RNA干扰和siRNA转染的实用ppt
专业转染试剂制造商
RNAi和siRNA转染
Dr.Jim
Engreen Biosystem Co.Ltd.
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内容
?第一部分RNAi实验基本概念
?第二部分RNAi实验具体设计
?第三部分siRNA转染过程相关问题及解答
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第一部分
RNAi实验基本概念
主要内容
?1.RNAi的概念
?2.RNAi的启动途径
?3.非哺乳动物系统的RNAi实验?4.哺乳动物系统的RNAi实验
?5.RNAi效应表现
1.RNAi的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。
2.RNAi的启动途径
?(1) dsRNA途径
?(2) siRNA途径
?(3) shRNA表达载体途径
(1) dsRNA途径
?dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi 的发生。
?但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）。
(2) siRNA途径
?小干扰RNA，长21-23bp，双链。
?作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。
(3) shRNA表达载体途径
shRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。
3.非哺乳动物系统的RNAi实验
?如线虫、果蝇等可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA （通常>200bp）介导RNAi的发生。
?长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。
4.哺乳动物系统的RNAi实验
?通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。
?通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。
5.RNAi效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。
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第二部分
哺乳动物系统的RNAi实验设计
主要内容
?1. 需要短期抑制还是长效抑制??2. 采用siRNA进行实验的途径
?3. 构建shRNA表达载体进行实验?4. siRNA设计需要注意的问题
?5. 脱靶效应
?6. 转染是RNAi实验的瓶颈
1.需要短期抑制还是长效抑制?
?1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。
?2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。
2.采用siRNA进行实验的途径
?(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便?(2) 体外转录
?(3) Dicer/RNaseⅢ酶解
?这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率
3.构建shRNA表达载体进行实验
?需要构建相关质粒
?可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达?不能做荧光标记，无法直观知道转染效率
4.siRNA设计需要注意的问题
?(1) siRNA序列设计
?(2) 阴性对照的作用
?(3) 阳性对照的重要性
?(4) siRNA荧光标记的问题
(1) siRNA的设计
?理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。
?可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。
?如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。
(2) 阴性对照siRNA的作用
阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基
慢病毒转染PROTOCOL
第一天 病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。 加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。 注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。 第二天 准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。 移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。 注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。 培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。 轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。 注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。 注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。 注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。 第三天 移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。 孵育细胞过夜。 第四天 欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。 第五－六天及以后 用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
lentivirus generation 慢病毒转染手册
Generation o f L entivirus Reagents ?293T: ATCC ?Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001 ?FBS: Invitrogen cat# 16000-044 ?DMEM: Invitrogen cat# 11965-118 ?Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155 ?L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156 ?Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050 ?Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024 ?Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058 293T/fibroblast media (500 mls): DMEM (450 ml) 10% FBS (50 ml) Pen/strep (5ml) L-glutamine (5ml) NEAA (5 ml) Reagent setup Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors A. Production of Virus 1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection. 2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.
环境内分泌干扰物危害及作用机制研究
环境内分泌干扰物危害及作用机制研究 姓名：付东 所在学院：中医药学院 所学专业：中西医临床医学 年级：2015级 学号：2015223790
一、前言 环境内分泌干扰物，Environmental Endocrine Disruptors 简称EEDs，又称环境激素、内分泌活性化合物、内分泌干扰化合物，所谓环境内分泌干扰物系指一种外源性物质，该物质会导致未受损伤的有机体发生逆向健康影响，或使有机体后代的内分泌功能发生改变。潜在的内分泌干扰物则是一种可能导致未受损伤的有机体内分泌紊乱的物质。 如今环境污染导致环境质量日益恶化，对人类健康构成严重威胁，开展环境与人类健康的基础研究是科学与医学共同面对的课题。在当今全球性环境问题中，化学污染占70%左右，其中以EEDs对环境质量和人类健康影响最广，危害最大。 EEDs表现出拟天然激素或抗天然激素的作用，通过干扰机体的内分泌功能引起中毒或在比较低的接触水平即对心、肺、肝、肾、性腺等器官产生危害，即通过内分泌系统改变人的内环境而致病。人和脊椎动物具有相同的内分泌系统，如脑垂体、甲状腺、胸腺、胰腺、性腺等。这些腺体分泌的物质仅在体内起作用，不排除体外，故称之为内分泌腺体，其分泌物称为激素，能调节生物体的成长、代谢、和正常的生理功能。激素在体内的水平非常低，但有极大的功效，如胰岛素分泌不足会发生糖尿病，分泌过多则会发生低血糖。EEDs正是通过改变激素在体内的正常水平而对人体产生影响和危害的。 与其他环境污染物相比，EEDs对人体健康的影响有以下显著特点：
1.低剂量长期作用，具有慢性毒性效应； 2.对人体生长，发育，生殖产生影响，对后代影响影响巨大；； 3.与人体各系统重大疾病有密切，危害巨大； 4.采用常规的方法不易被筛选和检测。 因此，开展EEDs与人类健康的基础研究具有重大意义。 二、环境内分泌干扰物的类型 1.干扰雌激素作用的类群： 1)多氯联苯类化合物（Polychlorinated biphenyl, PCBs） 2)烷基酚类（Alkylphenol ,APs） 3)邻苯二甲酸酯类（Phthalate Esters ,PAEs） 4)二苯烷烃类（Diphenylkanes） 5)双酚化合物（Biphenols,BPs） 6)有机氯杀虫剂 7)除草剂 8)植物雌激素（phyto-estrogens, PEs）、真菌雌激素 9)某些重金属（铅、镍、汞） 2.干扰睾酮作用的类群： 1)氟他胺（Flutamide） 2)利谷隆（Linuron） 3)苯乙烯（Styrene） 4)二硫化碳（Carbonsulfide）
2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤
作者：空青山 作品编号：89964445889663Gd53022257782215002 时间：2020.12.13 稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天
环境内分泌干扰物及其危害
环境内分泌干扰物危害及作用机制研究 杜磊1，李勃2,3*，马瑜2,3，王长晔4 （1 西安市第五医院陕西西安710082； 2 陕西师范大学生命科学学院陕西西安710062；3陕西省微生物研究所陕西西安710043；4西安市莲湖区北院门庙后街社区卫生服务中心陕西西安710002）摘要：近年来，环境内分泌干扰物（EDCs）因其在环境中广泛存在和对生物及生态环境的严重危害而受到日益关注，并已成为毒理学、生态学、系统发育学、医学等诸多科学领域的研究热点。本研究基于近年来国内外研究成果和科学实践，着重介绍了目前EDCs的主要类型，对生物的危害及其作用机制，并就当前该领域研究中存在的问题以及未来的发展方向进行了探讨。 关键词：环境内分泌干扰物，内源性激素，作用机制，危害 The hazard and mechanism of the Environmental Endocrine Disruptors Du Lei1，Li Bo2,3*，Ma Y u2,3，Wang Changye4 1 Xi’an No. 5 Hospital, Xi’an 710082, China 2 Institute of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China 3 Shaanxi Microbiology Institute, Shaanxi Academy of Science, Xi’an 710043, China 4 Xi'an Lianhu District Beiyuanmen & Miaohoujie Community Health Center, Xi’an 710002, China Abstract: The Endocrine disrupting chemicals (EDCs) are natural or man-made agents widely presenting in the environment that interfere in someway with normal endocrine function and caused serious damage on the biocenosis and entironment. As a result, the effect and function of the EDCs has become a hot topic in many research fields such as Toxicology, Ecology, Development biology and so on. The present paper reviewed the researches on the hazard and mechanism of action of the EDCs and its main types. The development prospect and strategy are also discussed. Key words: Environmental endocrine disruptors, Endogenous hormones，interaction mechanisms，hazard 环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disruptors, EDCs）是一类存在于环境中的能够干扰生物体内源激素的合成、释放、转运、结合、作用以及清除，从而影响生物体的机 基金项目：国家自然科学基金资助项目(130770243); 陕西省科学院重点项目（2010ZD01） 通讯作者(Corresponding author)，E-mail:libo@https://www.360docs.net/doc/b316416542.html,
Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)
2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4?2H2O 或0.2g Na2HPO4?7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。 2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除 菌，4℃保存，不可冻牢凝固。 ^^^Day 1 1、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。 ^^^Day 2 2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。 浓度过高，混合均匀。 4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。 5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。 ^^^Day 3 6、观察24h 荧光。 ^^^Day 4 7、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。 Ooo 感染细胞 ^^^Day 1 1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。
在蛋白质测序中也有一定作用。具有可高温高压灭菌特性。用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果) 3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。过夜。 ^^^Day 3 4、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。 ^^^Day 4 5、晚上观察48h荧光率。（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。 6、药筛：用嘌呤霉素（puro） Puro:储存浓度：10mg\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\ml。 7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\ml维持培养一周后改用1ug\ml puro的培养基培养。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
环境内分泌干扰物与人体健康
环境内分泌干扰物与人体健康 管理学院营销1002 徐盛宇学号：3100806049 摘要：环境内分泌干扰物系指一种外源性物质，该物质会导致未受损伤的有机体发生逆向健康影响，或使有机体后代的内分泌功能发生改变。潜在的内分泌干扰物则是一种可能导致未受损伤的有机体内分泌紊乱的物质。本文着重阐述了环境内分泌物干扰物的研究历史；常见的环境内分泌干扰物种类；对人体健康的影响；环境内分泌物的防治对策。 关键词：环境内分泌干扰物人体健康研究历史种类影响防治对策 在目前人类生活、工作及活动的环境中,存在着大量化学物质。其中有 些是有害物质,是环境污染的主要因素之一,其化学成份复杂,门类繁多,毒性各异,造成对人类健康及生存的威协,不可乎视,广泛存在于大气、土壤、水系、粮食、蔬菜、水果、禽、蛋、肉、奶、鱼、虾等畜牧水产品、衣物家俱、建筑材料、装修物、汽车等交通工具、塑料制品中。分布在人类衣、食、住、行及工作的各种环境中。其中具有对人体自生激素的产生、分泌、代谢、消减作用的一类化学物质称之为环境内分泌干扰物。能影响人体的各种内分泌器官有如脑垂体、甲状腺、胸腺、胰腺、性腺等各种内分泌器官激素的生理功能对各种疾病的发生、发展、人体的生长、发育、生育及后代产生重要影响,其中不少的种类也属于环境诱变剂的范畴,同时具有致突变、致畸、致癌作用,但也有的与环境诱变剂不尽相同,包括范围较广,其毒性主要 作用于内分泌系统 1.环境内分泌干扰物的研究历史 1930s；实验室证实二强联苯具有雌激素活性，以后相继合成多种具有 雌激素活性的药物。 1970s：日本在对“水俣病”和“痛痛病”的病因学研究中提出“环境 激素”的概念。 1980s：日本、英国、美国许多地方同时发现具有精囊和卵巢的鱼、贝类，以及雄鱼雌性化。 1995：Minnesota的学生发现畸形青蛙。同年，成立了内分泌干扰物工作组；美国环境与自然资源委员会将内分泌干扰物研究列为五个最优先项目之一。 1996：Theo Colborn由于在EEDs研究领域的杰出工作而被授予Rachel Carson Leadership Award。同年5月，OECD成立EEDs筛选和研究专家 组。
慢病毒(过表达)包装步骤
. 慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 1.转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min ⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 2.收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 3.接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 4.检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品
环境内分泌干扰物与自身免疫性疾病详细内容(一)
环境内分泌干扰物与自身免疫性疾病详细内容(一) 关键词]自身免疫性疾病健康网讯:环境内分泌干扰物是指干扰生物体内维持自稳及调节发育过程中激素的产生、释放、代谢、结合、排泄、交互作用的外源性物质。本文介绍了环境内分泌干扰物的定义、分类、人群暴露方式以及环境内分泌干扰物对生物体免疫系统的危害;目的在于探讨环境内分泌干扰物与人类自身免疫性疾病的关系。1996年3月，TColbor，DDumanopskiJPMyers编著，由美国副总统戈尔作序的环境著作《OurStolenFuture》出版。该书对人工合成化学品在环境和食品中的残留、积累以及对人类内分泌、免疫系统等的干扰提出了警告，引起了公众对这类化学物质的强烈关注。研究发现，20世纪后期，野生动物和人类的内分泌系统、免疫系统、神经系统等出现了各种各样的异常现象，人类内分泌系统异常的突出表现是生殖异常。最早发现一些鱼类的生殖器官始终不能发育成熟，雌雄同体率增加，雄性退化，种群退化。类似的现象也出现在人类。20世纪60年代，美国女性一生中乳腺癌的发生几率仅为1/20，而20世纪90年代上升为1/8。而且近50年来男性的睾丸癌发生率增加了〔3〕几倍，前列腺癌增加了2倍〔1〕。大量调查资料表明环境中存在多种能模拟和干扰动物及人类内分泌功能的物质。这些外源性化学物进入机体后，干扰体内内分泌物质的合成、释放、运输和代谢等过程，并且能够激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏机体内环境的稳定，导致或加速自身免疫性疾病的发生。学术界将这一大类物质称为环境内分泌干扰物（endocrinedisrupters/endocrinedisruptˉingchemicals，EDCs）。更有学者认为:“环境内分泌干扰物”已成为继“温室效应全球变暖”和“臭氧层破坏”之后又一严重的全球性环境公害问题，属第三代环境污染物〔1，2〕。自身免疫性疾病（autoimmunedisease）是临床上常见的疾病，发病因素不仅决定于外环境多因素的变化和体内免疫功能的失调，内分泌激素的分泌和调节也产生了重要的影响。Wilder根据流行病学调查显示类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和甲状腺炎患者中的女与男比例分别为3:1，9:1和19:1〔3，4〕。同时，育龄期女性在妊娠期及产后激素水平出现明显波动时其自身免疫性疾病的发病率有明显的增加趋势，使人们逐渐地认识到内分泌激素对自身免疫性疾病发生的影响。美国变态反应学家Randalph 认为:新的医疗模式应该充分考虑患者的发病与他所处的生活环境的关系。人类自身的遗传因素是人类变态反应性疾病发生的内在因素，但环境因素可能直接触发疾病的发生〔5〕。由于B和T细胞表达的特异性总库是随机产生的，其中必定有许多细胞是对自身成分特异的。因此，机体必须建立自身耐受机制，以区别自己与非己决定簇，从而避免自身反应性的发生。然而，任何机制都有崩溃的危险，自身识别机制也不例外。人类在急剧变化的环境因素影响下，可导致环境性免疫功能失调，终致发生各种变态反应性疾病〔6〕。环境内分泌干扰物是否会对人的自身耐受机制造成威胁，从而打破人类的自身耐受机制呢?1环境内分泌干扰物的名称和定义环境内分泌干扰物（enviromentalendocrinedisˉruptors/Eds或endocrinedisruptingchemicals/EDCs）也叫环境荷尔蒙/激素（enviromentalhormonals）、环境雌激素（enviromentaloestrogens），还有人将它称为“雌激素类似物（EstrogenMimics，OestrogenChemicals）”或者“外源性雌激素（Xenoestrogens）”。作为第三代环境污染物，其名称及定义都很多，美国EPA内分泌干扰物审查和试验咨询委员会（EDSTAC）将环境内分泌干扰物定义为:干扰生物体内维持自稳及调节发育过程中激素的产生、释放、代谢、结合、排泄、交互作用的外源性物质〔7〕。2环境内分泌干扰物的种类和来源随着人类社会的发展，工业化程度日益提高，被人类利用的化学品有成千上万种，而有很多物质被证明与人类疾病相关。自从环境内分泌干扰物问题得到各国政府和研究机构的重视以来，已有上百种化学物质被证明是环境内分泌干扰物或具有雌激素效应。笔者依据其用途和来源将目前已认知的或怀疑的环境内分泌干扰物分为以下几大类:2.1工业用化学品（1）多氯联苯类（PCBs，PolyˉchlorinatedBiphenyls），用于电容器、油墨等，是一类难降解、难代谢脂溶性环境激素。可经胎盘到胎儿体内，蓄积在肝肾中;（2）二英类（DioxinlikeChemiˉcals），是具有高环境
关于慢病毒感染的相关知识总结讲解
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 令狐采学 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，
4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天 1、配管 A+B混合室温静置20min
环境内分泌干扰物对人类健康的影响
环境内分泌对人类健康的影响 20世纪最伟大的成就之一就是可以复制和合成有机化合物，从合成橡胶到各类药物。这些物质对人类文明的发展起到非常重要的推动作用，但人们也逐渐认识到其带来一些潜在危害。随着20世纪工业化不断发展，激素依赖性疾病呈现上升趋势。因此有学者认为这与不断增多的暴露于环境污染物及环境内分泌干扰素有关[1]。内分泌干扰素的问题逐渐被认识，同时越来越多的研究发现，在人类和野生动物体内，这类化合物仅通过很微小的剂量即可以与内分泌系统发生相互作用，对人体内环境产生潜在的影响，从而对人类和动物造成危害。 国外对环境内分泌干扰素的研究始于20世纪30年代，70年代后研究明显增多。但目前中国在这方面的研究仍较少，本文将综述环境内分泌干扰素的特性、作用机制及其影响，阐明环境内分泌干扰素污染对人类健康，尤其是对胚胎发育的影响，旨在为减少出生缺陷、促进人口健康、提高人口素质提供理论和实证研究依据。 环境内分泌干扰物质（environment endocrine disruptors，EEDs），又称环境类激素（environment hormone），是指对保持体内平衡并调节生长过程的天然激素的生成、释放、输送、代谢、结合、作用或消除具有干扰作用的外源性物质[2]。环境内分泌干扰素特性 环境内分泌干扰素的得名正是因为这些化学物质能够作用于激素通路而产生有害的影响环境。内分泌干扰素可分为自然生成和人为合成两种类型。有些植物，如大豆等可合成内分泌干扰素，然而大多数环境内分泌干扰素都是人为合成的，由于人类活动而释放到环境中的，这些物质降解后可持久地存在于环境中[3]。 环境内分泌干扰素多是一些与动物或人体内激素结构相似的有机化合物，这些物质大多具有较好的脂溶性和化学稳定性，毒性大，极微量即可起到扰乱内分泌系统的作用，这种危害是长期甚至多代的。内分泌干扰素的研究之所以重要，是因为很小剂量的内分泌干扰素即可能产生危害性后果，已有报道表明，环境中内分泌干扰素对野生动物数量和性别产生影响，例如，杀虫剂与佛罗里达州的鳄鱼数量减少或与河流下游灌溉用水中鱼类雌性化有关人类通常暴露于较低水平的广泛的环境内分泌干扰素的环境中，暴露水平较低，很难直接证明其对人类内
慢病毒包装实验步骤(精选.)
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。 仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片 刚铺板后 铺板1天后 第三天：上午 细胞转染： 细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右； 吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。 取出2个1.5ml的离心管，一份加入142ul的无血清培养基和58ulTRL转染试剂，吹打混匀。另一份加入包装质粒18ul、目的质粒10ul和无血清培养基总体积200ul充分混匀。 将2个离心管液体吹打混匀，室温静置20分钟
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书 产品描述： Polybrene（聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂），常用来生产非特异性凝集的红细胞。另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。 注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试[1]。 基本属性： 别名：1,5-dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide CAS No.：28728-55-4 纯度：≥94% (titration) 溶解方法：溶于水，溶解能力高达10%。0.9%Nacl溶液配制1mg/mL 的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。 保存与稳定性：粉末2-8℃保存，避免潮湿。1mg/mL储存液2-8℃，至少一年保持稳定。
操作步骤（仅作参考）： 实验1：逆转录病毒感染（Retroviral Infection） （1）重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基（5%血清）加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。孵育24h后，吸去培养液并用0.45μm滤器过滤。 （2）待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5×105/盘。 （3）病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。用含polybrene 的2ml病毒上清（或将病毒原液稀释到2ml）感染细胞，polybrene 的终浓度为5μg-10μg/ml。37°C孵育3-6h。 （4）收集病毒颗粒：加入8ml完全培养基。感染3天后，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。 实验2：转染 （1）完全生长培养基培养细胞,培养细胞密度约50%； （2）孵育细胞18-24h后准备DNA-培养基-Polybrene混合液，按如下操作制备混合液：①添加完全培养基（60mm培养皿2ml，100mm 培养皿3ml），37°C预热；②添加10ng~10μg质粒轻轻混匀；③加入Polybrene至终浓度为5μg-10μg/ml。轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。 （3）去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-Polybrene溶液，在37°C孵育细胞6-20h。细胞培养的前6h内约每1.5h轻柔混匀。（4）去除DNA-培养基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution