分析方法

定量方法的基本知识与扩展应用-1

原创：金属元素

第一章绪论

在我们日常的色谱分析定量中，根据标准样品在色谱定量过程中的使用情况，可以分为外标法、内标法、归一化法三大类。而在实际应用中对于一些特殊样品的分析，可能综合使用其中的二种或三种，形成更复杂的定量方法，如内加法等，较正因子归一化法等等。本文旨在通过对于日常的定量方法的综合讲述，并结合自己的实际情况对于方法进行扩展，变形，而更加有利于我们快速、准确的分析。如果能很好的掌握一些基本的方法，那么对于我们日常分析是非常的有帮助的，有时找到合适的分析定量方法会使们的的工作变得更轻松，更科学，更快捷。熟悉NBA的人都会知道，打球的最高境界是什么？是把打篮球上升到艺术的高度，在NBA确实有人做到了。其实我们也完全可以把分析工作上升到艺术的高度来做，把分析过程看作是在雕刻一件艺术品，那我们的工作做起来是非常的有感觉了！当然这也需要有良好的基础。

第二章基础定量方法综述

第一节：色谱定量计算的依据

色谱法进行定量计算时，样品中组分的含量C与面积A都必须符合线性关系，即C＝KA的关系。根据检测器响应机理和塔板理论，峰面积都应该满足此关系。

第二节：基本概念

1．绝对校正因子gi的计算

gi＝ms／Ai

式中ms是标准样品中组分i的含量，Ai是标准样品谱图中组分i的峰面积。

绝对较正因子是最基本的概念，当然它只是个人为的规定或定义，在实际应用中，我们把质量与面积进行反比也不会影响我们的计算，但为方便掌握其它的定量分

析方法，我们初步还是要按统一的一种方式进行记忆，这样能便于理解与扩展应用。

2.相对校正因子Gi

相对校正因子是某组分的绝对校正因子与标准物质绝对校正因子的商。计算公式如下：

Gi＝gi／gs

式中gi是组分i的绝对校正因子，gs是标准物质的绝对校正因子。

对同一类型的不同检测器来说，在组分i和s相同的情况下，相对校正因子是基本一致的。它只和检测器的性能、待测组分的性质、标准物质的性质、载气的性质相关，与操作条件无关。也就是说基本上可是认为相对校正因子Gi是一个常数。相对校正因子在好多相关文献上可以查到，在无法找到所有组分标准样品的时候，可以参考使用。但是由于不同检测器的性能有一定的差异，因此相对校正因子最好在使用的色谱上单独测定。

事实上，要测定样品中所有组分的绝对校正因子很复杂，难以找到所有的标准物质并一一进行测定。考虑到相对校正因子很容易获得，通过测定一个标准组分并得到其绝对校正因子后，可以用文献值推算出其它组分的绝对校正因子，因此相对校正因子具有很高的实际应用价值。

第三节：归一化法

归一化法有时候也被称为百分法（percent），不需要标准物质帮助来进行定量。它直接通过峰面积或者峰高进行归一化计算从而得到待测组分的含量。其特点是不需要标准物，只需要一次进样即可完成分析。

归一化法兼具内标和外标两种方法的优点，不需要精确控制进样量，也不需要样品的前处理；缺点在于要求样品中所有组分都出峰，并且在检测器的响应程度相同，即各组分的绝对校正因子都相等。归一化法的计算公式如下：

mi=AI/ (A1+A2+。。。An )* 100%

当各个组分的绝对校正因子不同时，可以采用带校正因子的面积归一化法来计算。事实上，很多时候样品中各组分的绝对校正因子并不相同。为了消除检测器

对不同组分响应程度的差异，通过用校正因子对不同组分峰面积进行修正后，再进行归一化计算。、

与面积归一化法的区别在于用绝对校正因子修正了每一个组分的面积，然后再进行归一化。注意，由于分子分母同时都有校正因子，因此这里也可以使用统一标准下的相对校正因子，这些数据很容易从文献得到。

当样品中不出峰的部分的总量X通过其他方法已经被测定时，可以采用部分归一化来测定剩余组分

第四节外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。

外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：

W＝A(W)／(A)

式中W与A分别代表在样品溶液 0 进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及

(A) 分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不需要前处理，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得

被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。当能够精确进样量的时候，通常采用外标法进行定量。

第五节：内标法

选择适宜的物质作为预测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测定组分和参比物在检测器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入量进行定量分析的方法叫内标法。特点是标准物质和未知样品同时进样，一次进样。内标法的优点在于不需要精确控制进样量，由进样量不同造成的误差不会带到结果中。缺陷在于内标物很难寻找，而且分析操作前需要较多的处理过程，操作复杂，并可能带来误差。一个合适的内标物应该满足以下要求：能够和待测样品互溶；出峰位置不和样品中的组分重叠；易于做到加入浓度与待测组分浓度接近；不与待测物反应；谱图上内标物的峰和待测组分的峰接近。

式中， Ai，As分别为待测组分和内标物的峰面积； Ws，W分别为内标物和样品的质量；Gwi/s是待测组分对于内标物的相对质量校正因子（此值可自行测定，测定要求不高时也可以由文献中待测组分和内标物组分对苯的相对质量校正因子换算求出）。

定量方法的基本知识与扩展应用-2

原创：金属元素

第六节：内加法

在无法找到样品中没有的合适的组分作为内标物时，可以采用内加法。在分析溶液类型的样品时，如果无法找到空白溶剂，也可以采用内加法。内加法也经常被称为标准加入法。

内加法需要除了和内标法一样进行一份添加样品的处理和分析外，还需要对原始样品进行分析，并根据两次分析结果计算得到待测组分含量。和内标法一样，内加法对进样量并不敏感，不同之处在于至少需要两次分析。下面我们用一个实际应用的例子来说明内加法是如何工作的：

举例如下：在分析某混合芳烃样品时，测得样品中苯的面积为1100，甲苯的面积为2000，（其它组分面积略）。精确称取40.00g该样品，加入0.40g甲苯后混合均匀，在同一色谱仪上进混合后样品测到苯的面积为1200，甲苯的面积为2400，试计算甲苯的含量。

分析：本题的分析过程是一个典型的内加法操作，其中内加物为甲苯，待测组分为甲苯和苯。解：1. 由于进样量并不准确，因此两次分析的谱图很难直接进行对比。为了取得可以对比的一致性，我们通过数字计算调整两次分析苯的峰面积相等。此时由于两次分析苯峰面积相等，因此可以断定两次分析待测样品的进样量是相等的。需要注意的是：此时两次分析的总的进样量并不相等，添加后样品比原始样品调整后的进样量中，多了添加的内标物的量。

调整可以用原始样品谱图为依据，也可以用添加后样品谱图为依据。但是通常采用原始样品作为依据以便计算最终结果时比较简单。注意：选用的依据不同，中间计算结果会产生差异，但不会影响最终结果。依据的谱图一旦选定，计算就应该围绕此依据进行。

在以原始样品谱图为依据的情况下，调整添加后样品谱图中甲苯的峰面积如下：

对比两次分析，甲苯的面积增加为2200-2000＝200。在两次分析待测样品量相同的情况下，内加物面积的增加来自于内加量。也就是说，由于内加物的加入，导致了内加物峰面积的增加。因此内加物的加入量与峰面积的增加量符合外标法的线性关系。

为此，计算混合样品中内加物的加入量，也就是甲苯相对于原进样量下浓度的增加量值：

据此可以计算得到在以原始样品谱图为依据的条件下甲苯的绝对校正因子g：

此时，可以根据外标法，以原始样品谱图为依据，计算得到甲苯的含量为

答：此样品中甲苯的含量为10％。

另：通过相对校正因子，容易得到苯的校正因子并计算得到苯的含量。

第三章：各方法的优缺点对比

1、外标法是所有定量方法的基础。在可以精确进样量的情况下，通常都采用外标法。比如如果我们有已知含量的标准品，象ARDRICH的标准品，那我们以此为标准进行外标定量的话，那基本就可以确定每一批产品的准确含量。

2、归一化法不要求精确进样量，但要求所有组分都必须出峰，或者所有出峰组分的总含量已知。有些时候虽然能够精确进样量，但所有组分都出峰的情况下，也使用归一化法。因为此时归一化法相当于外标法定量后，对总量进行归一化误差修正。这种情况下，有时我们对于检测器的选择会有一定的要求.

3、内标法是无法精确进样量、不是所有组分都出峰的情况下，解决定量的办法。相对而言，操作和计算都很复杂。内标法的关键是要能够找到合适的内标物。内标法的称量误差，应小于色谱正常定量分析误差。但随着我们的仪器越来越先进，越来越精确，用内标的方法越来越少！

4、再无法找到合适内标物的无奈情况下，可以使用内加法。内加法操作复杂，计算繁琐，不是一种常用的定量方法。

第四章实际应用中的定量方法扩展使用

在实际的应用中，受实际情况的限制，我们一般都不会完全的按照理论来进行操作。比如我们拥有自动进样器，进样准不准确的问题不再是问题，我们更在乎的是分析的速度，可以降低准确度，又或者我们想进行更加准确的分析等等，这些问题会因为我们每个人的要求不同及受现有条件限而也会选择不同的方法分析，

哪怕并不一定是最好的方法。下面就一些具体的情况介绍一些综合运用分析定量方法，也是对常规定量方法的扩展使用。

我们知道了以上的种种定量方法的优缺点后，就能够跟据实际情况进行选择和应用了。下面进行几种实例加以说明。

1，如果我们进行的是自动进样的话，那显然，进样应该是很容易准确的。

但实际情况也不尽然，本人就曾做过一些实验，发现如果进行了长时间的手动进样的训练后，用手进样的准确度也不次于自动进样的，只是由于有自动进样器的存在，为省力，方便我们就直接用它来进行进样，时间一长，我们便更加的手生，进样越来越差，而最终就完全依赖自动进样了。不过综合来说，自动进样器的准确度还是非常不错的，做外标来说应该是首选了。至于内标就更没什么问题了。而现在自动进样器已基本是主流进样方式。从而内标由于配样麻烦，内标物选择费力等原因而使得这种方法应用越来越少了。而内加法和我们日常做的加标回收率有些相似。

2，无论如何，归一化方法由于其最为方便，是我们日常分析最为常用的一种方法。但用这样的方法就我们一般常用的液相的UV检测器和气相的FID 检测器来说，很多的无机盐和水是不出峰的，有时会给我们带来很大的误差。但我们如果做以下工作后就会使得我们的误差变的很小了。UV来说，我们可以先用DAD检测器，进行波长的优化选择，这样使得出来的峰响应值尽量的接近，误差小了很多，同时我们还可以进行较正因子归一化，那这样的方法一但定下来，那这些峰的相对误差就基本不会存在了。但为了方便起见，就算做最简单的归一化，产生的误差我们也能接受的，这也是我们在多数的中控分析中多先择归一化的原因。当然如果做为最终的产品分析如果只靠简单的归一化，那误差还是大了些。但我们可以通过进行水份测定，和残渣的测定，把不出峰的物质进行基本测定，那就把这种误差降的更低了。当然了，如果我们仔细的研究就会发现，我们多数的反应液中，在进行简单的处理后，其实在里面存在的也多数为我们目标物的原料，或是它的异构和同系物。而这类物质本身和产品相比无论在UV还在FID

这两种检测器来说响应值都是很接进的，也正因为如此，归一化方法久不衰，我们使用起来也乐此不疲，直到今天也仍然是最为广泛的使用。

3，有时我们进行研发过程中，可能选择多条路线，而本身我们研发过程讲求一个效率，工艺本身是全新的，要求我们的分析方法不但要相对准确的监控到反应情况，更要求快速得出分析结果，这时归一化更是我们的首选，不但分析的结果迅速，更容易监控到有无其它的副反应发生。而对于我们所说的归一化对于HPLC来说还有等度和梯度之分。其实我们经过分析就能发现一些选择的因素来。比如我们如果只进行的是原料，产物和杂质的分析的话，那分离应该是比较重要的。所以来说，我们必须进行梯度分析，梯度的好处有很多，梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，减少拖尾；4.增加灵敏度，5，减少柱子及系统残留等。其实我们在一些现代的文献和国外的一些分析方法也能看出来，一般的归一化都是用梯度做的，同时我们在进行方法开发的时候，为了让更多的物质出峰，我们一般会进行低波长分析，这可以从紫外基础知识中也能得到这样的结论，这样能让我们监控更多的峰。而等度的应用与它不同，由于等度恰好有使仪器处于最稳定状态，前后进样不需等待系统平衡等优点，做内标和外标是非常不错的选择。但这样来说我们就必须选择高一些的波长，以屏蔽更多的杂质的干扰，这也是我们常见于，一些标准的分析方法往往归一化方法和外标的方法波长不同的原因所在。当然，就等度与梯度来说和我们常见的气相色谱中的恒温与程升在原理上是完全相同的，这里不再多说。

4，外标与内标固然准度是很高的，但由于每次进样时都要在之前进标样的分析，这个对于我们从事分析的人来说有时是非常的讨厌的，因为每次还要配标样，同时也要进标样，很麻烦的。在这里我们还可以进行一种变形的归一化与内标法结合使用的方法。我们可以选择一种在工艺中和目标物类似结构的容易除去的物质做为内标物，在反应过程中加入到反应液中，这样每次做分析的时候，由于我们的内标物的量是已知的，那我们只要进一针归一化，就可以从目标物与我们加入的内标物的比值就能基本判断出我们的反应情况。这样做的结果不但非常快捷同时准确度也是很高的，这在我们研发过程中应用于分析时是较为常见的。但有时我们难找到这样的物质，由于很难除掉我们加入的这个内标物而最终影响我们的反应或者由

于其它原因，而放弃这样的方案，在这里还有一种好的办法就是我们先

选择一种不与反应液里的物质反应的，但同时又比较稳定的内标物，我们先准确称量，再定容到大一些容量瓶里，在每次分析之前，我们可以称量一定量的反应液然后移取一定体积的内标物加入到反应液里，摇匀就可进样。这也相当于内标法与归一化法的结合吧。有时这样做也非常的有效。

5，还有一种外标与归一化的配合使用也非常有效。比如说我们做一些最终产品。含量可能已经达到了百分之九十八，但同时由于里面还有一些杂质，这时我们可以通过这样的方法进行准确定量。首先我们找到主成分的标

样，对其进行外标定量，而其它的杂质，我们经过定性可以基本确定是什么物质，或者说是哪类的物质，由于相同类的物质的响应值是接近的，所以我们可以用主成分分标榜校正主成分，而用一种杂质标样校正所有同类的杂质。然后进行综合归一化，这样出的分析结果就比只做一般的归一化来说要准确的多了，这样的方法在国外的一些分析方法中也经常的用到，本人感觉也是非常的科学与实用。

定量方法的基本知识与扩展应用-2

原创：金属元素

1，而对于定量过程中，我们发现最影响准确度与精密度的往往就是我们的称样量的问题。尤其是在称量样品很少的时候，比如说称量的样品量是15mg，那实际的称量误差可能会达到2%。这样的时候我们往往采用多称量样品，然后稀释来进行准确定量。比如说我们要称量15mg，然后定容在50ml容量瓶，我们可以先称量150mg定容在50ml容量瓶中，然后再移出5ml，再定容在50ml容量瓶中，结果和原来的浓度是一样的，不一样的是准确度提高了很多，虽然增加了步骤，但却能提高准确度。

2，而对于我们日常的称量所用的仪器，设备等也应该达到我们的定量要求。比如说我们的天平是四位的还是五位的，我们的容量瓶和移液管是不是经过检定的，是不是准确的。我们知道在国外的安培容量瓶与安培移液管的确是非常不错的，不仅定量准确，而且造型美观，材质优良，晶莹剔透，但价格较

贵，而国产的最好的要属天波的了。作工也很好，准确度也不错。对于内标和外标的定量应该已经是足够了