实验步骤及配制方法
石蜡切片免疫组化步骤：
1.取石蜡切片置烤箱60度1小时。
2.取出后放入二甲苯5min×3次
这两个过程为脱蜡过程
3.置100％乙醇2min×2次
4.置95％乙醇2min×1次
5.置80％乙醇2min×1次
6.置70％乙醇2min×1次
这4步为水化过程
7.置pbs缓冲液洗3min×3次，准备抗原修复。
8.柠檬酸钠抗原修复液在微波炉加热至沸腾100度（中火）（大约5分钟即沸腾）。放入拨
片，置微波炉中，中低火加热10min。后取出放室温冷却30min。（注意：我们的修复液容器是用装pbs那样的小容器装的，有些人用大容器装沸腾用时就长一点，不过中低火加热还是10min）
9.pbs洗5min×3次。
10.滴加A液（内源性过氧化物酶阻断剂）放置室温盒30min。
11.pbs洗5min×3次。然后滴加B液（血清封闭液，封闭非特异性抗体）放置1小时。
12.加入用BSA稀释的一抗，置40度冰箱过夜（MMP-2 1 ：400 稀释液）（MMP-9 1：
200稀释液）。补充：BSA是稀释液.MMP-2、MMP-9都是抗体，这是我们需要检测的抗体，你们组的跟我们的不一样的。
13.次日，取出标本放置室温1小时。
14.用PBS洗5min×3次
15.加入二抗（即C液）一小时。
16.用PBS洗5min×3次。
17.加入三抗（粉红色D液）30min
18.用PBS洗5min×3次
19.用枪加50ulDAB显色液（看颜色变棕色）。DAB配制：850ul双蒸水＋A、B、C液（小
瓶A、B、C显色液）各一滴。
20.PBS洗5min×3次
21.复染0.1%苏木素泡45s或51s（时间使我们时间摸索出来的，你们的可能跟我们不一样）
→去离子水冲洗至切片呈蓝色→70%酒精3min）→80%酒精3min→70%酸性酒精（70%酒精加1%盐酸）分色30s（这个也是要看最后染色情况而定，也是摸索出来的）→90%酒精3min→100%酒精×2次3min→二甲苯Ι4min→二甲苯п4min→中性树胶封片、镜检。（梯度酒精脱水，二甲苯透明）
PBS配制：
PBS2000ml：
Nacl 15.8g
Kcl 0.4g
Na2Hpo4 2.88g
KH2po4 0.48g
注意：测PH前PH7.PH4标准液（从大实验室的冰箱找到）从冰箱拿出放置30min Naoh 在水迷宫的冰箱能找到
最终的PH范围是7.2-7.4
柠檬酸三钠修复液配制：
30g柠檬酸三钠；4g柠檬酸→500ml蒸馏水溶解→定容至1L→调PH至7.4-7.6.
一抗稀释液（100ml）的配制：PBS﹢1%BSA﹢0.2Triton。
BSA是晶体，用天平称量：1gBSA﹢200ulTriton+40mlPBS→溶解完全→加PBS定容至100ml 补充：一抗上班时间找孙老师要。
配制明胶溶液：
称取5.0g明胶（GELA TIN）﹢500ml蒸馏水溶解（60度加热搅拌）→过滤→加25ml 甲醛溶液（40%）（现有）→加水定容至1000ml
补：载片过明胶：将玻片放入玻片架（玻片架应用前最好清洗洁净）→放入明胶溶液（以过滤）10s-12s→拿起滴至无明胶溶液→放入明胶溶液10s-12s→拿起玻片架尽量滴尽明胶液→放入烤箱30min→重复上述操作后→放入烤箱3h（60度）烤箱烤干玻片.
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学实验方法
实验1 植物总DNA的提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管 10、细玻棒 11、小烧杯（50ml） 12、离心管（50ml） 13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇
分子生物学实验步骤总结超全
一目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇 8) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤 1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10
分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。 5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9) 1mol／LHCl。 10) 0.2mol/LNaOH。 11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。 12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13) 0.05mol/LNaOH。 14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 （二）实验步骤：
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
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分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
分子生物学实验室常用仪器及使用方法.
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法 实验二质粒 DNA 的提取-碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA 提取 实验七 DNA 的定量 实验八 PCR 基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的 DNA 实验十 DNA 重组 实验十一动物组织细胞总 RNA 的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用 事实证明, 在科学飞速发展的今天, 无论从事哪个领域的研究,要想突破,除了有 良好的理论基础外,更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外, 还具有一些特殊用途的仪器, 这些仪器一般较精密, 价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机
低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术 , 因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内, 有多个厂家生产冷冻离心机, 本实验室的高速冷冻离心机为 GL-20G-Ⅱ型(上海安亭 ,落地式。配有角式转头:6×50ml 、 12×10ml 和 12×1.5ml 。极限转速 20000rpm 。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上,应至少距离 10cm 以上且具有良好的通风环境中,周围空气应呈中性,且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体,环境温度应在 0~30℃之间,相对湿度小于 80%。试转前应先打开盖门,用手盘动转轴,轻巧灵活,无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关,然后用手按住门开关, 再按运转键,转动后立即停止,并观察转轴的转向,若逆时针旋转即为正确,机器可投入使用。 2. 操作程序 (1插上电源, 待机指示灯亮; 打开电源开关,调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定,温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 (2设定机器的工作参数,如工作温度,运转时间,工作转速等。 (3将预先平衡好的样品放置于转头样品架上,关闭机盖。 (4按控制面板的运转键,离心机开始运转。在预先设定的加速时间内,其运速升至预先设定的值。 (5 在预先设定的运转时间内(不包括减速时间 , 离心机开始减速,其转速在预先设定的减速时间内降至零。 (6按控制面板上的停止键,数码管显示 dedT ,数秒钟后即显示闪烁的转速值,这时机器已准备好下一次工作。
分子生物学实验手册
微量加样器的使用及注意事项 1 微量加样器的使用原理及分类 根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。 活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml 之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。 以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。 2 微量加样器的一般使用原则 加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。 （1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。 （2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。 （3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。 （4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。 一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告专业：****** 班级：*** 指导老师：** 学生姓名：*** 目录： 实验一质粒DNA的小量制备 实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定 实验三感受态细胞的制备及转化 实验四PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，
如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂 材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。 试剂：
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 (2) 实验二质粒DNA的提取 (3) 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (4) 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (5) 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (7) 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (8) 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (9) 实验八RNA提取与纯化 (11) 实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (13) 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (15) 实验十一感受态细胞的制备及转化 (16) 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (18) 实验十三DNA分析——Southern杂交 (19) 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析 实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取 实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交
实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物 3、氯化钠 4、1mol/L NaOH 5、琼脂粉 6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等） （三）仪器 1、培养皿 2、带帽试管 3、涂布器 4、灭菌锅 5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等） 6、恒温摇床 四、操作步骤 （一）LB培养基的配制 配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入： 细菌培养用胰蛋白胨10g 细菌培养用酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。 LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 （二）细菌的培养 （１）在液体培养基中培养
《分子生物学实验》教学大纲
《分子生物学实验》教学大纲 课程名称：分子生物学实验 课程编号： 课程类别：专业基础课/必修课 学时/学分：24/ 开设学期：第五学期 说明 一、课程性质 专业基础课/必修课 二、教学目标 本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我院现有的实验条件，通过本课程的学习和实践，学生能够： 1.接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段； 2.熟悉基因工程的主要操作方法和步骤； 3.通过有限的实验室实践，加深对分子生物学主要理论的理解； 4.掌握分子生物学常用仪器设备的操作和应用能力，为今后从事教学、科研及技术开发打下坚实的基础。 三、学时分配表 序号 实验项目 实验时数 实验 类型 内容与要求 小计 实验1 基因组DNA的提取 6 验证性 利用CTAB法提取植物基因组DNA、紫外吸收法测定其含量。通过实验掌握植物基因组DNA 提取及纯化的原理和方法。 实验2 PCR基因扩增 6 综合性 利用PCR扩增目的基因。通过实验掌握 PCR 反应的基本原理与技术；掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 实验3 感受态细胞的制备及转化 6 综合性 以CaCl2制备DH5α感受态细胞，利用pMD18-T载体与实验2扩增的目的片段连接，转化DH5a 菌株。用α-互补现象和抗性筛选初步筛选转化子。通过本实验，学习CaCl2制备感受态细胞的方法；掌握DNA重组、细菌转化以及蓝白斑筛选的原理和技术。
实验4 质粒DNA的提取及电泳检测 6 综合性 将实验3筛选到的转化单菌落进行培养、从培养的大肠杆菌中提取质粒、酶切、电泳进行转化子的鉴定。 合计 24 四、实验方法与要求建议 本课程采用传统的实验教学方法，4人一组操作，结合小组讨论与集体讨论、实验设计、分子生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，提高学生从事科学研究的综合素质。 要求学生认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具；实验中严格按操作规程进行，仔细观察，及时记录实验现象及结果，认真做好每一天的实验报告；实验结束后仔细分析和总结实验结果；使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）；在操作过程中发现任何意外现象都要及时向任课教师报告；在实验过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面废物缸内），严禁随地投弃！ 五、考核方式及要求 1.考核方式：考试（√） 2.成绩评定： 记分制：百分制（√） 成绩构成：实验成绩（100分）=实验预习（10％）+实验态度、卫生、安全（10％）+实验操作（25％）+实验报告（25％）+实验考试（30％）。 重点考察学生对分子生物学实验基本理论和实验技能的理解、掌握及其灵活应用的能力。 本文 实验一基因组DNA的提取 一、实验性质 实验类别：专业基础课/必修 实验类型：验证性 计划学时：6学时 实验分组：4人/组 二、实验目的 1.学会离心机、移液器等分子生物学常用仪器设备使用方法； 2.掌握总DNA 的提取及纯化技术； 3.掌握紫外吸收法测定DNA含量的方法。 三、实验的基本内容和要求 （一）实验的基本内容 1.提取DNA、纯化 2.紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。 （二）要求：通过实验掌握植物基因组DNA提取及纯化的原理和方法；学习用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。
分子生物学实验技术实验内容
2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS-Biotragents液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入1、将100μl酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20μl）：按下列顺序加样
μl45×Buffer μl6dNTPs μl1RNA酶抑制剂 μl1Oligo（dT）μ随机引 μ反转录AMV1 μ提取RNA6 总体μ20 1h 42反应条件：℃ 注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20 PCR （三）实验安排：每人做一管。 ：按下列顺序加样μl）反应体系（50 ddHO 32.7μl 2510×PCR Buffer μl 4μldNTPs 2P1 μl 2μlP2 0.3Taq μl 4cDNA template μl μl50Total 反应程序： 预变性94℃2min 30s 变性94℃ 45s 退火50℃ 1min 延伸72℃