多肽固相合成研究进展_ (1)

·研究报告·

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2012年第1期

收稿日期: 2011-06-16基金项目: 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目[黔科教（2009）0132号],贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目[黔省专合字

（2009）104号] ,农业科技成果转化资金项目（2009GB2F200330）,科技人员服务企业行动项目（2009GJF20047),贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY 字［2011］3052号）

作者简介:陈卓,男,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学; E -mail: gychenzhuo@https://www.360docs.net/doc/b015805304.html,

NPR1多肽抗体的制备和应用

陈卓刘家驹毕亮李向阳胡德禹于丹丹王贞超杨松宋宝安

（贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 贵阳 550025; 贵州大学绿色农药与农业生物

工程教育部重点实验室, 贵阳 550025）

摘要：根据NCBI GenBank 中报道的NPR1一级结构信息，采用Blastn 、Blastx 、ExPASy 和Protean 等软件进行序列同源性和抗原性指数分析，获得三段序列特异性较高的多肽，并从中优选一段序列特异性多肽，采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽，采用HPLC 和LC -MS 测定合成多肽的浓度和分子量，试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD 。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH 进行偶联获得免疫原Pep -KLH ，并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体，采用ELISA 和Western blotting 测定其效价和特异性，经ELISA 检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep 发生特异性免疫反应，经Western blotting 试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带，其相对分子量为65 kD ，与预测分子量相符，表明利

用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。

关键词：非表达型病程相关蛋白序列分析多肽合成多克隆抗体

Preparation and Application of Polyclonal Antibody

with a Peptide of NPR1

Chen Zhuo Liu Jiaju Bi Liang Li Xiangyang Hu Deyu Yu Dandan Wang Zhenchao Yang Song Song Baoan

（State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering , Guiyang 550025; Key Laboratory of Green Pesticide

and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025）

Abstract: According to the primary structure of information about NPR1 in NCBI GenBank, 3 polypeptides with sequence -specific were obtained using Blastn and Blastx software. One polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods, and determined theirs purity and molecular weight using HPLC and LC -MS with purity value reaching at 88% and molecular weight being at 1.92234 kD. The polypeptide was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH） to form a complex of Pep -KLH by EDC. Anti -sera were acquired by immunizing rabbit with Pep -KLH emulsified by complete freund’s adjuvant （CFA） and incomplete freund’s adjuvant （IFA）, and polyclonal antibody was purified by affinity chromatography. The titer and specificity of anti -sera and polyclonal antibody were determined by ELISA and Western blotting. The results showed that anti -sera and polyclonal antibody reacted with Pep -KLH and detected a specific band of 65 kD, and the size was agreed with the predicted molecular mass. The NPR1 polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity.

Key words: Nonexpressor of pathogenesis -related genes 1 （NPR1） Sequence analysis Polypeptide synthesizing Polyclonal antibody

系统性获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）在植物体内具有持效长、作用谱广的抗病特性，在植物体内，它常被外来入侵的病原生物所激发［1,2］。植物SAR 常被植物体内的内源性激素——

水杨酸（salicylic acid, SA）所调控［3-6］，同时引起病程相关蛋白的表达上调并发挥广泛的抗真菌、抗细菌和抗病毒的活性［7-9］。NPR1（nonexpressor of pathogenesis -related genes 1），又称为NIM1或SAI1，

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是最早从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到的、能调控植物病害抗性的关键基因，它不仅对植物系统获得抗性和诱导系统抗性（induced systemic resistance, ISR）起核心调控作用，而且是植物基础抗性（basic resistance）以及由抗病基因（resistance gene, R）决定的抗性的重要调控因子，它位于SA信号转导通路中，并对SAR的活性起着重要的调控作用［10-12］。同时，研究发现NPR1广泛分布于各种植物中，如水稻、玉米等［13-16］。因此，关于NPR1的研究对于植物生理、植物病理和农药创制的新靶标研究中均具有重要的意义。本研究拟采用抗体制备及基于抗体检测的策略，利用生物信息学方法研究NPR1的多肽一级结构的序列特异性，人工合成方法获得目的多肽，并通过偶联获得Pep-KLH，将其作为免疫原，由此制备NPR1的多肽抗体，并进行抗原鉴定、抗体纯化以及应用于标本的检测。

1 材料与方法

1. 1 材料

新西兰雄性大白兔（2.5 kg），购自吉林省生物制品所。完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant, CFA）和不完全弗氏佐剂（Incomplete Freund’s adjuvant, IFA）购自北京鼎国生物公司。HRP-标记羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruz 公司。ECL化学发光试剂盒（ECL plus）购自碧云天公司。酶联免疫测定仪为Bio-Rad公司产品（Model 680），电泳仪（DYY-12C）、电泳槽（DYY-24DN）及转移槽（DYCZ-40D）为北京六一公司产品。

1. 2 方法

1.2.1 生物信息学分析登录进入http://www.ncbi. https://www.360docs.net/doc/b015805304.html,，采用Blastn和Blastx程序，进行序列同源性检索和保守性分析［17］，采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序［18］、SWISS PROT蛋白数据库［19］和DNA star（Protean）［20］生物信息学软件对HrBP 的二级结构、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基酸的带电性等理化性质进行分析。

1.2.2 NPR1多肽的设计与合成根据生物信息学分析和预测，按抗原性、亲疏水性和同源性分析，设计含15-18个氨基酸的目的多肽，采用9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽，合成得到的多肽裂解后得到粗肽，粗肽经高效液相法（high performance liquid chromatography, HPLC）进行纯化，纯化后的样品再采用HPLC进行纯度分析。HPLC色谱柱为4.6 mm×250 mm（VYDAC-C18柱），溶剂A 和B分别为含0.1%三氟醋酸的无水乙腈溶液和0.1%三氟醋酸的水溶液。肽链与KLH进行化学连接形成分子量较大的抗原分子，经纯化后获得纯品多肽抗原即Pep-KLH。采用碳化二亚胺法（EDCI）将纯化多肽与钥孔戚血蓝素（KLH）用进行缩合反应，得到Pep-KLH复合物。

1.2.3 NPR1抗体的制备根据抗体生成规律，取250 μL（约250 μg）纯化的多肽抗原液，并与等体积的CFA混合，待充分乳化后，采用背部多点注射法免疫新西兰大白兔。两周后取多肽抗原液加等体积IFA，采用上述方法进行加强免疫，免疫抗原量约200 μg，以后每两周免疫一次，每次免疫抗原量约100 μg，全程共免疫5次，在末次免疫5-7 d后，通过家兔耳缘静脉取血进行效价检测，待效价达理想值后，采用颈动脉放血，收集家兔血清［21］。采用饱和硫酸铵沉淀法初步纯化兔血清，采用HPLC进行多肽纯度分析［21］。收集兔抗血清，并经过离心和微滤后，采用HiTrap Protein A亲和层析柱进行纯化。将5.0 mL的HiTrap Protein A亲和层析预装柱，与AKTA explorer系统相连接，用0.1 mol/L Tris-HCl buffer含（0.15 mol/L NaCl，pH7.5）充分洗涤平衡后上样，以相同buffer洗去未结合的杂蛋白质后，用0.1 mol/L Gly-HCl buffer（含0.15 mol/L NaCl，pH2.8）洗脱，收集洗脱峰，并用pH7.5的buffer中和后，冻干备用，采用SDS-PAGE分析多抗的纯度［22］。1.2.4 ELISA检测抗血清和多克隆抗体效价将人工合成裸肽作为抗原，包被浓度设为2 μg/mL，包被量为100 μL/孔，4℃包被过夜；封闭体系含有2% BSA的PBST buffer，200 μL/孔，37℃封闭1-2 h；采用含2% BSA PBST buffer稀释抗血清，抗血清稀释比分别为1 1 k、18 k、116 k、132 k，以1200稀释的正常兔血清作为阴性对照，37℃孵育1-2 h；二抗采用HRP-标记羊抗兔二抗，工作浓度为110 000，100 μL/孔；37℃孵育1-2 h；以上每步结束后都是用PBST洗3-5遍；最终采用TMB显色系统进行显色，酶标仪读取450 nm波长处的OD值，

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陈卓等：NPR1多肽抗体的制备和应用

当效价达18 000后，采兔血清，并纯化抗血清获得多克隆抗体。

1.2.5 Western blotting 分析抗血清和多克隆抗体特异性采用打孔器采用烟草叶片样品，并称重后经液氮固定后，保存于-80℃冰箱。烟草样品经液氮研磨成粉后，按质量体积比110加入碳酸盐包被 buffer，研磨匀浆后转移至EPP 管中，4℃条件下，采用12 000×g 条件下，离心15 min，获得蛋白上清液。采用Bio -Rad 蛋白定量试剂对上清液进行定量和稀释，-80℃保存备用。采用12% SDS -PAGE 电泳分离烟草蛋白上清液，采用0.22 μm 的PVDF 进行转移，转移条件为90 mA 恒流，转移时间为1.5 h。封闭液采用含5%脱脂牛奶-TBST buffer，室温条件下，采用0.1% Tween -20 TBST buffer 洗涤3次，每次3-5 min。样本A 和样本B 的抗血清稀释比为1650，多克隆

抗体的工作浓度为5 μg/mL。HRP -标记羊抗兔二抗采用1 3 000稀释比，室温孵育4 h，ECL plus 试剂常规感光胶片显影至条带显示完全终止反应。

2 结果

2.1 采用生物信息学预测多肽序列

NPR1在GenBank 中的登录号为AF480488.1和

LOCUS AF480488。https://www.360docs.net/doc/b015805304.html,/uniprot/Q8LL13，https://www.360docs.net/doc/b015805304.html,/cgi -bin/expasyfetch? AF480488。通过Blastn 和Blastx 程序发现HrBP 中3段多肽序列在烟草及其它物种中都具有良好的序列特异性，其多肽序列为（1）C - NSRTAFSDSNDIS GSSSIC；（2）C - YSGKVRPSPKDVC；（3）C - CSSTSKG VDKPNKLPFRK。对NPR1进行抗原表位预测分析，结果如图1

所示。

1. 柔性区域;

2. 抗原性指数;

3. 亲水性区域;

4. 表面概率结构

图1 NPR1抗原性的生物信息学分析

2.2 抗原多肽的合成、纯化及鉴定

采用HPLC 试验结果（图2，表1）发现共有5

图 2 高效液相色谱测定NPR1

纯度

编号时间（min）样品浓度峰面积（相对值）峰高度（相对值） 17.9430.5565262623251213.2040.2511118521159313.395 1.31618238539413.6188841527963315225

14.206

9.88346637335266合计 100

4719106

379737

表1 高效液相色谱测定NPR1的纯度

个成分峰，其中一个主要成分峰的含量为88%，其它4个成分峰的总浓度为12%；同时，采用

质谱方法对主要成分多肽进行分子量鉴定，试验

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发现其分子量为1.92234 kD，与预测分子量吻合度较好，提示获得的目的多肽可达到抗体制备试验的要求，可以用作目的免疫原，用以制备抗体。

试验发现的5个成分峰，其保留时间分别是7.943,13.204, 13.395, 13.618, 14.206 min，它们对应的浓度分别为0.5565%、0.2511%、1.31%、88%及9.883%。

2.3 抗血清或多克隆抗体效价

采用间接ELISA方法，对两个样本的抗血清进行免疫检测，试验发现在132 k的条件下，样本A 和B的两个重复抗血清的OD值为分别为1.804和1.173（图3）。对样本B的抗血清进一步进行纯化，获得的多克隆抗体（样本C），并进行效价检测，试验发现在稀释比在1128 k条件下，其OD值为1.047（图4）。

图 3 样本A和样本B的NPR1

的抗血清效价测定图4 NPR1的多克隆抗体（样本C）效价测定2.4 抗血清和多克隆抗体的特异性

试验以健康烟草和经TMV处理的烟草叶片蛋白提取液为样本，进行抗血清的特异性检测（图5），在分子量为72 kD和55 kD之间有一条带，经GenBank检索表明NPR1的分子量大小为60 kD，正好处于两个分子量条带之间，表明该蛋白为目的蛋白。同时，试验发现样本A抗血清的特异性比样本B的特异性好。

此外，对样本A的抗血清进行多克隆抗体的纯化（样本C）以及抗体对上述烟草样本的特异性检测（图6），试验发现多克隆抗体特异性好，不存在非特异性产物，同时发现NPR1在CK、1D、3D和5D各处理组的表达趋势呈先增加，后逐渐降低的趋势。

CK、1 D、3 D和5 D分别代表普通烟叶片被TMV侵染0 d、

1 d、3 d和5 d的时间

图5 Western blotting检测NPR1

分子特异性

3 讨论

自1994年Cao等［10-12,23］发现NPR1对于诱导PR表达、激活植物SA信号通路、提高SAR活性，有着重要的作用。同时，研究发现各种植物体内的CK、1 D、3 D和5 D分别代表普通烟叶片被TMV侵染0 d、

1 d、3 d和5 d的时间

图6 Western blotting检测NPR1

分子特异性

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陈卓等：NPR1多肽抗体的制备和应用

肽段，为制备高选择性的抗体奠定了基础。

试验采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得了多肽，并采用碳化二亚胺法制备Pep -KLH 的复合物，并由此进行兔的免疫，获得了多克隆抗体。

试验采用间接ELISA 和Western blotting 方法对NPR1多克隆抗体的效价和特异性进行评价，结果表明通过该方法制备的抗体的效价高、特异性强。

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NPR1 对于植物产生SAR、发挥广泛的抗病活性具有重要的作用。因此，关于NPR 的研究备受大家的关注，国外科学家针对NPR1在激活SA 信号通路中的作用，相继发现具有激活NPR1的小分子化合物，如BA、BTH 和INA ［24-27］。同时，Nakashita 等发现Chloroisonicotinamide 衍生物还能广泛作用于双子叶植物烟草和单子叶植物水稻的SA 信号转导通路，并引起NPR1分子的高表达。因此，关于NPR1分子在植物生理、病理和农业应用中具有重要的研究价值。然而，关于NPR1及其所在SA 信号通路的研究，前人一直是采用综合的方法进行研究，如采用HPLC 测定SA 含量、采用SDS -PAGE 分析植物叶片中胞间蛋白、采用Western blotting 技术研究PR 蛋白的表达、采用POD、PAL 和SOD 等防御酶方法研究酶活性的变化，但目前，一直未见有NPR1的抗体及相关检测方法的报道。因此，我们通过NCBI GenBank 中报道NPR1序列信息，并根据多肽亲水性、肽链可塑性、二级结构和抗原性指数，获得三段序列特异性较高的多肽序列，并进行人工合成，同时，通过HPLC 方法测定人工合成多肽表明其纯度达88%，并且通过质谱鉴定分子量与预计分子量吻合，其分子量为1.99234 kD。在此基础上，将其与KLH 连接，并免疫新西兰大白兔，得到针对NPR1的多肽抗体。采用ELISA 和Western blot 技术验证了该抗体的特异性和敏感性。ELISA 结果显示所制备兔抗NPR1多肽抗体可特异性识别多肽，并呈现较高滴度。同时，采用健康普通烟、TMV 浸染1 d、3 d 和5 d 四样本，研究NPR1在4个处理组中的表达变化，试验发现烟草经TMV 处理后，具有诱导高表达的趋势，这与前人研究结果一致。

综上所述，本研究制备的NPR1多克隆抗体具有与其抗原特异性结合的特征，并成功应用于ELISA 和免疫印迹试验，这为进一步深入研究此分子的病理、生理学功能及其调控提供了重要参考。

4 结论

根据生物信息学方法对普通烟（Nicotiana taba -cum ）的NPR1的同源性较低的区域以及新的结构域进行了分析，同时还进一步分析了这些区域的亲水性、抗原性指数等，从而获得了序列特异性较高的

生物技术通报Biotechnology Bulletin2012年第1期150

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（责任编辑李楠）

关于多肽合成

关于多肽合成 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc 法合成，如图：具体合成由下列几个循环组成：

多肽合成技术

精心整理多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，FredSanger 发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。多肽化学合成的基本介绍多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。

多肽合成方法

多肽合成中肽键形成的基本原理一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚：第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在；第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。

多肽固相合成

发明英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS 在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。固相合成法的诞生多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。

合成多肽药物药学研究技术指导原则

附件三合成多肽药物药学研究技术指导原则

合成多肽药物药学研究技术指导原则一、前言多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究的内容与深度还要取决于品种本身的特性。本指导原则适用于采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。

二、合成多肽药物药学研究的基本考虑合成多肽药物药学研究的主要内容、研究思路、研究方法及一般性的技术要求与其他类型的化学药物基本一致。但是，由于多肽药物的特点，在进行药学研究时还应注意考虑以下问题。 1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑多肽的化学合成是有机合成的一个非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成两种方法。液相合成是经典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段缩合方法。逐步合成法通常从链的C'末端氨基酸开始，向不断增加的氨基酸组分中反复添加单个α-氨基保护的氨基酸。片段缩合一般先将目标序列合理分割为片段，再逐步合成各个片段，最后按序列要求将各个片段进行缩合。液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等。固相合成是将目标肽的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸（氨基保护）的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基脱保护后与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程,直至目标肽形成为止。其优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。液相合成和固相合成各有优缺点，应根据合成的实际需要选择适合的工艺。一般而言，液相合成法较适于合成短肽；固相合成法

多肽合成方法

实施例1 本发明多肽的合成 1)实验仪器与材料: 二甲基甲酰胺（DMF），哌啶，树脂，二氯甲烷（DCM），茚三酮反应试剂（茚三酮，维C，苯酚），四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），六氢吡啶（哌啶），三异丙基硅烷TIS,乙二硫醇（EDT），无水乙醚，三氟乙酸（TFA），N-甲基吗啉（NMM），甲醇，各种氨基酸,Fmoc-e-Acp-OH,FITC，多肽固相合成管。 2）溶液配制脱保护溶剂——六氢吡啶：DMF=1：4 反应液——NMM:DMF=1：24 裂解液——TFA(92.5%)TIS(2.5%)EDT(2.5%) 茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴荧光偶联溶剂——吡啶：DMF：DCM=12:7:5 2)实验步骤: 称量树脂并投入到多肽固相合成管（以下简称反应器）中，加入适量的DMF 溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，10min于摇床。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂（约5~10mg）于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQ.1- SEQ.N肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU （氨基酸：HBTU=1:1），用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到序列号为SEQ ID NO.1 –N+1的肽。反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液（裂解液先冰浴20min）中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚（冰浴）洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90%。所得到的纯肽使用质谱(MS, electrospray)鉴定。至最后一个肽合成后，取出部分加荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基

多肽合成方法

1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步

多肽合成

多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel 化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。多肽化学合成的基本介绍多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因

多肽合成的研究及应用现状

多肽合成的研究及应用现状多肽合成的研究及应用现状多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。到现在，人们已在人体中发现和分离出一百多种肽类，关于多肽的研究与应用，也取得了巨大的进步，引发了空前的研究热潮。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值，多肽研究成为了医学和分子生物学研究的重点对象，世界各先进国家无不拨出巨款来建立各种规模的多肽研究中心，以期在这一重要领域中取得突破性进展。现在具有生物活性的多肽已经广泛地应用在临床检测、医学研究、疾病防治和治疗等三大方面。 1，多肽合成的研究历史多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成（SPOS），为此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 2，多肽合成的原理与步骤多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。 2.1多肽合成基本原理：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。 2.2固相多肽合成的步骤： A，树脂的选择及氨基酸的固定

合成多肽药物药学研究技术指导原则

指导原则编号：【H 】G P H 11 - 1 合成多肽药物药学研究技术指导原则二00七年九月

目录一、前言二、合成多肽药物药学研究的基本考虑三、合成多肽药物药学研究的主要内容（一）制备工艺研究（二）结构确证研究（三）制剂处方工艺研究（四）质量研究与质量标准（五）稳定性研究四、名词解释五、参考文献六、著者

多肽合成详细解说

多肽合成详细解说 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc 和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，如图：

多肽固相合成的研究进展

科学与财富多肽固相合成的研究进展刘立伟（华北理工大学迁安学院河北唐山064400）摘要：多肽是一类非常重要的生物活性物质，在治疗某些疾病方面具有独特的疗效，因此其化学合成有着非常重要的意义。文章介绍了多肽固相合成的原理、方法、固相载体的选择、连接分子的种类及肽键的形成等，揭示了固相合成多肽存在的问题并展望了其研究前景。关键词：多肽固相合成 1多肽的概述多肽是普遍存在于生物体内由氨基酸组成的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。在生物体内发现的多肽已达数万种，由于其具有广泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到药物研发工作者的重视。尤其在20世纪90年代以后，随着多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域。合成多肽的方法主要是指化学合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法，无论是液相法还是固相法都已经很成熟。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成两种途径，它在多肽的工业化生产方面有非常重要的应用。与经典的液相合成多肽方法相比，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。 2多肽的固相合成 1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis)，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield被授予了诺贝尔化学奖。 2.1固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复(缩合?洗涤?去保护?中和及洗涤?下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc（9-甲氧羟基合成）保护的称为Fmoc固相合成法。 2.2合成方法 2.2.1Boc合成法采用三氟乙酸(TFA)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。 2.2.2Fmoc合成法 1978年，Meienlofer和Atherton等人发展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中，采用了可被碱脱除的Fmoc作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc 保护方法。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳的Boc进行保护等。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc法与Boc法相比，由于Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。 2.3固相合成的聚合物载体的选择将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件:①必须包含合适的连接分子(或反应基团)，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。②必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。③必须提供足够的连接点，以满足肽链不断增长的需要。目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类:聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型:氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。 2.4连接分子一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择。固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。 2.5肽键的形成固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中选用DCC、HOBT 或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广。 2.6多肽的切割，沉淀与纯化按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc法中，主要用TFA＋HF裂解和脱侧链保护。在Fmoc法中直接用TFA进行切割。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。目前应用最多的是高效液相色谱法， 3展望固相多肽合成已经有50年的历史了，但是，目前人们还只能合成一些相对较短的肽链，而对于相对分子质量较大、肽链较长的蛋白质类物质，固相合成技术还有很大的局限性。同时在合成中要用到大量的有毒试剂，合成费用昂贵，并伴随副反应、消旋化等问题，这些都是不可忽视的问题。而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题。同时，寻找更加绿色、环保的多肽合成技术，对科学家来说也是一个重大的挑战。参考文献： [1]韩香，顾军.多肽的固相合成。天津药学，2002,14（7）：9. [2]李正超，韩香.多肽合成方法研究进展。武警后勤学院学报.2012，22（2）：153-158. 界,2015,11:191-192. [3]曹华英.浅谈电力市场营销在市场经济条件下的发展创新[J].广东科技,2012,03:97-98. [4]刘淑萍.浅析市场经济下电力市场营销的创新发展[J].科技创新与应用,2012,29:265. [5]孙皓.浅议电力企业市场营销的创新发展[J].科技风,2012,20:269. （上接109页）科学发展 110

多肽合成基础知识大全

----------------------------------------------------------------------------------------- 多肽合成基础知识汇编编制: 合成部 ----------------------------------------------------------------------------------------- 一、多肽合成概论 1．多肽化学合成概述： 1963年，［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有

多肽固相合成研究进展_ (1)

·研究报告· 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期收稿日期: 2011-06-16基金项目: 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目[黔科教（2009）0132号],贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目[黔省专合字（2009）104号] ,农业科技成果转化资金项目（2009GB2F200330）,科技人员服务企业行动项目（2009GJF20047),贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY 字［2011］3052号）作者简介:陈卓,男,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学; E -mail: gychenzhuo@https://www.360docs.net/doc/b015805304.html, NPR1多肽抗体的制备和应用陈卓刘家驹毕亮李向阳胡德禹于丹丹王贞超杨松宋宝安（贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 贵阳 550025; 贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室, 贵阳 550025）摘要：根据NCBI GenBank 中报道的NPR1一级结构信息，采用Blastn 、Blastx 、ExPASy 和Protean 等软件进行序列同源性和抗原性指数分析，获得三段序列特异性较高的多肽，并从中优选一段序列特异性多肽，采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽，采用HPLC 和LC -MS 测定合成多肽的浓度和分子量，试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD 。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH 进行偶联获得免疫原Pep -KLH ，并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体，采用ELISA 和Western blotting 测定其效价和特异性，经ELISA 检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep 发生特异性免疫反应，经Western blotting 试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带，其相对分子量为65 kD ，与预测分子量相符，表明利用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。关键词：非表达型病程相关蛋白序列分析多肽合成多克隆抗体 Preparation and Application of Polyclonal Antibody with a Peptide of NPR1 Chen Zhuo Liu Jiaju Bi Liang Li Xiangyang Hu Deyu Yu Dandan Wang Zhenchao Yang Song Song Baoan （State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering , Guiyang 550025; Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025） Abstract: According to the primary structure of information about NPR1 in NCBI GenBank, 3 polypeptides with sequence -specific were obtained using Blastn and Blastx software. One polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods, and determined theirs purity and molecular weight using HPLC and LC -MS with purity value reaching at 88% and molecular weight being at 1.92234 kD. The polypeptide was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH） to form a complex of Pep -KLH by EDC. Anti -sera were acquired by immunizing rabbit with Pep -KLH emulsified by complete freund’s adjuvant （CFA） and incomplete freund’s adjuvant （IFA）, and polyclonal antibody was purified by affinity chromatography. The titer and specificity of anti -sera and polyclonal antibody were determined by ELISA and Western blotting. The results showed that anti -sera and polyclonal antibody reacted with Pep -KLH and detected a specific band of 65 kD, and the size was agreed with the predicted molecular mass. The NPR1 polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity. Key words: Nonexpressor of pathogenesis -related genes 1 （NPR1） Sequence analysis Polypeptide synthesizing Polyclonal antibody 系统性获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）在植物体内具有持效长、作用谱广的抗病特性，在植物体内，它常被外来入侵的病原生物所激发［1,2］。植物SAR 常被植物体内的内源性激素—— 水杨酸（salicylic acid, SA）所调控［3-6］，同时引起病程相关蛋白的表达上调并发挥广泛的抗真菌、抗细菌和抗病毒的活性［7-9］。NPR1（nonexpressor of pathogenesis -related genes 1），又称为NIM1或SAI1，