重组质粒的PCR实验

李笃财 201200140048 生科一班

一．实验目的

1．学习利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物；

2．掌握基因克隆的基本操作过程

3．了解利用T载体进行PCR产物克隆的基本原理

4．进一步巩固PCR扩增及电泳检测技术

二．实验原理

（一）重组质粒酶切鉴定

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。

（二）PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

1.聚合酶链式反应原理

PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

2．PCR的反应动力学

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作

准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

3．PCR扩增产物

可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即长产物片段）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

三．实验材料及仪器

1．实验材料：PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒（插入片段125bp），寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）

2.实验仪器：高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／Hind Ⅲ，DL2000

四．实验步骤

（一）重组质粒的酶切、电泳检测

1．对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。中片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（12μl体系）如下：

轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育2hr后，保存于 -20℃，备电泳检测。2. 酶切产物电泳检测

取全部酶切产物，加入3 ul 6×上样缓冲液，混匀后点样。

取重组质粒2 ul，加入1 ul 6×上样缓冲液，混匀后点样。

以λDNA/HindIII为Marker。100V恒压电泳约40min。

（二）重组质粒的PCR验证/PCR扩增目的基因

对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。

引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为Hind Ⅲ，所以选择Hind Ⅲ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。

由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的

（bp）=150+插入片段的长度。

下图所示为pUC19部分序列，即引物来源：

M13F(-47): EcoRⅠ

cgccagggttttcccagtcacgac gttgTaaaacgacggccagt gaatt c gagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcagg catgc aagctt ggcgtaatcatggtcatagctgtt tcctgtgtgaaattgttatccgctc

Hind ⅢM13R(-48)(互补链)

PCR引物为

1.反应体系的建立

除了此反应体系之外，还要做两个反应体系：其他组分不变，只需要将模板换成pUC19质粒（作为模板对照），ddH2O（作为阴性对照）。

振荡混匀，然后短暂离心。

2. 反应程序的设定

（1）预变性：让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。

（2）变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。（3）复性：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。

（4）延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下，5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。（5）终延伸：循环完成后使PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行

3. PCR产物检测：

1%的琼脂糖凝胶电泳：20ulPCR 产物中加3.0ul 10×上样缓冲液，混合均匀，取5ul 点样。以DL2000plus 为Marker 。100V 恒压电泳约40min 。

五、实验结果

小质粒酶切电泳结果图：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

从左至右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII ；第2泳道：pUC19/HindIII ；第3-16泳道：3-10组小质粒及小质粒酶切结果（本组样品在第5，6泳道），第17泳道：空，第18泳道：λDNA/HindIII

1 2 5 6

大质粒酶切结果电泳图：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

从左至右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII ；第2泳道：pUC19/HindIII; 第3-14泳道：大质粒及大质粒酶切结果（本组样品在第3，4泳道），第15，16泳道：空；;第17泳道：DL2000;第18泳道：λDNA/HindIII

1 2 3 4

PCR 电泳结果图：

5000

3000

2000

1000

750

500

250

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

第1泳道：λDNA/HindIII ；第2泳道：阴性对照ddH2O;第3泳道阳性对照pUC19；第4泳道：DL2000；第5-8泳道：PCR 样品；第9泳道：DL2000；第10泳道：阴性对照ddH2O ；第11泳道：阳性对照pUC19; 第12-16泳道：PCR 样品；第17泳道：阴性对照ddH2O ；第18泳道：阳性对照pUC19; 第19-22泳道：PCR 样品；第23泳道：DL2000；第24泳道：λDNA/HindIII （本组样品在13，14 泳道）

13 14 23

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml 的PCR管中不能均匀传热。不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。检查模板和引物的用量。增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

qPCR实验操作流程

Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不

PCR扩增原理及操作

PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，

pcr技术原理简介

PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引

QPCR原理及应用

QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR

pcr扩增的原理和步骤

PCR 扩增的原理和步骤聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产

PCR原理及过程

PCR技术原理、实验步骤和应用来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、实验试剂与器材模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL

(待分)rtpcr原理和实验步骤

原理与实验步骤一、知识背景：、基因表达：单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。、技术( )：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。、逆转录酶和逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性：、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。、水解活性：水解杂合体中的。、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。、耗材：

PCR扩增的原理和步骤

PCR扩增的原理和步骤聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在P CR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含

PCR各步骤的目的

P C R各步骤的目的 Prepared on 22 November 2020

PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。（二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。（三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taq DNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

RT-PCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。（一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。（二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有

PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。变性退火延伸图反应历程

二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序：将RAPD反应试剂加入EP管中轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

PCR技术原理模板

PCR技术原理 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖

凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其

pcr扩增的原理和步骤

pcr扩增的原理和步骤一、基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。二、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。扩展：在实践中，聚合酶链式反应（PCR）可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。

PCR技术及原理

PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理一、PCR反应成分： 1、模板DNA； 2、引物； 3、四种脱氧核糖核苷酸； 4、DNA聚合酶； 5、反应缓冲液、Mg2+等。二、PCR反应基本步骤： 1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用

总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR反应条件的选择（影响因素）温度参数： 1、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。 2、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。循环数： PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律：反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板

PCR的基本步骤及注意

（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。 PCR原理 DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。 [PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA ～2μg