急性毒性试验[1].

实验一急性毒性试验(Acute Cytotoxicity Test)

一、实验目的：

了解生物材料急性毒性的含义，掌握急性毒性试验的基本方法。

二、实验原理：

医学上通常指的急性毒性试验是对药物而言的，并以半数致死量（median lethal dose, LD50）来衡量药物急性毒性的大小。所谓LD50是指某一药物使试验动物总体死亡一半的剂量，由于LD50是剂量反应曲线上最敏感的一点，而且有易测、准确和重复性好的优点，以此作为药物使用的安全指标。但对于生物材料而言，它与药物在体内的反应机理不同，大多数生物材料不能计算LD50，所以在试验过程中，通过对实验动物进行动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在24、48和72h的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定某种生物材料的急性毒性作用。

三、实验对象：小鼠

四、实验器材和药品：

聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA），蒸馏水，生理盐水（0.9％），注射器（1ml），量筒（10ml），小烧杯（50、100ml），高压消毒器。

五、实验步骤：

1．浸提液制备：

按评价标准裁剪试样，选择适当浸提温度制备浸提液。

2．将10只体重在17～23g间的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。

3．将浸提液按每公斤小鼠体重注射50ml于实验组小鼠尾静脉（50ml/kg），用生理盐水按同样方法作空白对照。

4．记录试样表面积和使用浸提液的容量；记录注射后24h、48h、72h两组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。

六、评价方法：

2．结果判断标准：

2．1 在72h观察期内，注射材料浸提液的动物反应不大于对照组动物，则认为该材料符合急性毒性试验要求。

2．2在72h观察期内，注射材料浸提液动物中有2只以上出现轻度毒性症状或仅1只动物出现明显毒性症状死亡，或实验组5只动物的体重均下降，即使无其他中毒症状都要进行重复试验。

2．3 重复试验的动物数量应加倍，即每组需10只小鼠。浸提液应该重新制备。重复试验若符合2．1 项要求，则认为该材料合格。

2．4 如实验组动物有2只以上发生死亡或3只以上出现明显毒性症状或动物普遍出现进行性体重下降，则不需要重复试验，可认为该材料不符合急性毒性试验要求。

附：小鼠静脉注射方法

小鼠的尾部有三条静脉，一般采用两侧的静脉。把动物固定在暴露尾部的固定器内（可用烧杯、铁丝罩或粗试管邓物代替固定器）。拔去尾部静脉走向的毛，置尾巴于40～500C 温水中浸泡几分钟，或用75％乙醇棉球反复擦抹，使尾部血管扩张。行尾部注射时，尽量采用与尾部平行的角度进针，抽吸法不能验证是否穿刺成功，开始注药时应尽量缓慢，仔细观察，如果有白色皮丘出现，说明未刺入血管，应重新向尾部方向移动针头，再次穿刺，直至注射时无皮丘出现，才能正式注射药物，有时在注射药物的同时可见静脉血被进去的药物向前推进。

实验二致热源试验(hypersusceptibility test)

一、实验目的：

掌握致热源实验的基本方法。

二、实验原理：

致热源试验是通过被测材料或其浸提液注入实验动物体内，若浸提液存在热源物质，作用于单核细胞、巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内出性热源，作用于丘脑体温调节中枢，使动物体温上升，因此，观察动物的体温变化可用来判断该材料或其浸提液中所含热源量是否符合人体的要求。

三、实验对象：兔

四、实验器材和药品：

硅橡胶、蒸馏水、生理盐水（0.9℅）、注射器（50ml）、烧杯(150ml)、量筒（100ml）、高压消毒器、体温计（肛测）。

五、实验步骤：

1．浸提液制备：

1.1将所有与浸提液接触的容器、量器等玻璃器皿均应先置于干燥箱内250℃加热30min，或180℃加热2h去除热原物质。

1.2 浸提液所用灭菌0.9℅生理盐水应是热原检查合格者，试样浸提前应用同一批号灭

菌的0.9℅生理盐水溶液冲洗3次。

1.3 按评价要求裁剪试样，选择适当的浸提温度获得浸提液。

按评价标准裁剪试样，先用清水洗净，再用蒸馏水冲洗三次，用生理盐水冲洗一次，置于烧杯中，按试样与浸提介质比例注入适量的生理盐水，封口。

2．实验前的准备：

2．1 实验动物的选择：

选用健康、成年的新西兰兔，体重2.5～3.0kg。

2．2 对实验动物试验前的要求：

试验前应对试验动物进行体温测量，在体温测量前7日应在同一条件下使用同一饲料进行喂养，使其在此期间体重不减轻，精神、食欲、排泄等不应有异常现象。

在试验前1～2日，应让试验用兔尽可能处于同一温度环境中，饲养室和试验室的温度也尽可能相同。在试验过程中，应注意温度变化不得太大，应避免兔躁动并停止给食2h以上。

2．3 实验动物的体温测量：

在实验前7日内预测体温，每隔1h测量体温一次，共测4次，4次体温均在38.3～38.60C 之间，最高和最低的体温差数不超过0.40C。

2．4 体温测量方法和时间：

选用肛温计测量直肠内温度，肛温计插入深度一般约为6cm左右，时间5～10min。

3．试验过程：

3．1选用3只符合要求的试验兔，测定其正常体温后15min内，自耳静脉缓慢注入试验材料浸提液，剂量为10ml/kg，液体温度为370C。

3．2 注射后每隔1h测量兔体温1次共测3次，以3次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔的升高度数。

六、结果判断标准：

1．在试验的3只试验兔中，体温升高均在0.60C以下，并且体温升高总度数在1.40C 以下，则认为试验材料浸提液符合热源检查要求。

2．若3只试验兔中仅有1只体温升高0.60C或0.60C以上，或3只试验兔体温均低于

0.60C，但升高总数在1.40C或1.40C以上时，应另取5只兔复试。在复试的5只兔中，体温

升高0.60C或0.60C以上的总数仅有1只,，并且初复试合并8只试验兔的体温升高总数不超过3.50C时，则认为试验材料浸提液符合热源检查要求。

3．若初试的3只试验兔中，体温升高0.60C或0.60C以上的兔数超过1只时,或在复试的5只试验兔中，体温升高0.60C或0.60C以上的兔数超过1只时,或在初复试合并8只兔的体温升高超过3.50C，均认为试验材料浸提液不符合热源检查的要求。

4．将所有温度下降的反应都计为无温度上升。

注：兔正常体温为39.0(38.5～39.50)℃

附：兔耳静脉注射方法

兔一般采用耳缘静脉。兔耳中央为动脉，内外缘为静脉。内缘静脉不易固定，很少选用。外缘静脉表浅易固定，常用作注射部位。注射时先拔去注射部位的皮毛，用手指弹动或轻柔兔耳，使静脉充盈。左手示指和中指尖夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，环指及小指垫在下面，右手持注射器靠远心端刺入静脉，针头朝向近心端。当穿刺成功后，移动拇指于针头上，将兔耳与针头牢固捏在一起，放松示指和中指，将药注入后，拔出针头，用手指压迫针眼直至不流血为止，不可用中央动脉注射药物，以免药物损伤兔耳。

实验三皮内刺激试验（Stimulation in Skin Test）

一、实验目的：

掌握皮内刺激试验的基本操作。

二、实验原理：

本实验通过皮内注射生物材料的浸提液，观察局部皮肤反应以评价生物材料浸提液是否具有潜在的非特异性急性刺激作用。该试验为一高敏感性试验，可广泛用于评价与人体各部分接触的生物材料的可沥滤物质非特异性急性毒性作用。通常采用试验材料或其浸提液在动物或人体合适的部位进行试验，按试验部位形成的红斑、疤痕和水肿程度来衡量材料的刺激性。

三、实验对象：家兔

四、实验器材和药品：

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，蒸馏水，生理盐水，蓖麻油，注射器（2ml）、烧杯（50ml）五、实验步骤：

1．浸提液制备：

2．实验动物的选择和要求：

2．1 健康家兔，不限性别，体重2.0～2.5kg，皮肤光滑，无任何皮肤疾病或损伤，未做过任何实验。

2．2 在实验过程中应精心喂养和护理，条件环境基本稳定。

2．3 本实验需要3只兔子，若实验结果可疑，则需要重复实验。

3．实验方法：

3．1 以脊柱为中线，两侧剪剃兔毛25cm10cm大小，注意剪剃过程中避免造成任何损伤。

3．2 清洁暴露的皮肤，酒精消毒。在一侧选择十个点，没点间隔2cm，5个点注射生理盐水浸提液，另5个点注射空白对照液。同法在另一侧选择十个点，5个点注射植物油浸提液，另5个点注射植物油空白对照液。各点注射剂量为0.2ml。

4．结果观察和记分：

4．1在注射后立刻、24、48、72h观察每隔注射部位及周围组织反应，包括充血、肿胀、坏死等。

4．2皮内刺激反应记分标准：

六、结果评价标准：

1．每只动物对材料的原发刺激指数（PⅡ）：

各时间段反应总分

PⅡ＝————————————

观察总数

2．平均原发刺激指数（A PⅡ）：

所有动物的PⅡ

A PⅡ=————————————

实验动物总数

3．根据计算结果，0.0～0.4分为无刺激，0.5～1.9分为轻度刺激。2.0～4。9分为中度刺激，5.0～8.0分为强刺激。

附一：脱毛剂配方

1．硫酸钠8g溶于100ml水中。

2．硫酸钠3份，肥皂粉1份，淀粉7份，加水调成糊状。

3．硫酸钠1g，生石灰15g，加水100ml。

（配方1、2适用于家兔和齿类动物脱毛，配方3适用狗脱毛）

附二：脱毛方法

用脱毛剂前，要剪去他们部位的被毛，以节省脱毛剂。切不可用温水浸润被毛，否则脱毛剂会顺被毛流入皮内毛根深处，损伤皮肤。动物应放在凹型槽等容器内，以免脱毛剂及洗毛水四处流淌。用镊子夹棉球或纱布团蘸脱毛剂涂抹在已剪去被毛的部位，等3～5min 后，用温水洗去脱下的毛和脱毛剂。操作时动作应轻，以免脱毛剂沾在实验操作人员的皮肤粘膜上，造成不必要的损伤。

附三：皮内注射方法：

固定动物的方法和注射部位与皮下注射相同。即操作者用左手将动物轻轻压在实验台面上，将其颈背或侧腹部皮肤提起，用皮试针头穿刺，针头进入皮肤浅层，不能左右摆动时，即表明针头在皮内。回抽无回流后，仔细将药物注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘。拔针时左手拇、示指捏住进针部位数分钟，以防止药物外漏。

实验四溶血试验（Hemolysis Test）

一、实验目的：

了解溶血的基本概念和溶血试验的基本原理，掌握检测试样材料对血液红细胞的溶血作用及方法。

二、试验原理：

溶血是指血液中的红细胞遇到相应的抗体（例如溶血素）而特异结合耳形成抗原复合

物，该复合物可使得红细胞溶解，这种现象就叫做溶血。

对于生物材料，特别是与血液接触的生物材料，在体内是一种异体物质，当与血液接触时是否会使红细胞造成损伤，使红细胞溶解，即是否有溶血作用，溶解程度如何？通过本实验对被检测的生物材料或其浸提液进行体外试验，以此来对该生物材料的体外溶血性进行评价。

三、实验器材和药品：

硅橡胶，聚氯乙烯，NaCl溶液（0.9％），草酸钾（2％），兔血，离心机，水浴箱，分光光度计，小试管，吸管，比色皿

四、实验步骤：

1．制备新鲜抗血凝兔血：

由新采的兔血20ml加2％草酸钾1ml制成新鲜抗血凝兔血。

2．稀释新鲜抗血凝兔血：

取新鲜抗血凝兔血8ml，加0.9％NaCl溶液10ml稀释。

3．称取试样，每份5g，共三份。

4．将试样裁成50mm×30mm小条，先用自来水冲洗，再用适量蒸馏水摇洗2次，每次约1min，沥干，置于试管内，加入0.9％NaCl溶液10ml，置于37水浴箱保温30min。再加入稀释兔血0.2ml，轻轻混匀，再在370C水浴箱中继续保温60min。

5．取出试管，用离心机离心5min（750g，2500r/min）.

6．阳性对照用10ml蒸馏水加稀释兔血0.2ml，阴性对照用10ml 0.9％NaCl溶液加稀释兔血0.2ml，保温条件与上述试管相同。

7．分别吸取上清液移入比色皿中，用分光光度计在545nm波长处测定吸收度。

8．如阴性对照管的吸收度大于0.03，此次试验应放弃。阳性对照管的吸收度值为0.8±0.3。

五、结果计算：

试样的溶血程度用％表示，其计算公式如下：

D t－D nc

—————×100％

D pc－D nc

D t―――试样吸收度

D nc―――阴性对照吸收度

D pc―――阳性对照吸收度

七、结果评价标准：

1．各试管和对照管的吸收度应取三管的平均值。

2．材料的溶血率≤5％，则表明材料符合生物材料溶血试验要求，若溶血率>5％，则预示该材料有溶血作用。

附：一、兔耳缘静脉穿刺采血法

操作同兔耳缘静脉给药法相同。穿刺前壳用二甲苯或乙醇使耳部血管充分扩张，穿刺成功后即可抽血。针头可不连接注射器，直接让血液滴在有抗凝剂的容器内。

二、兔耳中央动脉采血法

经兔耳中央的一条较粗、颜色鲜红的动脉采血，每次可采到约15ml血，操作方法基本与静脉采血法相同。有动脉末端，顺向心方向进针，穿刺成功可见动脉血进入针管。取血完毕后注意止血。虽然穿刺前兔耳血管已充分扩张，但在穿刺过程中动脉常发生较长时间的痉挛性收缩，这时可稍等一下，待动脉重新舒张后再抽吸。进针部位从中央动脉末端开始，不要在近耳边根取血，因耳根部软组织厚，血管略深，易穿透血管导致皮下出血。

实验五凝血试验 (blood test)

一、实验目的：

通过测定涂于试管内壁的试验材料与血液接触，以判断该材料对全血凝固时间的影响。

二、实验原理：

血液凝固过程是一种发生在血浆中由许多凝血因子参加的生化酶促反应，结果是使血液由液体状态变成胶冻状态。血液凝固可分为内源性凝血和外源性凝血。内源性凝血是指参加凝血过程的凝血因子全部存在于血浆中，即血管内凝血；外源性凝血是指在组织因子参与下的血凝过程。本实验采用兔颈总动脉放血的方法取血，血液几乎未与组织因子接触，因此，凝血过程主要由内源性凝血系统所发动的。

三、试验血源：新采取的兔血

四、实验器材和药品：

注射器，试管，小烧杯，水浴箱，10％氨基甲酸乙酯溶液，肝素，

五、实验步骤：

1．试材制备：

1．1将肝素涂于10mm×10mm玻璃试管内壁，涂好后经环氧乙烷消毒。

1．2将玻璃试管和涂有硅油的玻璃试管作为对照管。

2．采取新鲜兔血：

用氨基甲酸乙酯溶液（1g/kg）将兔麻醉，仰卧位固定于手术台上。然后分离一侧颈总动脉，上端用线结扎阻断血流，下端夹上动脉夹，在动脉正中剪一小口，插入细塑料管，结扎插管备用取血用。

3．用注射器抽取兔血3ml，立即启动秒表记时。

4．弃去针头，沿试管壁注入血液1ml，共三管，并置于37℃水浴箱内。

5．取血4min后，每隔30s将试管倾斜（约30）一次，依次观察1，2，3管，直至第3管血液成为凝胶状（倾斜至90）不再流动为止，记下所经时间即为凝血时间。

六、结果评价标准：

凝血时间延长12－15min，表示试材与玻璃相比有显著性差异。

实验六动态凝血试验 (dynamic blood test)

一、实验目的：

使涂于玻璃表面的试样与血液接触，测定游离血红蛋白的光密度值，动态的观察试样对凝血时间的影响。

二、实验原理：同实验五。

三、实验血源：

新鲜ACDL血（1：4）

四、实验器材和药品：

医用聚醚聚氨酯，聚氯乙烯，0.2mol/l氯化钙溶液，10％甲基硅油，微量进样器，移液管，秒表，分光光度计。100ml烧杯，100ml量杯，玻璃表面皿（直径>2cm），

五、实验步骤：

1.试样制备：

1.1 分别将医用聚醚聚氨酯，硅橡胶，聚氯乙烯试样均匀、光滑地涂于玻璃表面皿凹面中心，涂后封存，避免灰尘与其相互间的摩擦。

1.2 用10％甲基硅油制成涂硅玻璃表面皿，空白玻璃表面皿作参比对照。

2.每组表面皿，按设计的时间间隔顺序编号，按需要增减，一般8～10个。

3.用2ml刻度吸管于每个表面皿加入0.2mlACDL血。

4.依次于每份血内加0.2mol/L的氯化钙溶液25ul，玻棒混匀，同时开动秒表。

5.按预定时间对每一顺序编号的表面皿分别用100ml蒸馏水流注于血液表面，收集流注液。

6.用分光光度计在540nm波长测定每份流注液所剩余游离血红蛋白光密度值。

7. 将测得数值绘制动态凝血时间曲线。

六、结果评定标准：

1.试验组与对照组均规定OD< 0.1为初凝时间，OD< 0.01为全凝血时间。

2试样与对照组的吸光度均取3管流注液的平均值。

3. 将试验结果绘制成表和曲线图。曲线呈缓慢向下倾斜且经历时间长，表示抗凝血性能优，曲线呈急陡向下倾斜且经历时间短，表示抗凝血性能劣。

暨南大学本科实验报告专用纸

课程名称生物材料评价学成绩评定

实验项目名称指导教师

实验项目编号实验项目类型实验地点

学生姓名学号2007055094

学院生命科学技术学院系生物医学工程专业生物医学工程实验时间2010 年11月30日下午～月日午温度℃湿度