蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化
一、研究背景及进展
蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
1.1.2 药品
弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
1.2 培养基
1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)
蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。
1.2.2 初筛培养基(% W/V)
弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。
1.2.3 发酵培养基(% W/V)
干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。
1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法
1.3.1 细菌富集培养
称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。同时做两个平行实验。
1.3.2 分离
将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
1.3.3 弹性蛋白平板初筛
将得到的单菌落用牙签点到弹性蛋白平板上，送37℃培养箱培养48h，观察有无透明圈产生。选择细菌水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行诱变实验。
1.4 菌种鉴定方法
根据《微生物分类学》和微生物菌种鉴定实验进行鉴定。
1.5 弹性蛋白酶活性测定方法
采用Sachar[5]方法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法加以改进。该法以与染料偶联的不溶性底物经酶作用而溶解至水相，反应上清液的光密度反应底物被消化的程度。取10mg 刚果红弹性蛋白- 弹性蛋白溶于1ml水中，加1ml pH7.4，0.2mol/L 的硼酸缓冲溶液，取1ml 适当稀释的酶液于37℃下振荡反应20min，加入pH6.0，0.7mol/L 磷酸钠缓冲溶液2ml 终止反应，过滤后取上清液测495nm 处的光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。
在此反应条件下溶解1mg 刚果红弹性蛋白- 弹性蛋白底物，所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位(U)。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选
2.1.1 弹性蛋白平板筛选
观察产生透明圈的菌落，选择有透明圈产生的菌落再点种到弹性蛋白平板上
2.1.2 菌株鉴定
经模式种对照，多组实验结果均表明属枯草芽孢杆菌。
2.1.3 对B1 菌株进行物理诱变并且测定诱变前后的其酶活菌株的筛选：
物理诱变后稀释涂布得到的单菌落转点到弹性蛋白选择性培养基平板上，培养48h，选择透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行发酵条件的研究。根据结果选择B 9 进行下一步的研究。取发酵液1ml加纯水稀释后用刚果红弹性蛋白-弹性蛋白测酶活吸光度(459nm)。原菌株酶活力：74.25U/ml；B9 的酶活力：120.00U/ml。
2.3 菌株B9 产生弹性蛋白酶的条件研究
2.3.1 不同碳源对产酶条件的影响
在产酶发酵培养基中，以4 % 的接种量，4 0 m l 摇瓶装量试验了浓度为4% 的五种碳源，在摇床上培养24h后，测菌体生物量及酶活吸光度。
2.3.2 不同氮源对产酶条件的影响
在蔗糖4.00g，玉米提取液0.20ml，K2HPO4 0.20g，MgSO4·7H2O 0.01g，pH7.0 的发酵培养基，4% 接种量，40ml 摇瓶装量的条件下，分别加入3% 的干酪素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉作为氮源，在摇床上培养24h 后，测菌体生物量及酶活。
2.3.3 碳源、氮源和生长因子的合适浓度对产酶的影响
在上述最佳碳、氮源发酵培养基中，用蔗糖、干酪素和玉米提取液进行正交试验L9(33)，以求得三者较适浓度。
2.3.4 验证实验
在蔗糖4.00g，干酪素3.00g，玉米提取液0.1ml，K2HPO4 0.20g，MgSO4·7H2O
0.01g，pH 7.0 的优化发酵培养基(g/100ml)，4% 接种量，40ml 摇瓶装量
条件下进行验证实验。测得的酶活力为：126.97U/ml。
2.3.5 接种量对产酶的影响
在300ml 的三角瓶中，装入40ml 上述优化发酵培养基，接入同一活化条件下的种子，接种量分别为1 % 、2 % 、3 % 、4 % 、5 % 、6 % 、7 % 。
2.3.7 初始pH 对产酶影响
对上述优化发酵培养基，用0.2mol/L 的NaOH 调节pH 值，使其初始pH 为
6.0、6.5、
7.0、7.5、
8.0、8.5 ，以3% 接种量，40ml 装瓶量，同一条件
下发酵。
2.3.8 重复实验
在蔗糖为4%，干酪素为3%，玉米提取液为0.1%，pH 为8.0，300ml 摇瓶装量为40ml，接种量为3% 时重复发酵实验，其产酶性质比较稳定。
3 结论
本研究从土壤中筛选分离得到多株可产弹性蛋白酶的菌株，其中大多属于芽孢杆菌属。产酶活性较高的菌株均出现在芽孢杆菌属中。经过物理诱变剂处理后，产酶能力大幅度提高。原菌株酶活为：74.25U/ml，物理诱变后的B 菌株B9 酶活为：120.00U/ml。经培养条件优化后B9 酶活为：311.54U/ml 由此结果看来，该菌株物理诱变的效果较化学诱变效果好；且菌株物理诱变后，经发酵条件优化其酶活提高了2.59 倍；较以往国内报道的酶活要高。
参考文献：
[1]颜子颖, 关国雄. 微生物发酵生产药用弹性蛋白酶[J]. 中国医药工
业杂志, 1991, 22(10): 469-472.
[2]刘小杰, 陈启和. 弹性蛋白酶的研究进展[J]. 中国食品添加剂, 2004
(4): 29-32.
[3]陈启和, 何国庆, 邬应龙, 等. 弹性蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件
的初步研究[J]. 浙江大学学报, 2003, 29(1): 59-64.
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的 发酵条件 张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华 （东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０） 摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５ 收稿日期：２００７－１０－１８ 作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶 生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］ 、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。 响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１ 菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２ 培养基 斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
蛋白酶产生菌的筛选复习课程
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、 45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、 摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌 移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜 纸。
五、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细 菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养 24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透 明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否 为芽孢杆菌。 （三）筛选
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶研究分析
个人收集整理仅供参考学习 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析 一、概述 1. 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属地一种.单个细胞0.7～0.8 ×2～3微米，着色均匀. 无荚膜，周生鞭毛，能运动.革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大.菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭.需氧菌.可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚.b5E2RGbCAP 有地菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶地重要生产菌；有地菌株具有强烈降解核苷酸地酶系，故常作选育核苷生产菌地亲株或制取5'-核苷酸酶地菌种.在遗传学研究中应用广泛，对此菌地嘌呤核苷酸地合成途径与其调节机制研究较清楚.广泛分布在土壤及腐败地有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名.p1EanqFDPw
2.地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生.细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB ）颗粒，产生近中生地椭圆状芽孢，孢囊稍膨大. 在肉汁培养基上地菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h 后菌落直径为3mm.本菌有动力.可调整菌群失调达到治疗目地，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌.能产生抗活性物质，并具有独特地生物夺氧作用机制，能抑制致病菌地生长繁 殖.DXDiTa9E3d 二、产酶地种类 1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面：枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生地枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染地条件致病菌有明显地抑制作用；RTCrpUDGiT 枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中地游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH 值，间接抑制其它致病菌地生长；5PCzVD7HxA 枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官地生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； jLBHrnAILg 枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
枯草芽孢杆菌B_1_菌株产蛋白酶液体发酵条件优化
山地农业生物学报25(6):554~557,2006 Jour nal of M oun tai n Agricu lture and B iology ⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件优化枯草芽孢杆菌B 1 郭成栓,谢和 (贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025) 关键词:枯草芽孢杆菌;蛋白酶;液体发酵;影响因素 中图分类号:TQ92016;TQ92512文献标识码:A文章编号:1008-0457(2006)06-0554-04 Opti m iz i n g li q ui d fer m entation conditions of protease by Bacill u s subtilis B1⑥ GUO Cheng-shuan,X IE H e(Co llege of L ife Science,Gu izhou University,Guizhou Guiyang550025,China) K ey word s:B acillus subtilis;protease;liquid fer m en tati on;a ffecti ng fac tors 蛋白酶作为一种重要的酶制剂,广泛应用于医药、食品、酿造、纺织以及洗涤剂等行业[1-2],在工农业生产和人们的生活中发挥着重要的作用。本实验室从酱香酒高温大曲中分离到1株产酱香兼性嗜热枯草芽孢杆菌B1⑥,该菌株可用来生产优异的具有浓郁酱香风味的食品[3]。研究表明,该菌株产生的蛋白酶与食品酱香风味的产生具有密切的关系,利用提取的蛋白酶可发酵生产出酱香风味的食品[4],因而该菌株产生的蛋白酶在食品开发上具有重要的应用价值。液体发酵一直是微生物生产酶类的主要方法,然而微生物的代谢过程受到p H、温度、溶解氧等一系列外界条件的影响,不同的菌株其发酵条件有非常大的差别,因此选择一个合适的发酵条件对于蛋白酶的生产是非常必要的。为此,笔者测定了碳源、氮源、p H值、温度、接种量、种龄、溶氧量等条件对该菌株液体发酵产蛋白酶的影响,以确定其最佳发酵条件,以期为蛋白酶的液体发酵生产和应用奠定一定的基础。 1材料与方法 111菌株 兼性嗜热枯草芽孢杆菌B1⑥,分离自贵州珍酒高温大曲。 112培养基 11211种子培养基细菌种子培养基:葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母膏5g、N a C1014g、KH2HPO40103g、CaC120102g、M gSO417H2O0102g,p H值710~712,121e、011MPa灭菌30m in。 11212发酵培养基碳源、氮源、NaC10.4g、KH2H PO40.03g、C a C120.02g、M gSO417H2O0.02g、p H值710~7.2,121e、011MPa灭菌30m i n。 113蛋白酶活力测定 采用FoLin)酚法[5]。 2结果与分析 211不同氮源对产酶的影响 以2g葡萄糖作为碳源,大豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵各2g作为氮源,培养基装 收稿日期:2006-06-02;修回日期:2006-07-03 作者简介:郭成栓(1977-),男,河南南阳人,华南理工大学在读博士生,主要从事发酵工程的研究。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍
(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究
枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究 摘要产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌在前期培养基质优化的基础上, 采用了分阶段溶氧控制策略，在5L发酵罐中进行过程控制,即在0～13 h控制溶氧为40%，13～21 h控制溶氧为50%，13 h后控制溶氧为40%。探索分阶段溶氧对枯草芽孢杆菌发酵过程的影响。利用单因素法对一株枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基成分进行优化，确定发酵培养基各成分最适宜配比。最后确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/ 100 mL)：酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.3 ,CaCl2 0.3 ,F e2+0.5;最适摇瓶发酵条件为: 菌龄12h,接种量3.5 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达507.53 U/ mL, 比在其他无机盐条件下的产量都高。此外,还进行了5 L 罐放大实验,装液量为3 L,在5 L 罐所确定的最适工艺条件下,发酵单位可达520.2 u/ mL 。 关键词：碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；液体培养基 引言碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,主要应用.于生产加酶洗涤[1] ,另外,在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化学试剂等领域也有应用。我国在20 世纪70 年代初期就成功开发了碱性蛋白酶,并实现了工业化生产[2]。目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL 以上,与国外先进水平相差甚远[3]。本实验所采用的产碱性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌,其实验发酵单位为22 000 u/ mL,与国外大型酶制剂公司所报道的生产水平30 000 u/ mL 相差较大[4]。本实验对该菌株的发酵培养基利用单因素实验确定其基本成分，选择出适合该菌株发酵的最适培养基，从而使其酶活有一定的增长,为其工业化生产奠定基础。 1 材料与方法 1.1 菌种与培养基 1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌(Baci11us subti1is)由农业与生物技术学院发酵工程实验室提供。1.1.2培养基 1.1. 2.1 种子培养基 胰蛋白胨5g, 酵母浸粉5g, 葡萄糖10g, K2HPO410g 1.1. 2.2 发酵培养基 酵母浸粉5g, 麦芽糊精20g, 柠檬酸钠3g, CaCl23g, F e2+0.5g
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定 作者刘艳芝指导教师张玲秀 （忻州师范学院生物系1201班034000） 摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化 蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。 一、材料及方法： 1.1 实验材料与仪器 实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 1.2 实验材料： 样品：取自忻州师范学院附近的土壤。 试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、 0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基 二、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL 酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml 产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml （二）分离 1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析 一、概述 1.枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。 有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
2.地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生。细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB）颗粒，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。本菌有动力。可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。 二、产酶的种类 1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类 枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面： ●枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短 杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用； ●枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中的游离氧，形成肠道低氧环境，促 进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌的生长； ●枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球 蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； ●枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤
产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
第29卷第4期2010年7月 大连工业大学学报 Journal of Dalian Polytechnic U niversity Vol.29No.4J ul.2010 文章编号:167421404(2010)0420248203 产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选 孙佳佳, 王红英, 钱斯日古楞, 常 凯 (大连工业大学生物与食品工程学院,辽宁大连 116034) 摘要:为了得到产胶原蛋白酶的微生物,以海产品市场附近采集的污泥为样品,经过富集培养后通过 明胶培养基进行筛选,获得1株产胶原蛋白酶的菌株。通过形态观察和生理生化特征分析,以透明圈和菌落直径之比(HC )为检测指标,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属。对它产生的胶原蛋白酶进行分离和活力测定,得到的酶活力为44.982U/mL 。经SDS 2PA GE 凝胶电泳检测,该酶将分子质量为100ku 左右的胶原蛋白水解成为8ku 左右的短肽,说明该酶能有效水解胶原蛋白。 关键词:芽孢杆菌;胶原蛋白酶;筛选中图分类号:Q93 文献标志码:A Screening of collagenase 2producing B acill us strain SUN J ia 2jia , WANG H ong 2ying , QI AN Si 2ri 2gu 2leng , CH ANG Kai (School of Biological &Food Engineering ,Dalian Polytechnic University ,Dalian 116034,China ) Abstract :Microbes p roducing collagenase were isolated in glutin medium from enriched cultivation of t he mud of fish market.Based on the higher ratio of hydrolyze loop to colony diameter (HC ),a strain with 44.982U/mL of collagenase activity was isolated.The strain should be Bacillus subtilis by the way of morphology and biochemistry characteristics.Further analysis showed that the crude enzyme with collagenolytic activity could hydrolyzed 100ku of the native collagen into 8ku of the small molecule substance. K ey w ords :bacillus ;collagenase ;screen 收稿日期:2009210219. 基金项目:辽宁省教育厅A 类项目(2008063). 作者简介:孙佳佳(19852),女,硕士研究生;通信作者:王红英(19682),女,副教授. 0 引 言 胶原蛋白酶(Collagenase ,E.C 3.4.24.3)是作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的酶类。它来源广泛,多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原蛋白酶[1]。目前已发现溶组织梭菌、溶藻弧菌等微生物能产生胶原蛋白酶,并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物[2]。 枯草芽孢杆菌生境多样,可利用的营养物质种类十分丰富,这决定了其具有丰富的产酶系统,具备生产多种酶的应用潜力[3]。研究表明,枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[4]。近年来,对枯草芽孢杆菌的研究已渐进到遗传学与微生物学领域[5],但由枯草芽孢杆菌提取出胶原蛋白酶的文章还未见报道。本实验以海产品市场附近的污泥为样品,筛选新的高产胶原 蛋白酶的微生物,并对其进行初步鉴定。 1 材料与方法 1.1 材 料 样品,采自大连市海产品批发市场附近的污泥。 主要试剂:胶原蛋白粉末,本实验室自制;酪蛋白,金铂铱科技有限公司。1.2 产胶原蛋白酶菌的筛选1.2.1 培养基 富集培养基(100mL ):胶原蛋白10g ,酵母膏0.01g 。 明胶培养基(100mL ):明胶2.0g ,蛋白胨0.5g ,KH 2PO 40.05g ,MgSO 4?7H 2O 0.02g ,NaCl 0.01g ,p H 7.2～7.5,琼脂1.5g 。1.2.2 富集培养 取污泥10g 置于三角瓶中,加100mL 富集
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白 水解圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化 合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 ?学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 ?学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 ?掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。 2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。 3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
高温蛋白酶产生菌株的筛选
高温蛋白酶产生菌株的筛选 一、实验目的 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有： 平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min ②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板） * 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。 各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。 pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。 ③生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支 ④其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL， 500 mL规格）、革兰氏染色液等。 四、实验内容 1.采样 学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。 2. 增殖培养（富集培养） 一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的