腺病毒分型诊断研究进展_谭耀驹
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
刺激响应性药物传递载体的研究进展
刺激响应性药物传递载体的研究进展 智能、可控、高效的刺激响应性药物传递载体是当今药物传递系统的研究及临床实验的热点。本文以”基于体内微环境”与”利用环境外加刺激激发”为主线，综述了几类重要的刺激响应性的药物传递载体材料。介绍了体内微环境信号如pH、温度、氧化还原电势、葡萄糖及酶响应性载体，环境外加刺激如电信号、光信号及超声信号响应性等体系及多响应性载体在药物传递系统中的应用。总结了药物传递系统的发展方向及亟待解决的问题，从科学研究及临床治疗角度介绍了药物传递系统的发展方向。 标签：药物传递；刺激响应；体内环境；外加刺激 药物传递系统（Drug Delivery System DDS）是现今科学领域的重点攻关项目，在各类生物医用材料研究中，大多数与药物（或者基因）传递相关。目前，药物传递系统研究的主要任务是：①控制药物在体内的持续作用时间及作用等级。②将药物靶向引导到人体中特定的区域或细胞。③克服某种不可避免的组织（如肺、皮肤和小肠等）对药物的阻碍作用。 为了实现这些目标，医学科学家设计了一系列的药物释放载体并取得了一定的效果。若想取得更加理想的效果，智能型药物传递载体显示出了更大的潜力。本文主要分别从”基于体内微环境的响应性载体”和”基于外加刺激信号的响应性载体”来综述目前刺激响应载体的研究进展。 1基于体内微环境的响应性载体 1.1 pH响应性载体人体的消化道有着明显的pH值变化，胃部的pH在2～3而在小肠出pH值升至8左右。基于此变化，简单的以聚丙烯酸PAA类水凝胶为载体包载胰岛素，由于在胃部pH较低，PAA的羧基不发生电离，整个水凝胶紧紧包裹着胰岛素，保护其不被胃液消化。一旦水凝胶来到小肠，pH升高致使PAA的羧基开始电离，整个体系溶胀，便可以通过简单的设计将胰岛素特异性的释放在小肠环境中。目前，大多数针对肿瘤治疗的pH响应性载体是基于肿瘤外部酸性微环境及内部溶酶体酸性微环境的，其中以”质子海绵效应”类载体为代表（可以在酸性下吸收氢离子，使得细胞浆大量渗透进入溶酶体中，最终使溶酶体破裂将药物释放入细胞浆中的一种机理。）发展出了一系列高效的药物及基因载体。 1.2温度响应性载体对于局部温度较高的区域如炎症与肿瘤组织附近，研究人员设计了一种存在低临界共溶温度（LCST）的聚N-异丙基丙酰胺（PNIPAm）类材料。通过调控其分子链的链段结构，使其在人体较高温度下产生亲水-疏水转变。利用材料的亲水-疏水转变，可以成功的控制载体聚集起效的位置，从而定点的释放出药物。利用温度响应性材料与光热试剂的有机整合体为治疗基体，利用外加辐射作为辅助治疗方法，将可以定点定量的对病灶进行清除。
慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳
中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.360docs.net/doc/b12739621.html,
职业性噪声聋诊断标准
职业性噪声聋诊断标准 2007-06-13发布 2007-11-30实施 中华人民共和国卫生部发布 前言 根据《中华人民共和国职业病防治法》制定本标准。 本标准代替GBZ 49—2002《职业性听力损伤诊断标准》，本标准自实施之日起，GBZ 49—2002废止。 本标准与GBZ 49—2002相比主要修改如下： ――根据《职业病目录》，将原诊断名称修订为《职业性噪声聋诊断标准》； ――强调了职业性噪声聋发病的剂量—效应关系； ――对观察对象的界定进行了修订，并取消了观察对象分级； ――对职业性噪声聋的诊断分级进行了修订，只分轻度、中度、中度噪声聋三级。 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由卫生部职业病诊断标准委员会提出。 本标准由中华人民共和国卫生部批准。 本标准由北京市预防医学研究中心负责起草。参加起草的单位有北京大学第三医院、首都医科大学附属北京同仁医院、天津市职业病防治院、上海市职业病医院、上海市疾病预防控制中心、山东省淄博市职业病防治院、广州市职业病防治院、辽宁省职业病防治院、广东省职业病防治院。 本标准主要起草人：王建新、康庄、赵培青、高建华、贾莉、谢兰兰、徐希娴、张正华、吴萍、蒋轶文、马谷丰、许恕中。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
――GB 16152-1996， ――GBZ 49-2002。 GBZ49-2007 职业性噪声聋诊断标准 范围 本标准规定了职业性噪声聋诊断标准及处理原则。 本标准适用于长期接触职业噪声所致劳动者听力下降的诊断及处理。 本标准不适用于生产过程中因压力容器、反应釜等爆炸导致的爆震聋的诊断及处理。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4854 声学校准测听设备的基准零级 GB/T7341 听力计 GB/T7582 声学听阈与年龄和性别的统计分布 GB/T7583 声学纯音气导听阈测定听力保护用 GB/T16180 劳动能力鉴定职工工伤与职业病致残等级 GB/T16403 声学测听方法纯音气导和骨导听阈基本测听法 GBZ2 工作场所有害因素职业接触限值 诊断原则
腺病毒详解
腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。衣壳（capsid）呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及12根纤毛（fiber），除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区（knob）。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。 腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。病毒基因组为线状双链DNA，大约含35kb～36kb，腺病毒12、18 和31型的DNA组成中，G+C mol%最低（48%～49%），属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高（61%），致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其基因同源性将人腺病毒分为A～F等6组。 腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA 末端蛋白（pTP）复合物（DNA-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号（ψ）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（ψ）的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补足。 病毒蛋白约11种（TP和PⅠ～PⅩ），其中有4种蛋白（病毒多肽PⅤ、PⅦ，末端蛋白TP、酶蛋白PⅩ）与病毒基因构成病毒核心，多肽PⅦ是主要的核心蛋白，如同组蛋白一样包裹病毒基因DNA。构成病毒衣壳的蛋白质约7种。多肽PⅡ是病毒衣壳中最丰富和最主要成分，六邻体是由3个PⅡ分子紧密相连组成。多肽PⅥ、PⅧ在六邻体与病毒核心之间形成连接桥，并与多肽PⅨ一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽PⅢ相连构成五邻体的基座蛋白，PⅢa为五邻体的周围蛋白，也参与衣壳的组成，五邻体通过PⅤ与病毒核心相连。多肽PⅣ主要构成病毒三聚体纤突，纤突与病毒血凝活性相关，因血凝素（纤突）具有型特异性，常用血凝抑制试验（HI）对临床分离株进行分型。 分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有49种，分为A、B、C、D、E 和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以达到1010~1011pfu/ml，满足动物实验的要求。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
基因治疗用腺病毒载体研究进展
基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景
class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 10281 6 Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):1385213911 7 Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):2451224581 8 Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):6073260761 9 Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:54725581 10 Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:91729241 11 Navarro F,Bollman B,Chen H,et https://www.360docs.net/doc/b12739621.html,plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 37423861 12 Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J]. Nat Med,2003,11:1398214031 13 Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:1404214071 14 Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:113982114071 15 Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2 plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:2861228661 16 Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:2867228721 17 Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:1056210601 18 Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:272391 19 G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):281 20 Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 20811 21 Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acid substi2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):5652256571 22 Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):3927239321 23 Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回) 第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述 蔡荣钱程审阅 【摘要】 由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high2capacity or gutted or help2dependent Adenovirus,HD2AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。 【关键词】 第三代腺病毒载体;辅助病毒;Cre/loxP 作者单位:310018浙江理工大学生命科学院 第一代腺病毒载体具有稳定、滴度高、高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT