实验一--大肠杆菌基因组提取

在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用到的试验方法）做一定的解释。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这些过程并不是每一位同学都参与了的，故在本实验报告的开篇写出。

（一）制备1%的琼脂糖凝胶

称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL的1 × TAE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，取出摇匀。

（二）胶板的制备

1. 用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。

2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子。

3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶的厚度在3-5mm之间。

4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。

5. 向电泳槽中加入1 × TAE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。

（三）加样

1. 在样品中加入适量的10 ×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。

2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）

（四）电泳

1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5V/cm。

2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的2/3处时，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）。

（六）观察实验结果

在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。

实验一大肠杆菌基因组提取

【实验目的】

1.学习并掌握细菌基因组的提取方法

【实验原理】

DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种

去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

【实验材料】

大肠杆菌DH5α菌液

【实验试剂】

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

【实验仪器与用具】

微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床

【实验步骤】

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；

（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中；

（7）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm 离心10min，弃乙醇，吸干；

（9）溶解于20μLTE，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存。【实验结果与分析】

10 9 8 7 6 M

如图所示，8号为本组实验结果。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的两条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。RNA含量很大，所以出现拖尾现象。

实验二大肠杆菌感受态细胞的制备及验证

【实验目的】

1.掌握感受态的制备和转化的原理

2.学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法

3.为重组子的转化做准备

【实验原理】

本实验采用CaCl2制备大肠杆菌的感受态细胞。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存。

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法）。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA 酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

【实验材料】

大肠杆菌DH5α

【实验试剂】

LB液体培养基，0.1mol/Lcacl2溶液

【实验器材】

恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，低温离心机，微量移液器

【实验步骤】

一、感受态细胞的制备

1.将冻存的菌种1：100接种于3ml的LB液体培养基中，37℃摇床过夜震荡培养。

2.取1ml活化菌种接种于100mlLB培养基中，37℃摇床培养1.5-2h。

3.将菌种在冰上放置10min。4℃、4000rpm下离心10min收集菌体。

4.弃上清，用事先冰浴的0.1mol/Lcacl2重新悬浮细胞，冰浴30min。

5.收集菌体，条件同上。

6.弃上清，在冰浴条件下加入0.1mol/Lcacl2溶液。

7.分装保存（40%甘油与感受态细胞1：1混合，使甘油的终浓度为20%）。

二、验证

（一）制备含Amp的蓝白斑筛选琼脂平板

1.LB固体培养基融化后，待冷却到60℃左右，加入氨苄青霉素（工作浓度为100 μg/mL），混匀，倒入培养皿中。

2.培养基凝固后，在琼脂平板上加入40μL的20 mg/mL的X-Gal和4μL

的200 mg/mLIPTG溶液，用涂布器涂匀。避光保存3h，以利于IPTG和X-Gal 的吸收。

（二）重组子的转化

1. 取200 μL甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入1μL的重组

质粒（DNA > 50ng），混匀，冰上放置30 min。

同时做两个对照：

（1）阴性对照：200 μL感受态细胞，不加任何质粒DNA。

（2）阳性对照：200 μL感受态细胞，加入不带外源DNA的空载体。

2. 将转化的混合物立即放入42℃循环水浴中90sec（注意：不要晃动）。

3. 然后冰浴2 min。

4. 在转化子中加入600μL不含Amp的LB液体培养基，37℃摇床培养1h （慢摇）。

5. 4000 rpm离心5 min，沉淀细菌细胞。

6. 用微量移液器去除上清溶液600 μL。

7. 将沉淀与剩余的上清混匀，涂在制备好的含Amp的琼脂平板上。阴性对照的转化混合物，一部分涂于含Amp的琼脂平板，一部分涂于不含Amp的琼脂平板上，以检测感受态细胞是否污染。

8. 待菌液完全被吸收后，37℃倒置培养12-16 h。

【实验结果与分析】

实验结果：

感受态细胞制备成功，而且转化效率比较高。阴性对照没有出现菌落，结果正常。

分析以及讨论：

感受态细胞转化效率的影响因素

（1）细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌

液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。

此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

（2）质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10--100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

（3）试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

（4）防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、

DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

（5）整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

实验三重组子的制备和转化

【实验目的】

1.掌握PCR，回收与连接的原理

2.掌握重组质粒制备的方法

【实验原理】

（一）PCR原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA 扩增技术。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。

PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的

DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR 反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

如图：

（二）DNA重组技术

重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：

1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。