磷酸化蛋白质的分析方法

试剂：

乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 购自

Merck 公司(Darmstadt，Germany)。尿素(urea)，氯化钠(Sodium chloride，NaCl)购自Sigma 公司。甲酸(Formic acid，FA)、乙酸(Acetic acid，HAC)购自Aldrich(St. Louis，MO，USA)。盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuCl)，二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，碳酸氢铵(Ammonium bicarbonate)，碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA) 购自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega (Madison，WI)。所有的化学品的纯度级别除了乙腈是色谱纯外都是分析纯。实验所用水都经过Milli-Q system (Millipore，Bedford，MA，USA)处理。

样品制备

样品用2D 裂解液裂解（8 M Urea,4% CHAPS,65 mM DTT,40 mM Tris），100W 30 s 超声后，15,000g 离心45 min。取上清，Bradford法定量；取500μg 样品加入2ul 1M DTT，于37℃还原反应2.5h；再加入10ul 1M IAA 于室温避光烷基化40min。100%丙酮沉淀过夜，100mM碳酸氢铵（pH 8.5）溶解样品，按50：1加入胰蛋白酶酶解过夜。

磷酸化多肽的富集：

Loading buffer: (饱和glutamic acid/65%乙腈/2%TFA)

Wash buffer 1: (65%乙腈/0.5%TFA)

Wash buffer 2: (65%乙腈/0.1% TFA)

Elute buffer 1: (300mM氨水/50%乙腈)

1．100ul loading buffer 平衡TiO2 column；

2. 200ul loading buffer溶解样品(2mg)；

3.loading sample 到TiO2 column；

4. 100ul loading buffer wash TiO2 column；

5.100ul washing buffer 1 wash TiO2 column；

6. 100ul washing buffer 2 wash TiO2 column；

7. 100ul Elute buffer wash TiO2 column,收集Flow through ,冻干，准备MS分析。质谱分析

Surveyor 液相色谱系统与轨道线性离子阱(Orbi-Trap，Thermo Electron，San Jose，CA)联用进行一维质谱鉴定。使用的反相色谱柱为75 μm×15 cm，填料为C18(Column Technology，USA)。经过色谱柱的流速经过分流后为200 nL/min。使用120 分钟的梯度洗脱酶解肽段，从2%到35%缓冲液B (0.1% 甲酸的乙腈溶液)。Orbi-trap 离子传输毛细管的温度为160 °C。Nano 喷针电压为1.85 kV，碰撞能量为35%。离子阱内的离子数由AGC(automatic gain control)自动控制。一级质谱的扫描范围为400到2000 m/z，二级质谱通过data-dependent 模式触发，选择强度在前十位的离子进行二级质谱分析。动态排除的时间为1.5 min，30 s 内重复两次。

搜库：

液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,

LC-MS/MS)获得的MS/MS数据采用Mascot2.2程序搜索。参数设置为：蛋白酶为胰蛋白酶，最大允许丢失的酶切位点为1个，静态修饰选为半胱氨酸的羧氨甲基化，动态修饰选为丝、苏、酪氨酸的磷酸化(+79.98 Da)。母离子质量误差设为200ppm,碎片离子的质量误差范围为±1 Da。

我们产生正反库,数据格式由原始的氨基酸序列(正库)与逆向的氨基酸序列(反库)组成，目的是为了方便对数据的质量评价。搜库结果使用实验室编写的软件进行整合，最终的筛选标准为磷酸化修饰肽段的假阳性率(False positive rate，FPR)均小于1%，母离子误差为10ppm。

磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...

摘要磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost

磷酸化蛋白的富集

TiO2法磷酸化富集试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。流程： 1.TiO2 Beads 活化 ①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清； ②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清； ③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。 2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。 3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。 4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。 5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 4、5、6合并到一起，为Flow Through。 7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。

蛋白质磷酸化概述

蛋白质磷酸化概述蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在

酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情

(完整版)泛素化蛋白检测方法

泛素化蛋白检测方法蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游

泛素化蛋白检测办法

精心整理泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？研究上述内容的实验方法和实验流程：方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定

位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1， A泛。 SDS电

蛋白质磷酸化1

浅谈蛋白质磷酸化摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。一、蛋白质磷酸化的概述蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷

泛素化蛋白检测方法[精华]

泛素化蛋白检测方法[精华] 泛素化蛋白检测方法 , 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链(polyubiquitin chain)。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解;如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶(DUB)将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域(UBD)所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域(比如U-box或PHD结构域)的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 , 蛋白质泛素化的检测方法

研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点:哪些蛋白发生了泛素化;发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化;进行定量。明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么,或者说这一过程中的E3酶是什么, 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应,对下游的信号通路有什么影响, 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一:western blot and strip 通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二:western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。方法三:in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白 B(引起蛋白A泛素化的蛋白)，共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。方法四:in vitro ubiquitin-binding assay

生物质谱分析蛋白质磷酸化位点

磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解 1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸

磷酸化蛋白质组学

磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。图片来源：https://www.360docs.net/doc/b113597745.html,/wiki/Phosphoproteomics

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。蛋白质激酶蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。蛋白磷酸酯酶丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)

泛素化蛋白检测方法

泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？

磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC）固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发

(完整版)蛋白质泛素化研究进展—探索蛋白修饰的秘密

蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用

分子生物学---11蛋白质磷酸化和信号转导

蛋白质磷酸化和信号转导一、蛋白质磷酸化过程和功能 1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n （1）过程： P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶) P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n A T P A D P P h o s p h a t a s e（磷酸酶） P i （2）主要磷酸化位点（对有-O H的氨基酸进行磷酸化）丝氨酸（S e r）/苏氨酸（T h r）:磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变酪氨酸（T y r）:磷酸化之后通常招募其他蛋白因子，使下游蛋白质活性改变（3）蛋白质磷酸化的功能生物热力学；蛋白质降解；酶活性的调控（激活o r抑制）；蛋白质相互作用 2、重要的蛋白激酶（1）C D K s：c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶，属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶，和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性，作用于细胞周期的不同阶段（2）R T K s：R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶，是具有酪氨酸激酶活性的受体，如E G F R（表皮生长因子受体）（3）C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s：非受体酪氨酸激酶，存在于细胞质中，大部分结构中存在S H2、S H3结构域，是磷酸化的结合位点。如S r c、J A K、 F A K等二、信号转导 1、信号转导的种类 E n d o c r i n e（内分泌）：激素 P a r a c r i n e（旁分泌）：神经递质 A u t o c r i n e（自分泌）：生长因子 2、信号转导的步骤（1）信号分子的合成（2）信号分子释放（3）信号分子传导（4）信号分子与受体结合（5）激活细胞内信号通路（6）细胞内信号传导

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC）固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。

泛素化蛋白检测方法样本

泛素化蛋白检测方法蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样, 泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程, 它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽, 它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基, 因此它们之间也能够经过这些位点互相连接, 形成多泛素蛋白链( polyubiquitin chain) 。当前研究显示, 如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连, 会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解; 如果与被修饰蛋白上其它位点, 比如第63位赖氨酸残基相连, 则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。与磷酸化修饰途径一样, 泛素化修饰途径也是可逆的, 即能够经过去泛素化酶( DUB) 将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后, 连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域( UBD) 所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD, 这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶, 它能够分

为两大类, 即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域( 比如U-box或PHD结构域) 的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点: 哪些蛋白发生了泛素化; 发生了泛素化的蛋白质, 具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化; 进行定量。明确了上述几点后, 进一步需要弄清楚的是, 我们感兴趣的泛素化蛋白, 是如何发生泛素化的, 影响这一泛素化过程的关键分子是什么? 或者说这一过程中的E3酶是什么? 然后需要研究的是, 这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应? 对下游的信号通路有什么影响? 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一: western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带, 拍照后, 将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应, 显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二: western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点分析目录实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)

（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录）实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果实验平台 ●uniprot数据库: https://www.360docs.net/doc/b113597745.html,/(查看蛋白的修饰情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.360docs.net/doc/b113597745.html,/disphos/

PhosphoSitePlus:https://www.360docs.net/doc/b113597745.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载蛋白序列：fasta.txt

磷酸化蛋白质组学的研究及其应用

磷酸化蛋白质组学的研究及其应用郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法及其在生命领域的应用前景。关键词：蛋白质；磷酸化；翻译；方法；检测在对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物开发研究中，往往需要获取一些高通量、大样本、全局性数据，通过整体化系统性分析，从中寻找线索，推断可能的病因以及诊断靶标，由此诞生了诸如基因组学、蛋白质组学及代谢组学等建立在网络架构式研究思路基础上多种新的研究方法和理论。生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应,这些反应过程靠复杂的调控机制调节, 其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的[1]。目前,已发现20多种蛋白质翻译后修饰,以至一种基因产物可呈现磷酸化修饰、糖基化修饰、羧基化修饰、乙酰化修饰以及连接变异体等多种形式[2]。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性,以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程,并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式[3]。目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[4]。磷酸化蛋白质组学的研究尚处于初期阶段，鉴于其特殊的研究方法及内容，对揭示生命体尤其是疾病状态下细胞信号传导具有不可替代的优势[5-7]。此外，磷酸化蛋白质组学的研究为寻找药物新的作用靶点和疾病诊断指标提供全新的研究思路。本文就磷酸化蛋白质的检测、定量技术及其在生物领域的研究进行综述。 1.蛋白质磷酸化研究概况蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。在真核生物中常见的三种磷酸化形式,丝氨酸磷酸化最多,苏氨酸磷酸化次之,而酪氨酸磷酸化最少,三者的比例是1800∶200∶1[8]。丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的磷酸化是非常重要的蛋白质功能调节器[9],正确解析磷酸化蛋白质的结构以及为磷酸化的位点是磷酸化蛋白质组的主要任务之一。另外,蛋白质磷酸化在机体内是动态的过程,不同条件下蛋白质磷酸化的定量分析是差异蛋白质组学研究的重要内容。 2.磷酸化蛋白质的主要检测技术 2.1放射性标记法放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法,是将用放射性同位素P标记的磷酸化蛋白质,经分离、富集后,利用放射自显影技术进行磷酸化蛋白质的检测。若要进一步分析磷酸化位点,则需要通过蛋白酶解消化,再通过Edman降解或质