强度为I 0,吸收光强度为I a ,透射光强度为 I t ,反射光强度为I r ,则 I 0= I a + I t + I r
由于反射光强度基本相同,其影响可相互抵消,上式可简化为: I 0= I a + I t
透光度:透光度为透过光的强度It 与入射光强度I0之比,用T 表示: T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数,用A 表示, A=lg1/T=lgI0/It 2.2.2朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律:当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时,溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比,即
A= κ cl
式中比例常数κ与吸光物质的本性,入射光波长及温度等因素有关。c 为吸光物质浓度,l 为透光液层厚度。
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 2.2.3吸光系数
当l 以cm ,c 以g/L 为单位,κ称为吸光系数,用 a 表示。A= a cl a 的单位为L/(g.cm)
当l 以cm ,c 以mol/L 为单位,κ称为摩尔吸光系数,用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm ,它表示物质的浓度为1mol/L
,液层厚度为1cm 时,溶液的吸光度。
比吸光系数是指百分含量为1%, l 为1cm 时的吸光度值,用 表示。 2.2.4偏离朗伯-比耳定律的因素 (1)入射光为非单色光 (2)溶液的不均性。
实际样品的混浊,加入的保护胶体,蒸馏水中的微生物,存在散射以及共振发射等,均可吸光质点的吸光特性变化大。
(3)光程的不一致性。
光源不是点光源,比色皿光径长度不一致,光学元件的缺陷引起的多次反射等,均造成光径不一致,从而与定律偏离。
2.3紫外-可见分光光度计 2.
3.1主要部件的性能与作用
入射光 I 透射光 I %
11cm E
基本结构:
① 光源
在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯,波长范围是350-1000 nm 。 在紫外区常为氢灯或氘灯,发射的连续波长范围是180-360 nm 。 ②单色器
单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件,最常见的色散元件是棱镜和光栅。
狭缝:将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨 率。狭缝越小,光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。
棱镜:玻璃350~3200 nm ,石英185~4000 nm 。
光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便。
1.入射狭缝
2.准直透镜
3.棱镜
4.聚焦棱镜
5.出射狭缝
③吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯,按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池,前者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多,其光径可在0.1~10cm 之间,其中以1cm 光径吸收池最为常用。
5
光源 单色器 样品池 检测器 显示器
④检测器
检测器的作用是检测光信号,并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。
⑤信号显示系统
常用的信号显示装置有直读检流计,电位调节指零装置,以及自动记录和数字显示装置等。
2.3.2紫外-可见分光光度计的类型
分光光度计按仪器使用波长分类:
①真空紫外分光光度计(0.1-200 nm);
②可见分光光度计(350-700 nm);
③紫外-可见分光光度计(190-1100 nm);
④紫外-可见-红外分光光度计(190-2500 nm);
如果按仪器使用的光学系统分类:
①单光束分光光度计;
②双光束分光光度计
③双波长分光光度计
④动力学分光光度计
单波长单光束分光光度计
经单色器分光后的一束平行光,轮流通过参比溶液和样品溶液,以进行吸光度的测定。其简单,价廉,适于在给定波长处测量吸光度或透光度,一般不能作全波段光谱扫描,要求光源和检测器具有很高的稳定性。
目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易,适用于常规分析。
单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。
单波长双光束分光光度计
经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光,一束通过参比池,一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度,此比值即为试样的透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。自动记录,快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。仪器复杂,价格较高。
单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。
双波长分光光度计
由同一光源发出的光被分成两束,分别经过两个单色器,得到两束不同波长(λ1和λ2)的单色光;通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池,然后由检测器交替接收信号,最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。无需参比池。△A就是扣除了背景吸收的吸光度。
双波长分光光度计的优点:是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。
国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等都是双波长分光光度计。
动力学分光光度计
解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中,能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。其特点:时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。
2.3.3紫外-可见分光光度计主要技术指标
①波长范围:表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大,仪器越好,这与仪器使用的灯有关。
②波长精度:表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小,仪器精度越高,这与仪器使用的单色器有关。
③杂散光:表示单色光的纯度,这与制作单色器的材料和加工工艺有关。
④光度的测量精度:表示仪器每次测定显示读数的精确度,即仪器能准确读小数点后几位。位数越多,仪器精度越高,这与仪器使用的检测系统有关。
⑤光度测量的重现性:每次A读数的重现性,这与仪器使用的检测器的质量有关。
⑥分辨率:表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力,即指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距,这是衡量仪器性能的一个综合指标。
2.3.4分光光度计的校正和检验
①波长校正
②吸光度校正
③杂散光的检验
④稳定性的检验
2.4分析条件的选择
2.4.1仪器测量条件的选择
2.4.1.1适宜的吸光度范围
由朗伯-比尔定律可知:
A=lg1/T=εcl
微分后得:
dlgT=0.4343dT/T= -εl d c
或0.4343ΔT/T= -εlΔc
代入朗伯-比尔定律有:
Δc/c=0.4343ΔT/TlgT
要使测定的相对误差Δc/c最小,求导取极小得出:
lgT=-0.4343=A
即当A=0.4343时,吸光度测量误差最小。
最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。
2.4.1.2入射光波长的选择
通常是根据被测组分的吸收光谱,选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形
比较尖锐时,往往选用吸收稍低,峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。
2.4.1.3狭缝宽度的选择
为了选择合适的狭缝宽度,应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说,狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。
2.4.2显色反应条件的选择
在光度分析中,将试样中被测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应。能与被测组分生成有色物质的试剂称为显色剂。对多种物质进行测定,常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有络合反应,配位反应、氧化还原反应等。
这些显色反应,必须满足以下条件:
①反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力,即摩尔吸光系数较大;
②反应有较高的选择性,即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别;
③反应生成的产物有足够的稳定性,以保证测量过程中溶液的吸光度不变;
④反应生成物的组成恒定。
2.4.2.1显色剂用量(M+R→MR)
在实际选用时,一般通过实验来确定:待测组分的浓度和其他条件不变,分别加入不同量的显色剂,分别测定它们的吸光度,以吸光度为纵坐标,显色剂用量为横坐标作图。在对应于吸光度恒定时对应的显色剂浓度区间内确定显色剂的用量。
2.4.2.2显色时间和反应温度
不同的显色反应的速度不同,而且反应温度对反应的速度以及反应产物等均有影响。因此,需要根据反应性质选择合适的显色时间和反应温度。
2.4.2.3反应体系的酸度
酸度对吸光光度分析的影响很复杂,它可以影响配合反应的进行程度,改变金属离子的存在形式和显色剂的颜色,为了选择合适的PH,必须综合考虑各方面的影响,适宜的酸度要由实验来确定。
2.4.2.4采用适当的手段消除干扰物质的干扰
分离物与干扰物的分离:通过前处理,使分析物与干扰物相互分离,然后进行分析,常用的分离方法有:萃取法、离子交换法、电解法、色谱法等。
加入掩蔽剂:在被测液中加入与干扰物质产生稳定的无色络合物的试剂,使干扰物不与显色剂作用。
选择适当的波长:一般选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时,应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。
2.4.3参比溶液的选择
测定试样溶液的吸光度,需先用参比溶液调节透光度(吸光度为0)为100%,以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。
参比溶液的选择视分析体系而定,具体有:
①溶剂参比试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱,只考虑消除溶剂与吸收池等因素;
②试样参比如果试样基体溶液在测定波长有吸收,而显色剂不与试样基体显色时,可按与显色反
应相同的条件处理试样,只是不加入显色剂。
③试剂参比如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收,按显色反应相同的条件,不加入试样,同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。
④平行操作参比用不含被测组分的试样,在相同的条件下与被测试样同时进行处理,由此得到平行操作参比溶液。
2.5 测定方法
2.5.1单组分定量方法
单组分是指样品溶液中含有一种组分,或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。
1 标准曲线法
方法:配制一系列不同含量的标准溶液,选用适宜的参比,在相同的条件下,测定系列标准溶液的吸光度,作A-c曲线,即标准曲线,也可用最小二乘数处理,得线性回归方程。
在相同条件下测定未知试样的吸光度,从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液,在相同的条件下,测定各自的吸光度,建立朗伯-比尔定律,解方程求出未知样浓度与含量。
具体实验步骤:
(1)标准溶液的配制
(2)供试样品溶液的配制
(3)最大波长的确定(波长扫描)
(4)标准曲线的绘制
(5)供试样品含量测定
2.6仪器的使用操作及维护
2.6.1仪器的操作规程
2.6.1.1准备工作
①打开光度计主机电源(预热20-30 min)。
②开启计算机电源。
③双击[UV-Probe]图标,即启动UV-2450的控制程序。
④单击[连接]键,进入光度计自检,自检过程中切勿开启样品室门。自检完毕后,单击[确定]键进入检测界面。
2.6.1.2 测定
①光谱扫描
参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量、光谱测定、数据处理。
②光度测定
参数和显示的设置、空白基线校正、标准品测量、
供试品测量。
③动力学测定
参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量。
④仪器使用完毕,取出样品室内吸收池,退出UV-Probe软件系统。
⑤关闭计算机。
⑥关闭光度计电源。
⑦按要求做好仪器使用登记。
2.6.2仪器的维护
2.6.2.1温度和湿度,室温保持在15~35℃,相对湿度宜控制在45%~80%。防尘、防震、防电磁干扰,仪器周围不应有强磁场。不要暴露在阳光直射的地方,不要放在有腐蚀性气体或在UV波长范围内有吸收的有机和无机气体的环境内。
2.6.2.2如果开机后钨灯和氘灯不亮,应首先检查保险丝。若断了应更换新的保险丝。注意更换保险丝时,关闭电源开关并切断电源。
2.6.2.3为了防止光电管疲劳,不测定时必须将比色皿暗箱盖打开,使光路切断,以延长光电管使用寿命。
2.6.2.4光度计灯源寿命有限,若长时间不测量,应通过UVProbe软件断开连接(点击“Disconnect”),然后关闭光度计电源。
2.6.2.5仪器自检和扫描的过程中,不要打开样品室盖。
2.6.2.6软件不会自动保存数据,所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。
2.6.2.7样品室的出射和入射石英窗不应有污染,不要用手触摸样品室中透光窗面,若不小心接触过,要用无水乙醇擦拭。
2.6.2.8.比色皿的使用方法
①拿比色皿时,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。
②清洗比色皿时,一般先用水冲洗,再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污,可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1∶2)浸泡片刻,再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿,以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿,以免损伤它的透光面。每次做完实验时,应立即洗净比色皿,用干净绸布或擦镜纸擦干,晾干后,放入吸收池盒中,防尘保存。
③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干,避免硬的物品把透光面划伤,以保护透光面。
④测定有色溶液吸光度时,一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次,以免改变有色溶液的浓度。另外,在测定一系列溶液的吸光度时,通常都按由稀到浓的顺序测定,以减小测量误差。
⑤吸收池装盛样品以池体的4/5为度,使用挥发性溶液时应加盖。
2.6.2.9注意软件的正常交流,防止计算机病毒感染。
2.6.2.10在停止工作期间,主机样品室内应放入袋装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器。
2.6.3操作规程问题处理:
2.6.
3.1仪器不能初始化
检查光路是否受堵;关机(电脑及UV)重启;如不成功,查看说明书;
2.6.
3.2数据或谱图波动大
调零是否正确(重新调零)、参比样值是否过大(如果吸收值大于2.0,可能会出现波动大)。
2.6.
3.3基线不能平整(允许波动范围在±0.001之间)
扫描速度是否过快(改“快速”扫描为“中速”扫描或更低)、波长范围是否过窄(扩大扫描波长范围)。2.6.3.4吸收值异常
波长设置是否正确(重新调整波长,并重新调零)、测量时是否调零(如被误操作,重新调零)、比色皿是否用错(测定紫外波段时,要用石英比色皿)、样品准备是否有误(如有误,重新准备样品)。
2.6.
3.5数据不稳
预热时间不够(预热20分钟以上);环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等;光电管、电路等其它原因(送修)。
紫外可见分光光度法
1、什么是透光率?什么是吸光度?什么是百分吸光系数和摩尔吸光系数 2、举例说明生色团和助色团,并解释长移和短移。 4、电子跃迁有哪几种类型?跃迁所需的能量大小顺序如何?具有什么样结构的化合物产生紫外吸收光谱?紫外吸收光谱有什么特征? 5、以有机化合物的基团说明各种类型的吸收带,并指出各吸收带在紫外—可见吸收光谱中的大概位置和各吸收带的特征。 6、紫外吸收光谱中,吸收带的位置受哪些因素影响? 8、用紫外光谱法定量,测量最适宜的吸光度范围为0.2-0.7的依据是什么?为什么用高精度的仪器此范围可以扩大? 11、简述用紫外分光光度法定性鉴别未知物的方法。 13、说明双波长消去法的原理和优点。怎样选择λ1λ2? 15、为什么最好在λmax处测定化合物的含量? 2、Lambert-Beer定律是描述与和的关系,它的数学表达式是 3、紫外-可见分光光度法定性分析的重要参数是和;定量分析的依据是 4、在不饱和脂肪烃化合物分子中,共轭双键愈多,吸收带的位置长移愈多,这是由于 6、可见--紫外分光光度计的光源,可见光区用灯,吸收池可用材料的吸收池,紫外光区光源用灯,吸收池必须用材料的吸收池 10、分光光度法的定量原理是定律,它的适用条件是和,影响因素主要有、。 11、可见-紫外分光光度计的主要部件包括、、、、和5个部分。在以暗噪音为主的检测器上,设△T=0.5%,则吸收度A的测量值在间,由于测量透光率的绝对误差小,使结果相对误差△c/c的值较小。 15、在分光光度法中,通常采用作为测定波长。此时,试样浓度的较小变化将使吸光度产生变化 1、紫外-可见分光光度法的合适检测波长范围是( ) A.400-800 nm B.200-400nm C.200~800nm D.10~200nm 2、下列说法正确的是( )o A.按比尔定律,浓度C与吸光度A之间的关系是一条通过原点的直线 B.比尔定律成立的必要条件是稀溶液,与是否单色光无关 C.E称吸光系数,是指用浓度为1%(W/V)的溶液,吸收池厚度为lcm时所测得吸光度值 D.同一物质在不同波长处吸光系数不同,不同物质在同一波长处的吸光系数相同 3、在乙醇溶液中,某分子的K带λmax计算值为385nm, λmax测定值388nm,若改用二氧六环及水为溶剂,λmax计算值估计分别为( ) (已知在二氧六环和水中的λmax校正值分别为-5和+8) A .二氧六环中390nm,水中37 7nm B.二氧六环中380nm,水中393 nm C.二氧六环中383nm,水中396nm D.二氧六环中393nm,水中380nm 6、1,3-丁二烯有强紫外吸收,随着溶剂极性的降低,其λmax将( ) A.长移 B.短移 C.不变化,但ε增强D.不能断定 8、在紫外-可见光谱分析中极性溶剂会使被测物吸收峰()
实验五--分光光度法测定甲醛
实验五:空气中甲醛的测定(酚试剂分光光度法) 实验目的: 掌握甲醛测定方法; 熟练掌握大气采样器和分光光度计的使用; 实验原理: 甲醛的测定方法:分光光度法、气相色谱法、酚试剂分光光度法、乙酰丙酮分光光度法; 空气中的甲醛与3-甲基2-苯并噻唑酮腙酚试剂反应生成嗪,嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物,颜色深浅与甲醛含量成正比,物质的最大吸收波长为630nm,通过比色定量。当采样体积为10L时最低检出质量浓度为0.01mg/m3。 实验仪器: 分光光度计(在630nm测定);大气采样器;具塞比色管(10ml);分析天平;滴定管;容量瓶;量筒;移液管等 1、吸收液原液:称量0.10g酚试剂[C6H4SN(CH3)C:NNH2·HCl,简称NBTH],加水溶解,倾于100ml具塞量筒中,加水到刻度。放冰箱中保存,可稳定三天。吸收液:量取吸收原液5ml,加95ml水,即为吸收液。采样时,临用现配。 2、1%硫酸铁铵溶液 3、碘溶液[C(1/2I2)=0.1000mol/L] 4、1mol/L氢氧化钠溶液 5、0.5mol/L硫酸溶液:取28ml浓硫酸缓慢加入水中,冷却后,稀释至1000ml。 6、硫代硫酸钠标准溶液[C(Na2S2O3)=0.1000mol/L] 0.5%淀粉溶液:将0.5g可溶性淀粉,用少量水调成糊状后,再加入100ml沸水,并煎沸2~3min至溶液透明确。 7、甲醛标准贮备溶液:取2.8ml含量为36~38%甲醛溶液,放入1L容量瓶中,加水稀释至刻度。此溶液1ml约相当于1mg甲醛。其准确浓度用下述碘量法标定。 实验步骤: 1、样品采集:用一个内装5ml吸收液的大型气泡吸收管,以0.5L/min流量,采气10L。并记录采样点的温度和大气压力。采样后样品在室温下应在24h内分析。 2、甲醛标准贮备溶液的标定:精确量取20.00ml待标定的甲醛标准贮备溶液,置于250ml 碘量瓶中。加入20.00ml[C(1/2I2)=0.1000mol/L]碘溶液和15ml 1mol/L氢氧化钠溶液,放置15min,加入0.5mol/L硫酸溶液,再放置15min,用[C(Na2S2O3)=0.1000mol/L]硫代硫酸钠溶液滴定,至溶液呈现淡黄色时,加入1ml 5%淀粉溶液继续滴定至恰使兰色褪去为止,记录所用硫代硫酸钠溶液体积(V2),ml。同时用水作试剂空白滴定,记录空白滴定所用硫化硫酸钠标准溶液的体积(V1),ml。甲醛溶液的浓度用公式(1)计算:甲醛溶液浓度(mg/ml)=(V1-V2)×N×15/20 (1) 式中:V1――试剂空白消耗[C(Na2S2O3)=0.1000mol/L]硫代硫酸钠溶液的体积,ml; V2――甲醛标准贮备溶液消耗[C(Na2S2O3)=0.1000mol/L]硫代硫酸钠溶液的体积,ml;N――硫代硫酸钠溶液的准确当量浓度; 15――甲醛的当量; 20――所取甲醛标准贮备溶液的体积,ml。 二次平行滴定,误差应小于0.05ml,否则重新标定。 绘制标准曲线: 用1.00μg/ml甲醛标准溶液,按下表制各标准色列管
实验分光光度法测定铁
实验分光光度法测定铁 The following text is amended on 12 November 2020.
实验十四邻二氮菲分光光度法测定铁的含量 一、实验目的 1.学习吸光光度法测量波长的选择方法; 2.掌握邻二氮菲分光光度法测定铁的原理及方法; 3. 掌握分光光度计的使用方法。 二、实验原理 分光光度法是根据物质对光选择性吸收而进行分析的方法,分光光度法用于定量分析的理论基础是朗伯比尔定律,其数学表达式为:A=εb C 邻二氮菲(又称邻菲罗啉)是测定微量铁的较好试剂,在pH=2~9的条件下,二价铁离子与试剂生成极稳定的橙红色配合物。摩尔吸光系数ε=11000 L·mol-1·cm-1。在显色前,用盐酸羟胺把Fe3+还原为Fe2+。 2Fe3++2NH 2OHHCl→2Fe2++N 2 +4H++2H 2 O+2Cl- Fe2+ + Phen = Fe2+ - Phen (橘红色) 用邻二氮菲测定时,有很多元素干扰测定,须预先进行掩蔽或分离,如钴、镍、铜、铅与试剂形成有色配合物;钨、铂、镉、汞与试剂生成沉淀,还有些金属离子如锡、铅、铋则在邻二氮菲铁配合物形成的pH范围内发生水解;因此当这些离子共存时,应注意消除它们的干扰作用。 三、仪器与试剂 1.醋酸钠:l mol·L-1; 2.盐酸:6 mol·L-1; 3.盐酸羟胺:10%(用时配制); 4.邻二氮菲(%):邻二氮菲溶解在100mL1:1乙醇溶液中; 5.铁标准溶液。 (1)100μg·mL-1铁标准溶液:准确称取(NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 ·12H 2 0于烧杯中, 加入20 mL 6 mol·L-1盐酸及少量水,移至1L容量瓶中,以水稀释至刻度,摇匀. 6.仪器:7200型分光光度计及l cm比色皿。 四、实验步骤 1.系列标准溶液配制 (1)用移液管吸取10mL100μg·mL-1铁标准溶液于100mL容量瓶中,加入2mL 6 mol·L-1盐酸溶液, 以水稀释至刻度,摇匀. 此溶液Fe3+浓度为10μg·mL-1. (2) 标准曲线的绘制: 取50 mL比色管6个,用吸量管分别加入0 mL,2 mL,4 mL, 6 mL, 8 mL和10 mL10μg·mL-l铁标准溶液,各加l mL盐酸羟胺,摇匀; 经再加2mL邻二氮菲溶液, 5 mL醋酸钠溶液,摇匀, 以水稀释至刻度,摇匀后放置 10min。 2.吸收曲线的绘制 取上述标准溶液中的一个, 在分光光度计上,用l cm比色皿,以水为参比溶液,用不同的波长,从440~560 nm,每隔10 nm测定一次吸光度,在最大吸收波长
紫外可见分光光度法练习题(供参考)
紫外-可见分光光度法 一、单项选择题 1.可见光的波长范围是 A、760~1000nm B、400~760nm C、200~400nm D、小于400nm E、大于760nm 2.下列关于光波的叙述,正确的是 A、只具有波动性 B、只具有粒子性 C、具有波粒二象性 D、其能量大小于波长成正比 E、传播速度与介质无关 3.两种是互补色关系的单色光,按一定的强度比例混合可成为 A、白光 B、红色光 C、黄色光 D、蓝色光 E、紫色光 4.测定Fe3+含量时,加入KSCN显色剂,生成的配合物是红色的,则此配合物吸收了白光中的 A、红光 B、绿光 C、紫光 D、蓝光 E、青光 5.紫外-可见分光光度计的波长范围是 A、200~1000nm B、400~760nm C、1000nm以上 D、200~760nm E、200nm以下 6.紫外-可见分光光度法测定的灵敏度高,准确度好,一般其相对误差在 A、不超过±0.1% B、1%~5% C、5%~20% D、5%~10% E、0.1%~1% 7.在分光光度分析中,透过光强度(I t)与入射光强度(I0)之比,即I t / I0称为 A、吸光度 B、透光率 C、吸光系数 D、光密度 E、消光度8.当入射光的强度(I0)一定时,溶液吸收光的强度(I a)越小,则溶液透过光的强度(I t) A、越大 B、越小 C、保持不变 D、等于0 E、以上都不正确9.朗伯-比尔定律,即光的吸收定律,表述了光的吸光度与 A、溶液浓度的关系 B、溶液液层厚度的关系 C、波长的关系 D、溶液的浓度与液层厚度的关系 E、溶液温度的关系 10.符合光的吸收定律的物质,与吸光系数无关的因素是 A、入射光的波长 B、吸光物质的性质 C、溶液的温度 D、溶剂的性质 E、在稀溶液条件下,溶液的浓度 11.在吸收光谱曲线上,如果其他条件都不变,只改变溶液的浓度,则最大吸收波长的位置和峰的
紫外可见分光光度法含量测定
【含量测定】照紫外-可见分光光度法(附录V A)测定。 1.仪器与测定条件:室温:____℃相对湿度:____% 分析天平编号:;水浴锅编号:; 紫外可见分光光度计编号:; 2.对照品溶液的制备: 取西贝母碱对照品适量,精密称定,加三氯甲烷制成每1ml含_______mg的溶液,即得。 3. 供试品溶液的制备: 取本品粉末(过三号筛)约______g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加浓氨试液3ml,浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40ml,置80℃水浴加热回流2小时,放冷,滤过,滤液置50ml量瓶中,用适量三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液洗涤药渣2~3次,洗液并入同一量瓶中,加三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液至刻度,摇匀,即得。 4.标准曲线的制备: 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1.0ml,置25ml具塞试管中,分别补加三氯甲烷至10.0ml,精密加水5ml、再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05g,用0.2mol/L氢氧化钠溶液6ml使溶解,加磷酸二氢钾1g,加水使溶解并稀释至100ml,即得)2ml,密塞,剧烈振摇,转移至分液漏斗中,放置30分钟。取三氯甲烷液,用干燥滤纸滤过,取续滤液,以相应的试剂为空白。 5.测定法: 照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA),在nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。依法测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中含西贝母碱的重量,计算,即得。 6.结果与计算 6.1 标准曲线制备:
对照品批号 纯 度 S 对照品来源 干燥条件 对照品称重W 对(mg) 各浓度点稀释倍数f 对 溶液浓度C 对(ug/ml) 吸光度A 对 线性回归方程 A=( )C +/-( ) r =( ) 计算公式: W S C f ?= 对对对 C 对= 6.2 样品测定: 水分Q 取样量W 样(g ) 样品稀释倍数f 样 样品吸光度A 样 样品平均吸光度A 样 浓度C(ug/ml) 含量X (%) 平均含量X (%) 计算公式:() %100Q 110W f C X 6 ?-???= 样样 样 X 1= X 2= 7.本品按干燥品计算,含总生物碱以西贝母碱(C 27H 43NO 3)计,不得少于0.050%。 结果: 规定 检验人: 检验日期: 复核人: 复核日期:
分光光度法考试题例
艾科锐公司化学基础知识考试题 分光光度法 科室姓名成绩时间 一、单项选择题(20分) 1、一束___通过有色溶液时,溶液的吸光度与浓度和液层厚度的乘积成正比。(B ) A、平行可见光 B、平行单色光 C、白光 D、紫外光 2、________互为补色。(A ) A、黄与蓝 B、红与绿 C、橙与青 D、紫与青蓝 3、摩尔吸光系数很大,则说明_____(C ) A、该物质的浓度很大 B、光通过该物质溶液的光程长 C、该物质对某波长光的吸收能力强 D、测定该物质的方法的灵敏度低。 4、下述操作中正确的是_____。(C ) A、比色皿外壁有水珠 B、手捏比色皿的磨光面 C、手捏比色皿的毛面 D、用报纸去擦比色皿外壁的水 5、用邻菲罗啉法测定锅炉水中的铁,pH需控制在4~6之间,通常选择____缓冲溶液较合适。(D ) A、邻苯二甲酸氢钾 B、NH3—NH4Cl C、NaHCO3—Na2CO3 D、HAc—NaAc 6、紫外-可见分光光度法的适合检测波长范围是_______。(C ) A、400~760nm; B、200~400nm C、200~760nm D、200~1000nm 7、邻二氮菲分光光度法测水中微量铁的试样中,参比溶液是采用_____。(B ) A、溶液参比; B、空白溶液; C、样品参比; D、褪色参比 8、722型分光光度计适用于________。(A ) A、可见光区 B、紫外光区 C、红外光区 D、都适用 9、722型分光光度计不能测定________。(C ) A、单组分溶液 B、多组分溶液 C、吸收光波长>800nm的溶液 D、较浓的溶液 10、下列说法正确的是________。(B ) A、透射比与浓度成直线关系; B、摩尔吸光系数随波长而改变; C、摩尔吸光系数随被测溶液的浓度而改变; D、光学玻璃吸收池适用于紫外光区 11、控制适当的吸光度范围的途径不可以是(C ) A、调整称样量 B、控制溶液的浓度 C、改变光源 D、改变定容体积12.双波长分光光度计与单波长分光光度计的主要区别在于(B ) A. 光源的种类及个数 B. 单色器的个数 C. 吸收池的个数 D. 检测器的个数 比尔定律的范围内,溶液的浓度、最大吸收波长、吸光度三者-在符合朗伯特13.的关系是(B ) A. 增加、增加、增加 B. 减小、不变、减小 C. 减小、增加、减小 D. 增加、不变、减小
分光光度法-生化实验
常用生化实验技术:分光光度法有色溶液对光线有选择性的吸收作用,不同物质由于其分子结构不同,对不同波长光线的吸收能力也不同,因此,每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液,虽对可见光无吸收作用,但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光光度法主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术,其理论依据是Lambert和Beer定律。 分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区,分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光通过滤光片产生,谱带宽度为40~120nm,精度不高,而分光光度法则要求近于真正单色光,其光谱带宽最大不超过3~5nm,在紫外光区可到l nm以下。单色光通过棱镜或光栅产生,具有较高的精度。 一、光的基本知识 光是由光量子组成的,具有二重性,即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征,可用下式表示: λ=C/υ 式中λ为波长,具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。υ为频率,即每秒钟振动次数。c为光速,等于299 770±4km/s。光属于电磁波。 自然界中存在各种不同波长的电磁波,列成表l-l所示的波谱图。分光光度法所使用的光谱范围在200nm~10μm (1μm=1 000nm)之间。其中200~400nm为紫外光区,400~760nm为可见光区,760~10 000 nm为红外光区。 二、朗伯一比尔(1ambert—Beer)定律 朗伯—比尔定律是比色分析的基本原理,这个定律是讨论有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。此定律是由朗伯定律和比尔定律归纳而得。 1.朗伯定律一束单色光通过溶液后,由于溶液吸收了一部分光能,光的强度就要减弱:若溶液浓度不变,则溶液的厚度愈大(即光在溶液中所经过的途径愈长),光的强度减低也愈显著。 设光线通过溶液前的强度为Io(入射光的强度),通过液层厚为L溶液后.光的强度为I t(透过光的强度),则 表示透过光的强度是入射光强度的几分之几,称为透光度(transmittance),用T表示。透光度随溶液厚度的增