苹果皮、葡萄皮、沙果皮表面酵母菌分离纯化
苹果皮、葡萄皮、沙果皮表面酵母菌分离纯化
王建福
（沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110161）
摘要本文通过对酵母菌的细胞形态、结构、繁殖方式、孢子的形成、菌落的大小形态、质地、颜色、气味的观察，对从苹果皮，葡萄皮，沙果皮上分离得到的酵母菌进行分类鉴定。结果显示，有酿酒酵母、克勒克酵母属酵母菌、红酵母属酵母菌。
关键词：苹果皮；葡萄皮；沙果皮；酵母菌；分离；鉴定
Isolation and o purification of yeasts from the surface of apple skin ，grape skin
and Chinese pear-leaved crabapple skin
wangjianfu
(Shenyang Agricultural University Land and Environment Institute，Liaoning Shenyang 110161)
Abstract :This paper focused on isolation and identification of yeasts from apple skin ，grape skin and Chinese pear-leaved crabapple skin。The following assays was done ,including observation of size ,structure ,characteristic of stain, types of asexual reproduction on sexual reproduction and ascus,colony,size ,quality, colour, transparency and smell of colony. to identify the yeasts from apple skin ，grape skin and Chinese pear-leaved crabapple skin。The results showed that the yeasts stains were proved to be Saccharomyces cerevisiae , Kloeck-era spp and Rhodotorula .
Keywords: Apple skin ; Grape skin; Chinese pear-leaved crabapple skin；Yeast ; Isolation ; Purification
目录
1 前言 (2)
2 酵母菌的简单介绍【8】 (3)
2.1特征 (3)
2.2生殖 (4)
2.3酵母菌的生长条件 (5)
3 材料与方法【9】【10】 (6)
3.1材料 (6)
3.2方法 (6)
3.2.1 分离 (6)
3.2.1.1 原理 (6)
3.2.1.2 培养基 (7)
3.2.1.3 制作培养基的过程【11】【12】 (7)
3.2.1.4 灭菌【12】 (8)
3.2.1.5 步骤 (10)
3.2.1.6 划线法【１３】 (11)
3.2.2 鉴定 (13)
3.2.2.1 鉴定依据与原则 (13)
3.2.2.2 鉴定步骤【14】【1５】 (13)
4 结果与分析 (16)
4.1分离 (16)
4.2鉴定 (16)
5讨论 (17)
6参考文献 (18)
1 前言
酵母，是一种单细胞真核微生物，也是人类实践活动中应用较早的一类微生物。酵母菌在自然界中的分布很广，主要是生长在偏酸性的高糖环境中，在水果，蔬菜的表面和果园的土壤中较为常见。酵母菌【1】的种类很多，也与人类的关系密切。千百年来,酵母菌及其发酵产品大大的改善和丰富了人类的生活，如酿酒,面包的制作，甘油的发酵,石油的脱蜡,单细胞蛋白的生产，从酵母菌中提取核酸，麦角甾醇，细胞色素C和一些生化药物，以及近年来将酵母菌作为遗传工程中具有良好发展前途的受体菌等【2】。特别是SCP的生产上,酵母菌具备无毒,易消化吸收，必需氨基酸的含量丰富,核酸含量较低，口味好，制造容易和价格低廉的优势。此外，还可以利用无机氮源或尿素来合成蛋白质，因此，自然成了目前最重要的单细胞蛋白的来源【2】【3】。
酵母菌在发酵工业中的应用最为广泛，但随着发酵理论的建立和生产发展，给古老的发酵工业注入了新的活力，也带来了挑战，在使得发酵工业从传统的经验式生产走向新的、主动控制的工业化生产同时，提出了新的要求。起初，优良的酵母菌株是靠分离筛选的方法得到的，但是单靠分离筛选到的酵母菌株并非一切特性都符合理想要求，适合所有的场合使用，因此，酵母菌种的改良工作显的尤为重要【4】。
自然界的菌种资源虽然十分丰富,但是要设法从其中筛选到较为理想的菌种并非易事. 由于酵母菌有一系列非常独特的生物学特性，因其在研究现代遗传学和其它许多重要的生物学基本理论问题中有重要意义【２０】，所以随着对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代生物学和生物工程学的发展，而且为酵母菌的选育工作提供了丰富的理论基础，使选育工作向着从低效到高效，从随机到定向，从近缘到远缘杂交的方向发展。定向培育是微生物工作者向长期以来的一种理想，当前发酵工业和其它微生物生产部门所使用的高产菌株，毫无例外的都是通过生物学处理然后经选育而明显提高其生产性能的。酵母菌种资源的开发及改良是酵母菌利用中的一项长期不可缺少的工作，自从遗传工程问世以来，使酵母菌遗传育种工作上了一个新的台阶，为选育工作开辟了广阔的天地【4】【5】。
传统的育种方式是先设法得到出发菌株，再进行定向培养和选育，这为本次实验提供了理论依据和基础。具体步骤是：利用酵母菌的某种特殊生理要求先进行富集培养，然后从众多的微生物中分离出酵母菌；经扩大培养后，根据分离所得酵母菌的形态特征，查找权威的资料，对其进行鉴定和确认【6】【7】。
只有不断的选育优良的菌种，才能开发出新产品，生产出好产品，适合新的生产。本文及相关实验立足于此，旨在探测苹果皮，葡萄皮，沙果皮上主要的酵母菌菌群，尝试从苹果皮，葡萄皮，沙果皮中分离野生酵母菌，从而选育适合于不同生产的改良原始菌株,为下一步菌种改良做基础工作。
2 酵母菌的简单介绍【8】
2.1 特征
多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般1~5微米5~30微米。
酵母菌的各种形状
酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌
具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞
膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，
有的还具有微体。大多数酵母菌的菌落特
征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌
落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌
落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的
颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为
红色，个别为黑色。有些种类培养时间长了，
菌落皱缩，有特殊酒香味。
酵母菌的结构2.2 生殖
酵母可以通过出芽进行无性生殖，也
可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无
性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上
长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体
分离。在营养状况不好时，一些可进行有
性生殖的酵母会形成孢子（一般是四个），
在条件适合时再萌发。一些酵母，如假丝
酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无
性繁殖。酵母菌的无性繁殖有出芽繁殖和分
裂繁殖两种。出芽繁殖是酵母菌中最普通的
繁殖方式。先在一端生一小突起，称为生
“芽”，同时进行核分裂，核分裂后，一个
子核留在母细胞内，另一个子核进入芽内，
芽渐膨大，以后母细胞与“芽”接触处细胞
壁收缩，分隔形成子细胞，有时在尚未脱离母细胞的子细胞上又长出新芽。如此连续进行，可相互连接而成“假菌丝”。
有的酵母菌如裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces）进行分裂繁殖，在分裂过程中，首先核分裂，然后中间出现横隔而形成两个子细胞。少数酵母菌进行有性繁殖，产生子囊孢子等。
子囊孢子也可由单雌生殖形成，即子囊孢子的形成无需经过两细胞间结合，而是在一个细胞内，首先进行核的分裂，分裂后的子核和一部分细胞质的外围生出细胞壁，成为子囊孢子。有些酵母从来不形成子囊和子囊孢子，如红酵母属（Rhodotorula）。
2.3 酵母菌的生长条件
营养:酵母菌同其它活的有机体一样需要相似的营养物质，象细菌一样它有一套胞内和胞外酶系统，用以将大分子物质分解成细胞新陈代谢易利用的小分子物质。
水分: 象细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极少的环境中生长，如蜂蜜和果酱，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。
酸度:酵母菌能在pH 值为3-7.5 的范围内生长，最适pH 值为
pH4.5-5.0。
温度: 在低于水的冰点或者高于47℃的温度下, 酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20℃~30℃之间。
氧气:酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。
3 材料与方法【9】【10】
3.1 材料
原料：成熟的苹果、葡萄、沙果、马铃薯。
药品和试剂：琼脂、乳酸、蒸馏水、0.1%美蓝液等、葡萄糖、
酒精、无菌水。
主要仪器和设备: 显微镜、恒温培养箱、高压蒸气灭菌锅、干热
灭菌器、无菌培养皿(40个)、接种环、1ml的
无菌吸管（6个）、试管（30个）、250ml的三
角烧瓶（20个）等。
3.2 方法
3.2.1 分离
3.2.1.1 原理
大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。（故用乳酸马铃薯葡萄糖培养液进行富集培养【3】，再在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上反复划线分离，纯化分离不得少于3次，直到分离出纯菌株）
3.2.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。
制法：
（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。
（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115摄氏度条件下高压灭菌20分种。
（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml 培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。
3.2.1.3 制作培养基的过程【11】【12】
（一）称量根据用量按比例依次称取成分，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入搪瓷缸。
（二）溶解在搪瓷缸中加入少于所需要的水量，加热，加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基溢出。溶好后，补足所需水分。
（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。
（四）过滤趁热用多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察
（五）分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。
1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2．固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。
3．半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
（六）加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
（八）保存灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。
3.2.1.4 灭菌【12】
在同样的温度下，湿热的杀菌效果比干热好，其原因有：①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较大同一温度的干热空气中易于凝固。②湿热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。
湿热灭菌的方法（高压蒸汽灭菌法）：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。
目前使用的压力灭菌器可分为两类：下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。
使用程序和注意事项：
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，水过多会延长沸腾时间，降低灭菌功效；水过少，就有将灭菌器煮干而引起炸裂的危险。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，注意平稳端正，扭紧螺丝，保证紧密封闭，勿使漏气。
3．供电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，排气时间约5min ，关上排气阀。注意：一定要将锅内冷空气全部排出，否则后来压力和温度的关系发生了变化，如压力达到了1kg∕㎝3，而温度达不到115℃，由于温度偏低影响灭菌效果。、
4．继续加热使温度升至115℃，压力达到1kg∕㎝3时，控制热源，维持压力至所需时间20 min。
5．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
6．做斜面试管培养基，取出后立即摆成斜面。
7．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。
干热灭菌法：干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。
（1）烧灼：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。
（2）干热灭菌器：可杀死一切微生物，包括芽胞菌。不能在火焰上灼烧的灭菌的器皿，放在干热灭菌器中加热160～180℃2小时进行灭菌。大的物品或难于传热的物品，则需要更长刚的时间。棉花和纸在180℃以上会烘焦，因此有绵塞和有纸包扎的物品，进行干热灭菌时，不能超过180℃。干热灭菌只适用于玻璃，金属和木质的空器皿，如果器皿中含有水分或培养基，都不能用此法进行灭菌。
1.洗涤清洁准备灭菌的玻璃器皿，要经过充分干燥（可置45～60℃烘箱烘
干）。
2.培养皿每5～6个用报纸包好或放在特制的铁盒内。吸管先在上端距管口
2～3cm处用铁丝疏松地塞上2cm长的一段棉花，然后用4～5cm宽的长纸
条，成约为46°的角度逐支以螺旋式包扎起来，上剩余纸条折叠打结。
包扎好的吸管可直接放在干热灭菌器内灭菌，或放在铁盒内进行干热灭
菌。带有橡皮管或橡皮塞的玻璃器皿不能用干热灭菌。
3.将包扎好的玻璃器皿放入灭菌器内，注意不能放的过满，妨碍气流流通，
关闭器门，打开通气孔，接通电源加热，等灭菌器内温度达到80℃时，
关闭通气孔，继续加热，待温度升到160℃时，控制温度不变，维持2
小时，关闭电源。
4.灭菌后切不可立即打开器门，必须等器内温度逐渐下降到60℃以下，才
能打开器门，在灭菌过程中，温度上升或下降都不能过急，否则玻璃器
皿容易炸裂。
灭国菌的器皿在使用前不应打开铁盒或包装纸，以免空气中的杂菌的污染。
3.2.1.5 步骤
a.接种: 各取成熟的苹果、葡萄、沙果的小块果皮，分别直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，每个样品做两个，即共6个250ml 锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液，两个加入苹果皮，两个加入葡萄皮，两个加入沙果皮置28～30℃的恒温摇床中，转速为120，震荡培养48小时，可见培养液变混浊。
b.培养:用无菌吸管取上述培养后培养液1ml，注入另6瓶乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28～30℃的恒温摇床中，转速为120，再震荡培养48小时用1ml的无菌吸管单独吸取培养液直9ml的无菌水中便是10-1如此稀释10-2、10-3。
c.分离:马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3培养液至培养基表面，用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀，而后6个培养皿做好标记放置恒温箱培养大约48小时（培养皿倒置），菌落长出后，观察菌落，并镜检菌体，一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养,如果结果复杂，未得纯培养，可进行再次分离培养，直到纯化为止,步骤如下：
（1）将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿大约15ml
冷凝成平面，记上标记。
（2）用灭菌的接种环挑取培养好的培养皿中长出来的菌落，在培养基上轻轻划线，注意不要用接种环将平板表面划破。用划线法分离，从而得到单个菌落。挑取单个菌落，反复多次划线分离纯化，直到获得纯培养。
（3）将纯培养移到斜面培养基上，必须用无菌接种环沾取纯菌落少许，在斜面上划线（波浪曲线）置恒温箱中培养，长出菌落后即可供研究观察用的纯菌。试管用记号笔注明菌号接种日期。
3.2.1.6 划线法【１３】
菌种的分离纯化技术——平板划线法
实验目的
了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。
实验内容
1．培养基平板的制备。
2．用平板划线分离法分离混菌。
实验原理
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。
实验器材
酵母菌
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
无菌培养皿，电磁炉，酒精灯，接种环等。
实验步骤
1．融化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基放置电磁炉上加热至融化。2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞(也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果三角瓶内的培养基一次用完，瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
4．划线操作
(1) 挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
(2) 划A区：将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。(3) 划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5．恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。
平板划线分离法
左：操作示意中：平板分区右：划线结果
3.2.2 鉴定
3.2.2.1 鉴定依据与原则
根据实验结果，查找权威性的鉴定资料，在相关检索表中找出与实验结果相对应的已知种，如果没有显著的差别，即为同种；差别不大，可作为最近似种的变种；与任何已知菌不相符合，即为新种【14】。不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标，对于酵母菌，本实验用形态特征鉴定。
3.2.2.2 鉴定步骤【14】【1５】
a.分离培养吸取10-3培养液0. 1ml至马铃薯琼脂琼脂(PDA) 培养基表面，用
无菌玻棒在培养基表面轻轻涂布均匀。将接种好的培养基倒置于
28 ℃恒温箱，培养24～48h。取出培养基，对菌落仔细观察分析，
挑选5个左右菌落涂片染色，显微镜下观察。
b.细胞形态取菌接入新鲜(PDA)斜面上，28 ℃恒温静置培养，2d 后涂片镜检。
观察记录细胞的形态、大小和出芽方式。
观察:用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色
液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察
酵母菌的形态和出芽生殖情况。
活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵
母菌的死活。
酵母菌形态的观察【1２】【1６】【1７】
(一)原理和目的
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显分化，菌体比细菌较大。繁殖方式也较复杂：无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。用美蓝染色制成水浸片，不仅可观察其外形，而且可以区分死活细胞。
通过实验，掌握观察酵母菌的基本方法，并观察其形态特征。
(二)材料和用具
酵母菌
0.1％吕氏美蓝染液。
显微镜；载玻片；盖玻片等。
(三)方法步骤
1)在载玻片中央加一滴0.1％美蓝染色液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养了48小时的酵母少许，放在美蓝染色液中，使菌体与染色液均匀混合。
2)取盖玻片一块，小心地盖在液滴上，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。
3)将制好的水浸片先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞，因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，所以细胞内氧化还原值(rH)颇小，而还原力强，若有无毒的染料进入细胞，即被还原脱色，但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。美蓝无毒，且能为活细胞还原成无色，故可用以区别细胞的死活。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
结果：
透明的是活细胞，染成蓝色的是死细胞
c.菌落形态将培养后的菌种划直线接种于新鲜(PDA)斜面上，28 ℃培养，2天后观察记录下述特征:菌落质地是否为奶酪状、粘液状。菌落颜色常为乳白色、奶油色、红色等。菌落表面是否反光或暗淡，是否平滑或粗糙，有无纹状皱折或疣状突起，菌落边缘是否光滑。
d.假菌丝形成将纯化的菌种接种在(PDA) 培养基上(平板接种前预先放置1～
2d 使其表面干燥)，接种方法为:在平板的一边直线接种，在中
间放上一片无菌盖玻片，在相对的另一边点接两点，在其中一
点上放置无菌盖玻片，以保证在菌落周围营造厌氧环境，有利
于假菌丝的形成。接种好的(PDA) 培养基于2 8℃下培养2d 后
直接在显微镜下观察假菌丝的有无及形态。
4 结果与分析
4.1分离
实验通过4次纯化分离，从苹果皮、葡萄皮、沙果皮得到了3种酵母菌
4.2 鉴定
酵母分类目前普遍采用荷兰Lodder的分类系统，主要根据其形态学特征来区分的。形态学特征可包括细胞形态、培养特征，能否产生假菌丝等.实验结果见表
酵母菌的繁
殖与形态特
征项目
1 2 3
细胞形态椭圆形柠檬形椭圆形
生长速度较快较快较快
繁殖方式单端芽殖两端芽殖多端芽殖
菌落形态大而厚表面和
边缘光滑呈奶油
色粘液状表面光滑菌落突
起单个分散呈乳
白色
表面光滑粘质状
菌落呈橘红色
假丝形成- - -
孢子- - -
感官有酒香味无明显酒香味无明显酒香味
注：表中“-”表示不能形成。
酵母菌的鉴定是细致而复杂的工作，酵母菌形态比较简单，缺乏明确的细胞分化，由上表所示的各项试验结果及文献【14】【1５】【1９】，可知1为酿酒酵母，2为克勒克酵母菌属酵母菌，3为红酵母属酵母菌。
菌落形态如下图。
5讨论
在分离初期富集培养过程中，需将溶液的pH 调节到3.8以下【1８】，用来抑制细菌的生长繁殖，且培养的时间不能过长，以防止霉菌的迅速生长。酵母菌培养中以划线的方式进行接种。比如化成折线形或者化成横竖多条线等划法。基本的原则是最初的接触点菌的浓度和数量较多，以此为原点在培养基上划线后，菌液被逐渐稀释，使聚集菌体分散成单个的分散的菌单体为目的进行的。在将菌落做进一步分离纯化过程中，使用的培养基须一致，否则，不但菌落形态不一，而且会很快丧失某些特性，酵母菌（Saccharomyces ）是真菌生物，分类上比较混乱，造成鉴定工作的困难。在鉴定之前，每个分离物至少要经过3次以上的纯化，做到确系纯种。
酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌也会生存在生物体内。本实验从苹果皮，葡萄皮（2），沙果皮（1）上分离得到了酿酒酵母菌( S accharomyces cerevisiae )，在葡萄皮（1）上分离得到了克勒克酵母菌属酵母菌( Kloeck-era spp )，沙果皮（2）上分离得到了红酵母属酵母菌（Rhodotorula ）。
酵母专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。（C6H12O6(葡萄糖)→2C2H5OH(酒精)+2CO2↑）在酿酒过程中，乙醇被保留
下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。
本实验只是从形态特征上进行鉴定，没有对生理特性（主要是糖类的发酵和硝酸盐的利用）等进行研究，鉴于酵母菌生物学特性对生产的重要性有待于进一步研究。酵母是工业中最重要和最广泛应用的微生物。目前着重解决大规模生产的技术难题, 为进一步推广、开展工业化生产打下良好的基础。
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酵母菌的培养和观察
酵母菌的培养和观察 目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1．观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
酵母菌的培养与分离
微生物学大实验 实验指导 编者: 生物技术教研室 200７。3 目录 实验一酵母菌得培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌得鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥７实验三酵母菌耐受能力得测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件得优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2２
实验五耐高温酵母菌株得诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥２７耐高温酒精酵母菌得选育及发酵条件得研究 实验一酵母菌得培养与分离 一、实验目得 学习培养与分离酵母菌得技术与方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生,其生活最适pH为4。５－６,常见于含糖分较高得环境中,例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速,易于分离培养,在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境得特点,常用酸性液体培养基获得酵母菌得培养液(这样做得好处就是酸性培养条件则可抑制细菌得生长),然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容与要求 (一)本次实验得方案由同学们自己制定,实验包括: １.马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液得配制。 2、菌株得筛选,根据一定得生产目得并从特定得样品筛选出高产酒精得适宜得酵母菌株。 3。酵母菌得分离,要求接种一次, 2８-３０℃,培养24小时,转接一次,２8－30℃,培养２4小时,并用镜检得方法独立判定所分离菌株就是否为酵母菌、 4、用划线分离法对酵母菌进行纯化,要求每组挑取单个菌落,连续划线分离4代,镜下为单一纯菌株,每组扩繁10支斜面菌种,备用、 四、实验得准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1％美蓝染液、1ml得无菌吸管、无菌培养皿等。 ２、马铃薯葡萄糖琼脂培养基: 原料:马铃薯(２０0克)、葡萄糖(20克)、琼脂(15－20克)、蒸馏水(１000ｍｌ)。 配制方法: (1)先将马铃薯去皮,切片,称20０克并加蒸馏水10０0ml,煮沸半小时,用纱布过滤,补足蒸馏水量至1000mｌ ,制成2０%得马铃薯汁。
变质米饭中霉菌的分离提纯
变质米饭中霉菌的分离提纯 【摘要】 粮食是最易被霉菌污染的一种食品原料，霉菌污染会造成粮食的霉烂变质，其产生的毒素会造成人畜中毒，而发霉变质的米饭中就有许多细菌，我们要从众多的细菌中提取我们实验所需要的一种霉菌，所以我们就要进行霉菌的分离与提纯。培养基是人工配制的适合微生物繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢物。本实验用的培养基是查氏培养基，它是培养霉菌用的，用以提供氮源、碳源及能源等。把从变质的霉菌中提取的较纯的霉菌接种到培养基中培养，进而再分离，最后提纯得到纯净单一的霉菌。然后将得到的霉菌做一些相对应的染色实验，再次验证霉菌的性质。 【关键字】 米饭分离提纯鉴定 霉菌(mold)是能引起物质霉腐的丝状真菌(Mycelial fungus)的统称，它不是分类学上的名词，而是真菌(Fungus)的一部分。凡是生长在培养基上成绒毛状或棉絮状菌丝体的菌，都称之为真菌。霉菌分别属于植物分类学的菌类植物的子囊菌纲(一、comycetes),藻状菌纲(Phycomcetes)和半知菌纲(Fungi imperfecti)。 霉菌在自然界中分布极为广泛，土壤、空气、水和生物体内外到处都有，与人们日常生活关系密切。霉菌除应用于传统的酿酒、制酱和制作其它发酵食品外，在农业、纺织、食品、医药和皮革等方面都起着极为重要的作用。但是，不少霉菌(黄曲霉、灰绿曲霉、绿青霉等)能在食品、谷物上生长并产生真菌毒素。粮食中常常生长的主要是寄生性和腐生性霉菌，其种类约有200多种。 发霉变质的米饭中有许多细菌，要想混杂的细菌群体中获得只含有某一或某一株细菌，就得进行微生物的分离与纯化。常用方法有：简单单细胞挑取法及平板分离法。本实验运用平板分离法。它是根据所分离的微生物的生长条件加入某种物质或选择某一温度、酸碱度等，进行培养，淘汰一些不需要的微生物，从而得到所需的微生物。 1.实验材料和方法 1.1材料与仪器
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
【实验】微生物的分离与纯化
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
酵母菌培养基的培养技术
酵母菌的培养技术 一.酵母菌的培养基的配方 1.麦芽汁培养基的配制 培养基成分:新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 配制方法:(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全) (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6.4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.马铃薯葡萄糖培养基的配制 培养基成分:马铃薯20g 葡萄糖2 g 琼脂1.5-2g 水100ml 自然pH 配制方法:(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。 （2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 3.豆芽汁葡萄糖培养基的配制
酵母菌的分离与纯化(借鉴材料)
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。
土壤中分离霉菌
土壤中分离霉菌 培养基（ms加乳酸和抑菌物质）1ml量 土豆200g蔗糖30g 琼脂20g 大量元素母液50ml铁盐、微量元素、有机成分母液各10ml 乳酸5g氯霉素0.1g ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1、实验器材的准备与灭菌 *用报纸包扎好所需的培养皿等工具进行灭菌 *加热至160℃～170℃维持2小时 *用高压灭菌锅制备无菌水 *准备好取土的工具及酒精 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2、药品的称量 *用分析天平准确称量元素和药品 *称量后溶解配制成母液 *在进行少量药品的称量 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3、其他药品的称量 * 用天平称取土豆100g *蔗糖30g *琼脂20g *放入抑菌物质0.1g *乳酸5g ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
酵母菌的分离纯化.
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后
果皮上酵母菌的分离与提纯
果皮中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适 pH 为 4.5- 6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、苹果皮、葡萄皮等。 2、马铃薯葡萄糖 xx 培养基： 马铃薯200g （煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g,水 1000ml， pH 自然。 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液： 配方同上，不加琼脂加乳酸，按 1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为 5.5 左右。 4、无菌吸管、无菌培养皿、涂布棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1 、接种： 取果皮（不需冲洗） 5 克，加入到 100ml 无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取
1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在 28-30C培养箱中培养24h- 48h,可见培养液变浑浊。 2、xx培养： 用无菌吸管取上述培养液1ml,注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在 28-30C培养箱中培养24h-48h。 3、分离纯化 : 用 1ml 的无菌吸管单独吸取上述培养液至 9ml 的无菌水中便是 10-1 如此稀释 10- 2、 10-3。马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3 培养液至培养基表面,用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀,而后做好标记放置恒温箱培养大约 24-48小时（培养皿倒置）,菌落长出后,观察菌落,并镜检菌体,一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来,是纯培养,如果结果复杂,未得纯培养,可进行再次分离培养（划线法）,直到纯化为止（注意保藏菌种），对纯化菌种再次固体培养 24h-48h,观察菌落特征（特征： 菌落质地是否为奶酪状、粘液状。菌落颜色常为乳白色、奶油色、红色等。菌落表面是否反光或暗淡,是否平滑或粗糙,有无纹状皱折或疣状突起, 菌落边缘是否光滑。）以及是否有酒香味。并拍照。 3、分离纯化： 用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板,用无菌吸管取 0.1ml加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养 24h-48h。然后用接种环挑取单个酵母菌菌落,在平板上四区划线,培养后分离得到单个菌落。 4、镜检： 挑取单菌落,制片观察其形态（美兰染色水浸片）。观察记录（拍照）细胞的 形态、大小和出芽方式。
霉菌鉴定结果
霉菌的鉴定方法参照微生物学实验手册[118]。 （1）菌落特征的鉴定观察： 观察菌落形状、特征，菌落颜色，培养基颜色是否有变化等。 （2）菌株特征及孢子形态观察： 挑取菌株的少量菌丝于载玻片上，显微镜下观察菌丝的颜色、特点，有无特殊构造，成熟子实体的颜色、形态等。 （3）霉菌的糖化能力测定实验： 配制含有4%淀粉的溶液100ml，加入一定体积菌液并发酵24H后，测定溶液中还原糖的含量，采用DNS法测定溶液中还原糖的含量。 霉菌的糖化能力表示为F。 F=残糖含量/4%淀粉 采用（DNS）3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。 (1) 原理 碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液与还原糖溶液共热被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540 nm 波长下测定棕红色物质的吸光度。 (2) 1mg/ ml葡萄糖标准液 准确称取100 mg分析纯葡萄糖（预先在80 ℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 (3) 3,5-二硝基水杨酸试剂 将6.3 g 3,5-二硝基水杨酸和262 ml 2mol/L NaOH溶液，加到500 ml含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。 (4) 制作葡萄糖标准曲线 取7支25 ml刻度试管，编号0～6，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml 葡萄糖标准溶液于7支试管中，并以蒸馏水补至2.0 ml，然后各加入DNS试剂1.5 ml。摇匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25 ml刻度处，颠倒混匀。在540 nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线(图3-1)。得到回归方程y＝49.665x+1.3421，其相关系数R2＝0.9951。 (5) 还原糖测定 取上清液0.2ml到试管中，再加入3,5-二硝基水杨酸1.5ml、蒸馏水1.8ml，摇匀后，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容到25ml，混匀后，540nm波长下比色，记录吸光值。通过标准曲线查
微生物的接种、分离纯化与培养方法
实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。实验内容： 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩.玻璃涂棒 6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45° C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
年糕中腐败霉菌的分离纯化与控制
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品安全与检测 · 317 ·2012年 第37卷 第12期作为中国传统食物，年糕(Rice cake)以糯米为原料，经浸泡、水磨、压榨、蒸煮、挤压成型等工序加工而成，具有爽滑、香糯的优良品质，深受消费者欢迎[1]。由于年糕营养丰富，水分含量收稿日期：2012-05-28 *通讯作者 基金项目：粤港关键领域重点突破项目(2009A020700007)。 作者简介：谢欣(1989—)，男，江西上饶人，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。 较高，水分活度较大，很容易滋生微生物而导致发霉变质。为了延长年糕的货架期，有必要对其采取必要的保鲜措施，而目前研究腐败年糕中霉菌的种类及来源的文献尚不多见，广东地区年糕谢 欣，许喜林*，林加燕 (华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640) 摘要：针对广东地区年糕在储藏、运输过程中易滋生霉菌等问题进行研究。从已发霉变质的年糕中经过分离、纯化得到4株霉菌，并进行初步鉴定，结果表明它们分别为曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)和单端孢霉(Trichothecium)。选取5种抑菌剂分别对分离出的4株霉菌进行抑菌试验，结果表明脱氢醋酸钠抑菌效果最佳，而作为天然防腐剂的肉桂精油也表现出较好的抑菌效果；若能将两者结合使用，则可达到抑菌、防腐和延长年糕保质期的目的。 关键词：年糕；霉菌；分离鉴定；抑菌 中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)12-0317-03 Isolation, purification and inhibition of the spoilage moulds in the rice cake XIE Xin, XU Xi-lin *, LIN Jia-yan (College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640) Abstract: The moulds contamination of the rice cake on its transportation and storage in Guangdong province was studied. Four mould strains were gained after isolation and purification of the spoilage moulds in rice cake, namely Aspergillus, Penicillium and Trichothecium. Five types of inhibitors were used to inhibit the moulds from rice cake, and the results showed that sodium dehydroacetate has the best antiseptic effect, besides the natural antiseptic-cinnamon also showed good results. It would achieve a better antiseptic effect and extend the shelf life of rice cake if we combined the inhibitors of sodium dehydroacetate and cinnamon.Key words: rice cake; moulds; isolation and identification; inhibition 年糕中腐败霉菌的分离纯化与控制的 研究
霉菌分类及生长
霉菌分类及生长条件 霉菌是一种多细胞微生物，广泛存在于自然界中，在微生物学上属于真菌。其通过孢子的形式繁衍。霉菌孢子普遍存在于土壤和一些腐烂植物中，经由空气、水及昆虫传播到植物上，一旦孢子接触到破裂的种子，就会迅速发生霉变现象。 霉菌按其生活习性分为田间霉菌和仓储霉菌两种。田间霉菌是指青霉菌属、麦角菌属和镰孢菌属（梭霉菌属），此类霉菌属野外菌株，通常谷物在未采收前就已感染，最适生长温度为5℃~25℃，该类霉菌在低温环境中也会繁殖，阴冷潮湿的天气更易于这些霉菌生长。仓储霉菌主要是指储存的饲料或原料，在适宜的温度、湿度等条件下产生的霉菌，以曲霉菌属为主，该类霉菌最适宜的生长温度为25℃~30℃，相对湿度为80％~90％。但是，田间霉菌若在适宜条件下、在仓储环境中也会快速繁殖，造成严重污染。 霉菌生长条件四要素：碳水化合物（如玉米等谷物、饲料）、充足的水分（湿度在85%以上）、适宜的温度（12℃~25℃）、氧气。 霉菌毒素产生、分类及危害 霉菌毒素是谷物或者饲料中的霉菌在适宜的条件下，在农田里、在收获时、在储存或加工过程中生长产生的、有毒的二次代谢产物。 迄今为止已经分离和鉴定出来的霉菌毒素有300多种。一般而言，霉菌毒素主要是由4种霉菌属所产生：曲霉菌属（主要分泌黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等）、青霉菌属（主要分泌橘霉素等）、麦角菌属（主要分泌麦角毒素）、镰孢菌属（主要分泌玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T －2毒素、串珠镰孢菌毒素），也是最见的几种霉菌毒素。不同霉菌毒素的危害能对动物产生危害的、最多见到的霉菌毒素多达20多种，分别亲嗜一种或多种组织与器官，并且多能对动物免疫系统产生损害，尤其是黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，造成免疫复合性损害，这种病理作用一方面与这些霉菌毒素的免疫毒理有关，也与它们泛嗜性的病理损害有关。霉菌毒素中毒在猪病发生学中的地位，全世界的谷物有25%以上受到霉菌毒素污染，我国的污染更为严重，中国农科院畜牧所的一项调查检测表明，配合饲料中不同程度霉菌毒素的污染高达80%以上。这说明生猪中少有不受霉菌毒素危害的，霉菌毒素中毒的患病率（包括显性患病率和隐性患病率之和）远远高于任何一种侵袭性疾病。 现代研究表明，饲料霉菌毒素无论是在许多传染病的发生上还是非传染病的发生上经常扮演“始作俑者”的角色。在饲料霉菌毒素中毒的基础上发生猪瘟（CSF）、猪伪狂犬病（PR）、蓝耳病（PRRS）、圆环病毒病（PCVⅠ）已是常见之事。在霉饲料中毒的基础上发生的肝肾