NF-kappaBp50基因敲除小鼠子宫内膜异位症模型的建立及其研究

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

子宫内膜异位症的药物治疗进展(一)

子宫内膜异位症的药物治疗进展(一) 【摘要】子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）是一种令人困惑的妇科常见病。近年来，随着对该病基础与临床研究的不断深入，EMs的药物治疗取得了很大进展。本文就EM的药物的治疗方法及其新进展做一综述。【关键词】子宫内膜异位症；药物；治疗子宫内膜异位症是一种常见的妇科疾病，其在育龄妇女中的发病率约为10%，在不育妇女中的发病率可高达30%～60%〔1〕。近年来并有明显的上升趋势。其主要症状表现为盆腔疼痛和不育。手术虽然是子宫内膜异位症首选的也是最好的治疗方法，但手术不能清除所有的病灶，也不能祛除肉眼看不到的病灶，术后复发常在所难免，因此，药物治疗仍占有重要地位。目前，通过临床验证且已被批准生产或进口上市的治疗子宫内膜异位症的药物有两大类，即雄激素类衍生物和GnRH-a 类。雄激素类衍生物达那唑是治疗内异症传统的有效的药物,但因有明显的雄激素副反应,发达国家目前已少用。GnRH-a是目前公认的治疗内异症最有效的药物,是发达国家最常用的药物,在我国临床应用近年来明显增多。另外,根据临床经验,公认可以缓解子宫内膜异位症疼痛症状有效的药物还有孕激素类和短效口服避孕药类。而其他药物的使用,如芳香化酶抑制剂、GnRH拮抗剂及含药物宫内节育器等还处于探讨阶段。1雄激素类衍生物:达那唑、内美通和孕三烯酮 1.1达那唑（danazol）又名丹那唑，是17ａ乙炔睾酮的衍生物,因此具

有一定的雄激素作用。达那唑可阻止垂体FSH和LH的释放,从而抑制卵泡发育和排卵,血雌孕激素水平显著下降,不利于异位子宫内膜的生长和发育。此外,达那唑对子宫内膜还有直接的抑制作用。长期使用后,异位子宫内膜萎缩,甚至死亡。研究还发现,达那唑能调节机体的免疫功能,使患者血清中IL-1，IL-6的水平明显降低，表明达那唑可显著改善与内异症相关的免疫异常〔2〕。适用于轻中度患者、年轻有生育要求者以及手术后巩固治疗。自月经期第1～3天内开始服用,每天2～3次,每次200mg,连续服用3个月为1个疗程,可以服用2个疗程,总量每天不超过800mg。有报道称达那唑与他莫昔芬同时服用,可以减少达那唑用量，并减轻达那唑的副作用〔3〕。另外本品可以阴道给药,可使局部较快的达到较高浓度,止痛与消结节效果较好。常见副反应有肝功能影响、雄激素作用、更年期症状等等，用药期间应每月复诊并检查肝功能，对肝功能轻度升高者可加服联苯双脂继续用药〔4〕，偶尔有肝功能过高者，宜及时停药并予保肝治疗，一般停药后2～4周肝功能恢复正常。 1.2内美通（gestrinone）化学名三烯高诺酮，国产者药物名为孕三烯酮。内美通为非饱和的19-去甲睾酮的衍生物，具有弱的雌激素活性但在体内则抗雌激素。其作用机制类似达那唑，通过抑制垂体促性腺激素，使LH和FSH下降，进一步抑制卵巢功能减少雌激素的合成；另一方面直接抑制子宫内膜及异位内膜，使异位病灶细胞失活及退化。自月经期第1～3天内开始服用,每次 2.5mg,每周2次，连服半年，最大用量为每周10mg。其不良反应发生率和达那唑相似，唯程度较轻。

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

子宫内膜异位症

子宫内膜异位症分享| 发布时间：2013年12月25日点击数：4137 次字体：小大具有生长功能的子宫内膜组织（腺体和间质）出现在宫腔被粘膜覆盖以外部位时称为子宫内膜异位症（EMT），简称内异症。 EMT以痛经、慢性盆腔痛、不孕为主要表现，是育龄妇女的常见病，该病的发病率近年有明显增高趋势，发病率约占育龄妇女的10%～15%，占痛经妇女的40%～60%。在不孕患者中，30%～40%合并EMT，在EMT患者中不孕症的发病率约40%～60%。该病一般仅见于生育年龄妇女，以25～45岁妇女多见。绝经后或切除双侧卵巢后异位内膜组织可逐渐萎缩吸收，妊娠或使用性激素抑制卵巢功能可暂时阻止此病的发展，故EMT 是激素依赖性疾病。 EMT虽为良性病变，但具有类似恶性肿瘤远处转移、浸润和种植生长能力。异位内膜可侵犯全身任何部位，最常见的种植部位是盆腔脏器和腹膜，以侵犯卵巢和宫底韧带最常见，其次为子宫、子宫直肠陷凹、腹膜脏层、阴道直肠膈等部位，故有盆腔EMT之称。一、发病机制本病的发病机制尚未完全阐明，关于异位子宫内膜的来源，目前有多种学说。 1．种植学说妇女在经期时子宫内膜碎片可随经血倒流，经输卵管进入盆腔，种植于卵巢和盆腔其他部位，并在该处继续生长和蔓延，形成盆腔EMT。但已证实90%以上的妇女可发生经血逆流，却只有10%～15%的妇女罹患EMT。剖宫产手术后所形成的腹壁瘢痕EMT，占腹壁瘢痕EMT的90%左右，是种植学说的典型例证。 2．淋巴及静脉播散子宫内膜可通过淋巴或静脉播散，远离盆腔部位的器官如肺、手或大腿的皮肤和肌肉发生的EMT可能就是通过淋巴或静脉播散的结果。 3．体腔上皮化生学说卵巢表面上皮、盆腔腹膜都是由胚胎期具有高度化生潜能的体腔上皮分化而来，在反复经血逆流、炎症、机械性刺激、异位妊娠或长期持续的卵巢甾体激素刺激下，易发生化生而成为异位症的子宫内膜。 4．免疫学说免疫异常对异位内膜细胞的种植、粘附、增生具有直接和间接的作用，表现为免疫监视、免疫杀伤功能减弱，粘附分子作用增强，协同促进异位内膜的移植。以巨噬细胞为主的多种免疫细胞可释放多种细胞因子，促进异位内膜的种植、存活和增殖。EMT 患者的细胞免疫和体液免疫功能均有明显变化，患者外周血和腹水中的自然杀伤细胞（NK）的细胞毒活性明显降低。病变越严重者，NK细胞活性降低亦越明显。雌激素水平越高，NK 细胞活性则越低。血清及腹水中，免疫球蛋白IgG、IgA及补体C3、C4水平均增高，还出现抗子宫内膜抗体和抗卵巢抗体等多种自身抗体。因此，个体的自身免疫能力对异位内膜细胞的抑制作用，对本病的发生起关键作用。 5．在位内膜决定论中国学者提出的“在位内膜决定论”揭示了在位子宫内膜在EMT 发病中的重要作用，在位内膜的组织病理学、生物化学、分子生物学及遗传学等特质，与EMT的发生发展密切相关。其“黏附-侵袭-血管形成”过程，所谓的“三A程序”，可以解释EMT的病理过程，又可以表达临床所见的不同病变。二、病理 EMT最常见的发生部位为靠近卵巢的盆腔腹膜及盆腔器官的表面。根据其发生部位不同，可分为腹膜EMT、卵巢EMT、子宫腺肌病等。 1．腹膜EMT 腹膜和脏器浆膜面的病灶呈多种形态。无色素沉着型为早期细微的病变，具有多种表现形式，呈斑点状或小泡状突起，单个或数个呈簇，有红色火焰样病灶，白色透

基因敲除技术样本

基因敲除技术点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

子宫内膜异位症动物模型研究进展

子宫内膜异位症动物模型研究进展 [摘要] 本文对子宫内膜异症（EMs）动物模型的构建方法及优缺点综合阐述，希望建立合适的动物模型，加深EMs病因学、治疗学的研究，以深入了解EMs发病机制，开发治疗新药，探索中药作用机制，实现多方面、多角度的中西医结合治疗，全面提高中西医结合治疗EMs的水平。中国论文网/6/view-12785809.htm [关键词] 子宫内膜异位症；动物模型；免疫机制；研究进展 [中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0028-04 Research progress of endometriosis

animal models JIN Jiyun1 XIA Qinhua2 1.The First School of Clinical Medicine，Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nanjing 210029，China； 2.Department of Gynaecology，Jiangsu Provincial Hospital of TCM，Jiangsu Province，Nanjing 210029，China [Abstract] This paper makes a summarization for the construction method and advantages and disadvantages of endometriosis （EMs）animal models，try to establish more appropriate animal models for the study of etiology and treatment on Ems，so as to deeply know about the pathogenesis of Ems，exploit new drugs，explore mechanism of traditional Chinese medicine，realize combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine from many aspects and angles，improve the

课题基因敲除小鼠的pcr鉴定

基因敲除小鼠pc鉴一、技术介绍与研究进展敲除动物技术已经/ 基因、基因敲入转该技术从上世成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，原核显史，经典技术如DNA纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历在小鼠模型构建方面日趋微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，制备技术一样，逐渐从完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的催生了数以百基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，然存在一些难以计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍TALEN和费用高昂等，而ZFN克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理同源重组的原理发展起来的，年代中后期基于DNA基因敲除鼠技术是上世纪80）homologous recombination1987年根据同源重组（在Capecchi和Smithies），这的外源基因的定点整合（EStargeted integration的原理，首次实现了），gene knockout（基因敲除）或gene targeting（基因打靶一技术称为利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝

尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图图制作流程三、．基因敲除鼠制作过程示意图图2. 载体设计与构建1. Knockout根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的的载体上，成为重

课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定

一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"

（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程

腹壁子宫内膜异位症的临床分析

腹壁子宫内膜异位症的临床分析【摘要】目的探讨腹壁子宫内膜异位症的诊断和处理。方法对我院1997—2007年收治的6例腹壁子宫内膜异位症进行回顾性分析，术后随诊0.5～2年。结果腹壁子宫内膜异位症占我院同期内异症的3%，我院腹壁子宫内膜异位症发生率为0.94/万。根据临床表现及病理检查，6例均诊断正确，均有剖宫产术史。发病潜伏期，30岁以前多在1年以内，30岁以上多在1年以上，两者差异有显著性（P<0.05）。腹壁子宫内膜异位症病灶完整切除6例，随诊6个月～2年，无复发。结论根据典型的病史和身体检查，可以对腹壁子宫内膜异位症作出正确诊断，手术切除为主要治疗方法。多次复发要注意恶变。【关键词】腹壁；子宫内膜异位症；诊断；治疗子宫内膜异位症（内异症）多发生在盆腔脏器，也可发生在阴道会阴和腹壁的手术切口，但并不常见。现将我院10年间的6例腹壁内异症的资料进行总结，报道如下。 1 临床资料 1997年1月—2007年12月间，在我院因内异症行手术治疗的病例共200例，其中腹壁内异症6例，占3%。10年期间，在我院行剖宫产术的孕妇为1158例，发生1例腹壁切口内异症，余5例均在外院剖宫产术。全部行手术治疗。其中部分患者手术前后辅以药物治疗，所有患者术后病理检查均证实为内异症。术后进行随诊。 1.1 一般资料年龄23～28岁，平均31.7岁，孕次1～4次，平

均1.9次，产次为1～2次，平均1.1次。 1.2 症状 6例腹壁切口处的病灶，均有与月经相关的周期性腹壁切口疼痛，有逐渐增大的触痛结节或包块。病变一般在皮下组织，很少突破皮肤表面，却可以侵犯筋膜，或腹直肌或腹壁肌肉，较少侵入腹膜或进入腹腔。所有患者均无月经期的腹壁节结部位出血。手术切除病理显示：在增生的结缔组织中可见内膜腺体和间质。 1.3 年龄与发病潜伏期 6例腹壁切口的内异症病灶发病潜伏期4～96个月，平均45.4个月。30岁以前发病潜伏期多在1年以内，30岁以上者发病潜伏期多在1年以上，两者差异有显著性（P<0.05）。 1.4 腹壁切口病灶病灶大小1.0～3.0cm，平均 2.0cm,3例单发病灶，3例多个病灶，侵犯筋膜、腹直肌。 1.5 手术时机手术前后不必注射GnRH-a或其他卵巢抑制药物，用也徒劳。做手术，不是希望结节小，而是宁可求其大，这样界限清楚，容易切干净，故选择月经期或月经刚过—病人症状明显，结节增大之时。本院6例术后随诊无复发。 2 讨论 2.1 腹壁内异症的发生内异症的发生机理尚不明了，故有经血逆流，淋巴播散，移植等学说来解释不同部位内异症的发生，移植学说意味着人为造成的内异症。通常有剖宫产或小型剖宫的历史，在其切口部位发生——纵切口或横切口。很容易让人想到是剖宫时子宫内膜的种植，但和经血逆流种植一样难以解释，剖宫产数量之大，不管如何注意，也不能完全避免羊水携带着内膜“污染”伤口，可多数人

子宫内膜异位症的临床治疗分析杨春峰

子宫内膜异位症的临床治疗分析杨春峰发表时间：2018-05-02T13:37:02.323Z 来源：《健康世界》2017年31期作者：杨春峰 [导读] 探究腹腔镜手术治疗子宫内膜异位症的临床效果。方法：将84例子宫内膜异位症患者按随机数字表法分为观察组和对照组杨春峰林甸县医院黑龙江大庆市 166300 摘要：目的：探究腹腔镜手术治疗子宫内膜异位症的临床效果。方法：将84例子宫内膜异位症患者按随机数字表法分为观察组和对照组，各42例，对照组42例患者进行传统开腹手术，观察组42例患者进行腹腔镜手术。分别观察两组患者术后疗效，进行临床分析。结果：2组手术均能彻底切除病灶，手术时间无统计学意义，观察组术后状况良好，不良反应少，术中出血量、肛门首次排气时间、伤口愈合时间、术后住院时间较对照组均明显缩短（P<0.05）。结论：腹腔镜手术治疗阴道子宫内膜异位症临床疗效优于传统开腹手术，能显著提升患者医疗质量，治疗效果稳定，可作为临床治疗的首选方案进行推广。关键词：子宫内膜异位症；腹腔镜手术；临床治疗 Clinical analysis of endometriosis Abstract：Objective：To explore the clinical effect of laparoscopic surgery in the treatment of endometriosis. Methods：84 patients with endometriosis were divided into observation group and control group according to the random number table method. The patients in the control group were treated with traditional laparotomy. The patients underwent laparoscopic surgery. The curative effect of the two groups was observed and the clinical analysis was carried out. Results：There was no significant difference in the operation time between the two groups. The operation time was not statistically significant. The postoperative condition was good，the adverse reactions were less，the amount of intraoperative blood loss，the first expiratory time，the wound healing time and the postoperative hospital stay（P <0.05）. Conclusion：The clinical effect of laparoscopic surgery in the treatment of vaginal endometriosis is better than that of traditional laparotomy. It can significantly improve the quality of medical treatment and stabilize the treatment effect. It can be used as the first choice for the clinical treatment. Key words：endometriosis；laparoscopic surgery；clinical treatment 前言：子宫内膜异位症是近年来生育年龄妇女的多发病症，这种病症主要由于是子宫内膜组织出现在子宫腔内膜以外的部位。在组织学上，这种异位症不仅只有内膜的病变，还有内膜兼间质的环绕，在功能上也存在着雌性激素水平显著改变的情况。如果未能及时治疗，该病可能导致患者不孕不育，降低其生活质量，更有甚者还能危及患者生命。目前临床主要采用腹腔镜手术治疗，本次研究针对腹腔镜手术与开腹手术在子宫内膜异位症临床治疗的效果进行对比，报道如下： 1.资料与方法 1.1一般资料选取我院于2016年6月至2017年5月收治的84例子宫内膜异位症患者进行分析，将其随机分为观察组与对照组。其中观察组42例，对照组42例。患者年龄22-45岁，平均年龄（30.9±2.1）岁。其中60例经产妇，24例初产妇。两组病例均符合诊断要求，家属均已签署知情同意书。两组病例各项信息经过统计学处理，存在可比性（p<0.05）。 1.2方法对照组采用传统开腹手术进行治疗，观察组患者采用腹腔镜手术方式进行治疗。麻醉方案两组均采用气管插管全麻。对照组采取传统方案于患者下腹部正中做一纵向切口，用直视方式考虑患者生育要求和实际病变情况进行处理。观察组患者与肚脐上方取一横向小切口，处理后将腹腔镜探头置入患者体内观察病变情况，再根据实际情况另行开口选择术式进行手术。 1.3观察指标术后观察并记录两组患者手术时长、术中出血量、住院总天数等，进行详细对比。并定期随访，调研患者术后的生活质量，并与术前进行比对。 1.4统计学方法数据使用SPSS 23.0统计软件进行处理，采用t检验和χ2检验，数据按例表示。所有数据均具有统计学意义（p<0.05）。 2.结果观察组平均手术时长55.62±5.50min，术中平均出血量60.22±3.5ml，住院总天数平均6.22±1.1日。术后治疗效果显著，且预后良好，生活质量较高的有41例，占97.61%。对照组平均手术时长90.35±5.38min，术中平均出血量110.15±4.5ml，住院总天数平均8.3±1.1日。术后预后良好，生活质量较高的有37例，占88.1%。根据上述数据，观察组手术消耗时长，住院总天数明显较短，术中出血量较少，且出院后调研结果显示观察组术后生活质量平均高于对照组。差异具有统计学意义（p<0.05）。 3.讨论以往临床方面对于子宫内膜异位症的治疗方式主要包括手术治疗和非手术保守治疗两种方式。由于保守治疗只能在一定程度上控制症状，并不能根除病根，采取此种治疗方式常常会出现易复发、疗效差的问题。因此，实际临床时我们最常使用的治疗方法即为手术治疗。这种治疗方式通过物理性完全切除病灶，从而从根本上起到防止复发、恢复器官功能、提高患者生活质量的作用。过去，子宫内膜异位症手术常常采用传统开腹手术方案。由于手术创口较大，恢复较为缓慢，恢复过程中患者痛苦程度较高，且恢复过程中较易感染，术后患者满意程度普遍较差。而本次研究中我们所采用的腹腔镜手术方案则改善了这种情况。与传统方案不同，该方案通过采用腹腔镜间接观察患者体内的方法，成功替代了传统的大切口直接目测，并通过这种方式将原本近10厘米的切口缩减为两个2-3厘米的小型切口。随着切口长度的缩短，整个手术过程对于患者身体机能的损伤有了显著的降低，并大幅度降低了术后伤口感染的几率。腹腔镜手术松解输卵管、卵巢等组织粘连效果更佳，有助于患者术后的恢复。与此同时，患者的疼痛感也大大减轻，有助于患者保持一个良

敲除鼠的构建

如何设计条件性基因敲除小鼠模型摘要：小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF 内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个

关于子宫内膜异位症的再认识及其意义_郎景和

[收稿日期] 2009-08-08;修回日期 2009-08-14[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(39830350) [作者简介] 郎景和(1940-),男,满族,吉林珲春市人,中国医学科学院教授,研究方向为妇科肿瘤与子宫内膜异位症;E -m ai:l l angj h@hot m ai.l co m 关于子宫内膜异位症的再认识及其意义郎景和 (中国医学科学院北京协和医院,北京100730) [摘要] 子宫内膜异位症是严重影响育龄妇女健康及生育的常见病、多发病。课题组在该病的基础与临床研究过程中,形成了独到的病因学观点。即认为,内异症是由异常的子宫在位内膜组织随经血逆流至盆腹腔,在异地完成粘附、侵袭、血管形成之病理过程,而形成病灶。致病的关键系子宫在位内膜本身,而在位内膜干/祖细胞或其微环境的改变可能是根本原因。此外,内异症还表现出类肿瘤特质。上述病因学研究结果推进了临床诊疗技术和水平。近年来在位内膜标志物的检测和局部治疗更反映了源头诊疗的新观念。对内异症发病机制的再认识和新观念,直接影响了临床问题解决的新方向。[关键词] 子宫内膜异位症;发病机制;诊断;治疗 [中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1009-1742(2009)10-0137-06 子宫内膜异位症(以下简称内异症)在育龄妇女中有10%~15%的发病率,且有明显上升趋势, 有现代病之称。80%内异症患伴者有盆腔疼痛,50%合并不育,是严重影响中青年妇女健康和生活质量的多发病、常见病。但内异症发病机制复杂、病变广泛、形态多样、极具侵袭和复发性,有诸多棘手的问题亟待解决。在过去的二十余年里,课题组对内异症进行了较为深入的基础与临床研究,形成了独到的发病机制观念及普遍推行的临床诊治规范。现就对其的再认识论述如下。 1 对内异症发病机制的再认识 1885年,Von Rok itansky 首次描述该病。1921 年,Sa mpson 提出了经血逆流种植学说,成为主导理论。亦有上皮化生学说、远处转移学说、苗勒管残迹学说等,但都未臻完善。特别是经血逆流见于90%的育龄妇女,几乎是生理现象,而罹患内异症的却只有10%~15%,故Sa m pson 学说遭到质疑。对此,学者们又提出遗传、炎症、免疫、激素等因素在发病中的作用,争论不辍。课题组对内异症的病因学研究,在科学诠释、模型建立和临床循证的原则指导下逐步形成新的认识和思路。1.1 内异症发病的 3A 模式在内异症病灶的形成过程中,经血逆流种植应达到四个必须 :a .经输卵管逆流入盆腔的经血中必须含有子宫内膜组织;b .内膜碎片中的腺上皮和间质细胞必须是活的 ;c .这些细胞必须有能力种植在盆腔组织器官上;d .盆腔内异症病灶的解剖分布与经输卵管播散的方式必须一致(见图1)。而且,逆流之内膜需突破三道防线 :腹水中的炎症因子、腹腔中的免疫细胞和腹膜的细胞外基质。课题组经相关组织病理和分子生物学研究,总结出了内异症形成三步曲 :粘附、侵袭、血管形成,可将其称为 3A 程序(attachm ent-agg rassion -ang i o genesis)。粘附是异位内膜入侵盆腹腔腹膜或其他脏器表面的第一步,继而突破细胞外基质,血管形成是其种植后生长的必要条件[1] 。亦即所谓生根、生长、生病的三生过程。 3A 程序还可明晰解释及描述内异症临床病理表现,即早期的红色病变、典型黑色病变及后期白色病变。 137 2009年第11卷第10期

小鼠子宫内膜异位模型

小鼠子宫内膜异位模型子宫内膜异位症（内异症，endometriosis，EM）是指具有生长功能的子宫内膜出现并生长在子宫腔以外引起的一系列临床综合症。异位内膜类似于恶性肿瘤可累及全身任何部位，大多数位于盆、腹腔脏器表面。主要发生于生育年龄妇女，发病率高达10%-15%，逐年上升。临床主要表现为痛经及不孕，病情迁延，目前缺乏有效的根治方法，主要治疗手段仍是手术及激素治疗，但复发率高达40-50%，究其根本原因是其发病机制目前仍不清楚。 1.实验动物 SPF级BablC小鼠，健康，雌性，8-10W，体重为25g-30g 2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 2W 4.建模方法 1.随机取小鼠一只作为捐赠鼠，脱颈椎法处死，仰卧位固定于手术台，腹部酒精消毒后，沿正中线剖开腹腔。找到形子宫，小心分别牵出左、右侧子宫，细心分离双侧子宫系膜。 2.离断宫角与卵巢，在形子宫分叉分别剪断左侧及右侧子宫，放入装有生理盐水的无菌弯盘中，反复漂洗子宫表面的血迹，进一步分离剩余粘附的子宫系膜。将两个子宫角分别放置于两个无菌弯盘中，将它们直接剪成大小均等约1×1mm的碎片，并将它们悬浮于生理盐水中。 3.将捐赠鼠的子宫按1/2的比例种植于接受鼠腹腔，1只捐赠鼠内膜供应2只接受鼠，用生理盐水悬浮弯盘里的组织碎片。 4.随机取一只小鼠作为接受鼠，取脐下偏正中线处的左下腹为进针点，将溶有子宫组织碎片的生理盐水用号针头连同子宫组织块碎片注入接受鼠的腹腔，后放置于鼠笼。 5.模型评价

1.大体观察：建模后第7天处死小鼠开腹观察病灶，成活病灶表现为多种形态，呈红色、蓝色、紫红色、白色、橙色等小泡，部分与周围粘连。 2.建模后异位内膜组织学变化可见丰富的腺体及间质细胞，腺体结构正常，血管丰富。病灶图1 建模7天后大体病灶

基因敲除小鼠的PCR鉴定

基因敲除小鼠的PCR鉴定一、实验目的：通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。二、实验原理：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。三、实验操作 1.获取鼠尾组织剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min

子宫内膜异位症的临床分期及分型的进展(一)

子宫膜异位症的临床分期及分型的进展（一）疾病的分期对不同期别应采取何种治疗措施、判断与比较疗效及估计预后起着至关重要的作用。目前尚无一种完善的异症分期和分型系统来指导诊断、治疗和预后判断，尤其是其特征性的表现：疼痛和不孕。理想的临床分型方法应该基于疾病的自然史﹑病变浸润的深度﹑症状的严重性以及受累器官的最终结局，可以反映病变的严重性，指导临床治疗，预测患者的预后。人们一直试图对异症进行分期探讨，这一努力已持续了近一个世纪。目前我国多采用美国生育学会（American Fertility Society，AFS）提出的“修正子宫膜异位症分期法（r-AFS）”。该分期法于1985年最初提出，1997年再次修正。该分期法有利于评估疾病严重程度、正确选择治疗方案、准确比较和评价各种治疗方法的疗效，并有助于判断患者的预后。但仍有一些不足，理想的临床分期方法应该基于疾病的自然史、病变浸润的深度、症状的严重性以及受累器官的最终结局，可以反映病变的严重性、指导临床治疗、预测患者的预后。理想的EMs分型分期方法应该能够全面描述患者的病变围和浸润深度，反映其疼痛和不孕相关的病史，能够对其治疗方案、手术围提供参考和指导，并对患者治疗后疼痛缓解情况、生殖结局以及疾病转归具有预测意义。一、分期系统的历史回顾和分类异症很早就有基于解剖基础的分类描述，而且分类系统多样。各种分类系统参考的标准主要是：组织学类型，解剖学分布，组织病理学和疼痛程度，临床、解剖和组织病理学表现，累积的器官组织，体检及手术发现等。随着对疾病性质认识的深入，很多系统都进行了调整和改进。有些系统已经不再用于临床，但是研究者的经验、智慧和失败的教训对后来新系统的设计都具有重要价值，值得借鉴和尊重。迄今为止，学者们提出了数十种分期方案，大致以年代为序，基本上反映了人们对EMs 认识的由浅入深，由表及里，从感性到理性的上升过程。