荧光分析法基本概念教案资料

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱

一紫外吸收光谱分析

基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。

二紫外光谱的产生

物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱

分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n电子。

化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：

（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道

由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。

二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。

横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。

纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。

吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。

四、紫外光谱中常用的几个术语

1.发色基团和助色基团

发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）

助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2 , -NR2 , -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。

2．红移、蓝移、增色效应和减色效应

由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反，如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动，则称为蓝移。

由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、

分子荧光分析法

一、荧光的产生

物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态

1. 振动驰豫

这一过程只能发生在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。

2. 内转换

即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁

3. 系间窜跃

有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br 等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了

4. 磷光

经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-4～10 s，称作磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光（phosphorescence）。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动

能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。

5. 荧光

较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态

二、激发光谱和荧光光谱

荧光检测

光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。

激发光谱与荧光发射光谱的形成

任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。

1. 激发光谱

保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。

激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。

2. 荧光光谱

荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长

发射光谱与激发光谱的关系

1.发射光谱形状与激发光波长无关由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪一个电子激发态无关。

2.发射光谱比激发光谱波长为长

由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动驰豫、内转换）损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光。因此，荧光发射能量比激发光能量低，发射光谱波长比激发光波长长。

3.镜像对称

对于高度对称的有机分子，其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。

解释：能级结构相似性

荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。

激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性，因而呈镜像对称。

三、影响荧光产生及荧光强度的因素

1.物质产生荧光的必要条件

一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件：

1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有π～π*跃迁）；

2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency ）。荧光效率也称

荧光量子产率，用Φf 表示。

可见，凡是使 k F 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常，k F 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。

2.影响荧光及其强度的因素

跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。具有π—π* 跃迁的分子才有强吸收。π—π* 跃迁的ε大。

共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有共轭的π～π* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，且最大激发F f F VR IC ISC EC P

k Φk k k k k k ==+++++发射的荧光量子数吸收的光量子数

和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。

刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大。

荧光物质（荧光素） 非荧光物质（酚酞）

O -O O COO --O O

COO -

苯 萘 蒽 维生素A 205nm 286nm 356nm

327nm 278nm 321nm 404nm 510nm

0.11 0.29 0.36

芴（Ф=1.0） 联苯（Ф=0.2）

有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合

物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg 2+、Al 3+ 等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。

8-羟基喹啉 8-羟基喹啉-铝

取代基团

荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基如—NH 2、—OH 、—OCH 3、—CN 、—NHR 、—NR 2等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH 、—NO 2、—C=O 、—F 、—Cl 等吸电子取代基，可减弱分子π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如—R 、—SO 3H 、—NH 3 等。

温度

温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐

N OH N O Al /3

射跃迁增加，荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。

由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容易引起溶液温度升高，加之分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度改变。另外，有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下，还会发生光分解，使荧光强度下降。因此，试样不应长时间受光照射，只在测定荧光强度时才打开光闸，其余时间应关闭。在较高档的荧光分光光度计中，样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置，以使溶液的温度在测定过程中保持恒定。

溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。

溶剂的影响可以分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应是指溶剂极性的影响。通常情况下，随着溶剂极性增大，π～π* 跃迁所需的能量差?E减小，跃迁几率增加，从而使荧光波长长移，荧光强度增大。

一般而言，探针激发态的偶极矩大于基态偶极矩，当荧光基团被激发后，溶剂的偶极子在激发态的荧光基团的周围重新定向而降低激发态的能量，溶剂的极性越大，荧光团激发态能量降低的越多，因而从激发态跃迁回基态时发射的能量越低，发射的波长就越长

特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，使荧光峰的波长和荧光强度都发生较大变化。如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的—NH 2基逐渐被—NH 3Cl 基所代替，而—NH 3Cl 基对萘环特征频率的影响小于—NH 2，因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。

pH 值：溶液的酸度（pH 值）对荧光物质的影响可以分两个方面：

1．若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH 值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺

无荧光（离子形式） 蓝色荧光（分子形式） 无荧光（离子形式）

2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH 值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如Ga 3+离子与

3

NH -

--

邻-二羟基偶氮苯，在pH3～4的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在pH6～7的溶液中，则形成1 2的配合物，不产生荧光。总之，溶液pH值对荧光物质的荧光光谱、荧光效率及荧光强度均有影响。需通过条件实验找出pH与荧光强度的关系，确定最适宜的pH范围，以提高分析的灵敏度和准确度。

Fluorescence signaling mechanisms 荧光响应机理

1 Photoinduced electron transfer，PET

典型的光诱导电子(Photoinduced electron transfer，PET)转移体系是由包含电子给体的受体部分R(receptor)，通过间隔基S(spacer，-CH2-)和荧光团F(fluorophore)相连而构成的。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所，受体部分则用来结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。

PET mechanism

Fig．1 The principle of guest recognition by PET fluorescent molecular probe

PET荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移到激发态荧光团(还原型PET)。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光

解释

Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET

电子转移

激发分子为

电子给体

淬灭剂为

电子受体

荧光淬灭和

生成离子自由基LUMO

h

当电子给体被激发时，引入的电子受体就可作为淬灭剂，通过LUMO 轨道的电子转移，引起荧光淬灭。

Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET 当电子受体被激发时，引入的电子给体就可作为淬灭剂，通过HOMO 轨道的电子转移，引起荧光淬灭。

PET 应用到传感器上需要的条件：

一、传感器分子中要包含一个荧光团，其应具有高的量子产率；

二、还应包含电子给体（Electron Donor ），可以发生向荧光团的 PET 过程；

激发分子为电子受体淬灭剂为电子给体荧光淬灭和

生成离子自由基

LUMO

h

三、当结合目标分子（或离子）后，会引发或抑制电子给体与电子受体间的光诱导电子转移，引起荧光团荧光猝灭或荧光恢复，实现信号报告目的。

基于PET过程的阴离子识别与传感

PET

选择性识别HPO4-的荧光传感器

此分子为首例利用PET机理识别阴离子的荧光分子传感器。其以蒽为荧光团，多胺阳离子为阴离子的识别位点。在进行阴离子识别前，先对多胺进行部分质子化，残留一个自由氨基作为荧光团蒽的猝灭剂。当HPO42?的加入后，其羟基与残余氨基孤对电子结合后，阻断了PET的发生，可使蒽荧光得到恢复，表现为受体分子荧光显著增强，实现在在pH = 6 的水中选择性识别磷酸氢根离子

(HPO42? )。

PET过程被阻断选择性识别CH3COO-的荧光传感器